本發(fā)明涉及生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種突變的msh6蛋白及其編碼基因、應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：林奇綜合征定義為由錯(cuò)配修復(fù)(mmr)基因突變引起的對結(jié)直腸癌及某些其他癌癥(如子宮內(nèi)膜癌、胃癌、腦癌等)的遺傳易感性。人體的細(xì)胞處于不斷的分裂、增生和分化過程中，而細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)dna也不斷復(fù)制并傳給子細(xì)胞。在dna復(fù)制過程中不可避免地會(huì)出錯(cuò)，使子細(xì)胞獲得錯(cuò)誤的遺傳信息。當(dāng)dna復(fù)制出錯(cuò)時(shí)，mmr基因就會(huì)表達(dá)出錯(cuò)配修復(fù)蛋白，對錯(cuò)誤復(fù)制的dna進(jìn)行“糾錯(cuò)”，保證遺傳物質(zhì)穩(wěn)定而準(zhǔn)確的傳遞。林奇綜合征患者因mmr基因突變而喪失了錯(cuò)配修復(fù)功能，基因突變率升高，完成突變累積的時(shí)間縮短，腫瘤風(fēng)險(xiǎn)極大提高。林奇綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，患者的臨床特征是結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)很高，且發(fā)病年齡較早；此外，患者子宮內(nèi)膜癌、胃癌、卵巢癌、肝膽腫瘤、尿道腫瘤、胰腺癌及小腸癌等腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)也顯著高于普通人群。四種與林奇綜合征發(fā)生密切相關(guān)的基因分別為mlh1、msh2、msh6及pms2，國際研究發(fā)現(xiàn)林奇綜合征家系中mlh1及msh2基因的突變檢出率可達(dá)85％-90％，msh6突變檢出率約為10％-15％，pms2基因的突變較少見。目前，林奇綜合征相關(guān)基因突變譜尚未完全發(fā)現(xiàn)，基因型與表型的關(guān)系也不明確。林奇綜合征是最常見的結(jié)直腸癌遺傳形式，每35例新診結(jié)直腸癌患者中即可檢出1例林奇綜合征。目前公認(rèn)的最準(zhǔn)確、最可靠的診斷林奇綜合征的方法是mmr基因突變檢測陽性結(jié)果?；驒z測在美國已有二十余年的歷史，從1994年至2005年，由于基因檢測預(yù)警及醫(yī)療水平的提高，美國家族性大腸癌的發(fā)病率降低了90％。2014年，美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(nccn)推薦新診結(jié)直腸癌患者普查林奇綜合征。為提高林奇綜合征篩查或普查的效率、準(zhǔn)確性，擴(kuò)充遺傳咨詢及健康管理的依據(jù)，本領(lǐng)域迫切需要對林奇綜合征相關(guān)基因突變譜進(jìn)行完善，對基因型及表型的關(guān)系進(jìn)行補(bǔ)充。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種突變的msh6蛋白及其編碼基因、應(yīng)用。該突變的msh6蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)可用于篩查、診斷或輔助診斷林奇綜合征。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種突變的msh6蛋白，突變的msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)該突變的msh6蛋白前195位氨基酸與野生型msh6蛋白(野生型msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示)相同，突變的msh6蛋白的第195位纈氨酸后發(fā)生移碼突變，蛋白終止于第210位。本發(fā)明還提供了一種編碼突變的msh6蛋白的基因，其核苷酸序列如seqidno:3所示。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，與編碼野生型msh6蛋白的核苷酸(編碼野生型msh6蛋白的核苷酸序列如seqidno:4所示)序列相比，編碼突變的msh6蛋白的核苷酸序列的第586位發(fā)生了t核苷酸的缺失，編碼核苷酸由4083個(gè)堿基減少到630個(gè)堿基。在本發(fā)明中，突變的msh6蛋白或其編碼核苷酸序列來源于人或非人哺乳動(dòng)物，較佳地來源于人。本發(fā)明還提供了一種篩查、診斷或輔助診斷林奇綜合征的試劑盒，該試劑盒包括：檢測氨基酸序列如seqidno:1所示msh6蛋白第196-209位氨基酸位點(diǎn)的試劑。在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，試劑為抗體。在本發(fā)明中，抗體為特異性結(jié)合于第195位纈氨酸后發(fā)生移碼的14個(gè)氨基酸(第196-209位氨基酸位點(diǎn))的多肽。本發(fā)明還提供了一種篩查、診斷或輔助診斷林奇綜合征的試劑盒，該試劑盒包括：檢測核苷酸序列如seqidno:3所示msh6基因第586位核苷酸位點(diǎn)的試劑。在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，試劑為引物對、探針或核苷酸芯片。在本發(fā)明中，引物對為可特異性擴(kuò)增出含586位堿基的核苷酸序列。優(yōu)選地，引物對擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100～1000bp。在本發(fā)明中，探針為可特異性結(jié)合于含586位缺失t的msh6基因的核苷酸片段。作為優(yōu)選，引物對的正向引物核苷酸序列如seqidno:5所示，反向引物核苷酸序列如seqidno:6所示。本發(fā)明還提供了一種非診斷目的檢測核苷酸序列如seqidno:3所示msh6基因的方法，包括：采用正向引物核苷酸序列如seqidno:5所示、反向引物核苷酸序列如seqidno:6所示的引物對擴(kuò)增樣本dna，測序。作為優(yōu)選，擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：作為優(yōu)選，擴(kuò)增的程序?yàn)椋罕景l(fā)明提供了一種突變的msh6蛋白及其編碼基因、應(yīng)用。突變的msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示；其編碼基因的核苷酸序列如seqidno:3所示。該突變在林奇綜合征患者中高度保守，利用該突變可以對林奇綜合征患者或林奇綜合征高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行篩查和診斷。附圖說明圖1為顯性林奇綜合征家系圖譜；圖2示msh6基因突變的sanger測序結(jié)果，圖2a為c.586delt的雜合突變譜，圖2b為msh6基因野生型檢測結(jié)果，圖2c為msh6基因發(fā)生c.586delt突變，導(dǎo)致讀碼框發(fā)生移碼。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種突變的msh6蛋白及其編碼基因、應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究及大規(guī)模的篩選，首次意外地發(fā)現(xiàn)一種林奇綜合征致病基因msh6基因的新突變。具體地，發(fā)明人以林奇綜合征患病家系為研究對象，對該家系中的患癌個(gè)體和未患癌個(gè)體進(jìn)行了mlh1、msh2、msh6及pms2基因的全外顯子及±10bp內(nèi)含子區(qū)域的測序和比較，意外地在msh6基因第3個(gè)外顯子中發(fā)現(xiàn)一個(gè)移碼突變(c.586delt)，該突變造成msh6蛋白的195位之后的氨基酸發(fā)生移碼，并于210位出現(xiàn)終止密碼子；發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該突變在同一家系中所導(dǎo)致的腫瘤類型及發(fā)病年齡有較大差異。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語解釋：外顯子：“外顯子”是指既存在于最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，也存在于成熟的mrna分子中的核苷酸序列。內(nèi)含子是在mrna加工過程中被剪切掉的、在成熟mrna中不存在的核苷酸序列。外顯子和內(nèi)含子都是對于基因而言的，編碼蛋白的部分為外顯子，不編碼的為內(nèi)含子。引物：“引物”指的是能與模板相互互補(bǔ)配對，在dna聚合酶的作用下合成與模板互補(bǔ)的dna鏈的寡聚核苷酸的總稱。引物“基本上”(或“大致上”)與模板上一條鏈的一段特殊的序列互補(bǔ)。引物必須與模板上的一條鏈充分互補(bǔ)才能開始延伸，但不必完全互補(bǔ)。比如，一段長29bp的引物，其中第15位核苷酸與模板不互補(bǔ)，這樣的引物仍大致上與模板互補(bǔ)。只要有足夠長的引物能與模板充分結(jié)合，非完全互補(bǔ)的引物也可以與模板形成模板-引物復(fù)合物，從而進(jìn)行擴(kuò)增。dna文庫：“dna文庫”指的是連有相應(yīng)接頭的一系列dna片段，其長度和接頭序列都適于測序儀進(jìn)行處理。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1與林奇綜合征相關(guān)的基因突變的發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，發(fā)明人對mlh1、msh2、msh6及pms2四個(gè)基因的編碼區(qū)外顯子、關(guān)鍵utr區(qū)和選擇性剪切位點(diǎn)設(shè)計(jì)多重引物序列，然后采用新一代高通量靶向重測序技術(shù)，對四代家系(家系成員情況見圖1、表1)中的三個(gè)患病個(gè)體(ⅱ-2，ⅱ-3和ⅲ-2)和兩個(gè)非患病個(gè)體(ⅲ-1，ⅳ-1)及20例無腫瘤家族史的正常人的編碼區(qū)外顯子、關(guān)鍵utr區(qū)和選擇性剪切位點(diǎn)進(jìn)行了測序。結(jié)合生物信息分析發(fā)現(xiàn)了msh6基因的c.586delt突變與林奇綜合征的發(fā)生相關(guān)。并通過正常人樣本篩選和sanger測序驗(yàn)證了這個(gè)變異。表1各家系成員所患腫瘤類型、腫瘤確診年齡信息具體步驟如下：1.樣本采集采集了林奇綜合征四代家系中3例患癌成員及2例未發(fā)生腫瘤成員的外周血樣本，并采集了20例無腫瘤家族史的正常人外周血樣本，edta抗凝，-80攝氏度保存。2.文庫制備和測序登錄ampliseq.com，提交mlh1、msh2、msh6及pms2四個(gè)基因的編碼區(qū)外顯子、關(guān)鍵utr區(qū)和選擇性剪切位點(diǎn)設(shè)計(jì)多重pcr引物，得到一套引物組合物。引物組合物包含如下引物序列：序列5(檢測msh6基因c.586delt突變的上游引物序列，見序列表中seqidno:5)：5’aaatacatttctttctaggttcaaaatcaaagg3’；序列6(檢測msh6基因c.586delt突變的下游引物序列，見序列表中seqidno:6)：5’caccctaacataaataacaactgaatgcttg3’。采用life公司ionampliseqtmlibrarykit2.0試劑對5例家系樣本和20例正常對照樣本進(jìn)行文庫制備和合并。合并后的文庫采用bioelectronseq4000測序儀進(jìn)行測序，讀長約200bp。下述方法中的步驟(c)、(d)、(f)和(g)所用試劑均是life公司生產(chǎn)的ionampliseqtmlibrarykit2.0試劑，(e)中所用接頭來自life公司生產(chǎn)的ionxpressbarcodeadaptors1-96kit試劑。(a)基因組dna的提取提取各外周血樣本的基因組dna，提取方法可參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中提供的基因組dna提取方法，也可購買商品化試劑盒，按照說明書提取。(b)基因組dna的質(zhì)控對提取的基因組dna進(jìn)行質(zhì)控，nanodrop2000分光光度計(jì)測純度，要求od260/od280在1.8～2.0之間；qubit熒光光度計(jì)測定濃度，要求濃度不低于20ng/μl，總量不低于100ng。(c)目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增用設(shè)計(jì)的mlh1、msh2、msh6及pms2四個(gè)基因的檢測panel及ionampliseqtmlibrarykit2.0文庫構(gòu)建等試劑，按照說明書配制擴(kuò)增體系，設(shè)定擴(kuò)增程序進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，富集目標(biāo)區(qū)域。(d)引物消化在pcr反應(yīng)體系中加入fupa消化液，進(jìn)行擴(kuò)增引物消化。(e)連接測序接頭按照說明書加入接頭及緩沖液，混合均勻后，向體系中加入dna連接酶，為擴(kuò)增產(chǎn)物添加特定接頭。(f)純化未擴(kuò)增的文庫孵育結(jié)束后，使用xpreagent磁珠進(jìn)行純化，去除未擴(kuò)增的dna模板、未反應(yīng)完的酶、buffer等。(g)文庫收集向洗滌并干燥后的磁珠中加入50μllowte溶液，溶解收集文庫。(h)文庫的質(zhì)控與定量純化后的文庫進(jìn)行濃度檢測和擴(kuò)增片段大小檢測。使用qubit熒光光度計(jì)粗略測定濃度，使用qpcr方法準(zhǔn)確測定濃度，文庫濃度一般在100pm-500pm之間。用agilent2100生物分析儀檢測文庫大小分布，文庫大小分布要求：片段大小在300bp左右。(i)文庫的稀釋對質(zhì)控合格的文庫進(jìn)行合并。根據(jù)qpcr定量結(jié)果將文庫稀釋至100pm，等體積合并各個(gè)文庫；根據(jù)測序儀的數(shù)據(jù)通量、目標(biāo)區(qū)域大小和每個(gè)樣本所需數(shù)據(jù)量，計(jì)算合并的文庫個(gè)數(shù)。(j)模板擴(kuò)增與測序芯片點(diǎn)制稀釋后的文庫在life公司ioncheftm儀上進(jìn)行乳液pcr、純化與濃縮。濃縮后的測序微珠由ioncheftm儀進(jìn)行芯片上樣。(k)上機(jī)測序?qū)Ⅻc(diǎn)制后的測序芯片安放到測序儀上，然后按照測序儀的操作說明設(shè)定程序進(jìn)行測序。3.數(shù)據(jù)分析采用bioelectronseq4000測序儀配套的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)torrentsuite進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的處理、分析，檢測snp和indel變異。對檢測的變異位點(diǎn)使用snpeff軟件進(jìn)行注釋，利用clinvar、bic等疾病數(shù)據(jù)庫和其他突變數(shù)據(jù)庫篩選已知的致病變異；利用人群數(shù)據(jù)庫，如dbsnp數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、esp(外顯子組測序數(shù)據(jù)庫)過濾掉已知的中性變異。同時(shí)利用正常對照樣本的測序結(jié)果對剩下的變異進(jìn)行過濾。選取患者中存在，而正常對照樣本中不存在的變異。利用sift、polyphen、mutationtaster等多款預(yù)測軟件對變異的類型及功能進(jìn)行預(yù)測。其中無義突變(nonsensevariant)、移碼突變(frameshift)、選擇性剪切變異(splicingvariant)對蛋白結(jié)構(gòu)影響較大，需尤其關(guān)注。分析發(fā)現(xiàn)3例患癌的家系樣本均存在msh6基因的c.586delt雜合突變。使用sanger測序證實(shí)了該突變的存在，且在20例正常對照樣本和2例未患癌癥的家系樣本中證實(shí)該突變不存在。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過mlh1、msh2、msh6及pms2基因的靶向重測序及生物信息分析，發(fā)現(xiàn)林奇綜合征家系的三名癌癥患者均存在msh6基因c.586delt雜合突變。通過家系內(nèi)共分離實(shí)驗(yàn)及患者的臨床表現(xiàn)與基因突變相關(guān)疾病的表型信息證明，msh6基因上c.586delt的雜合突變與遺傳性腫瘤綜合征-林奇綜合征的發(fā)生有關(guān)。編碼突變的msh6蛋白的核苷酸序列如seqidno.:3所示核苷酸序列。野生型msh6基因cdna編碼區(qū)序列見seqidno:4所示核苷酸序列。與編碼野生型msh6蛋白的核苷酸序列相比，編碼突變的msh6蛋白的核苷酸序列的第586位發(fā)生了t核苷酸的缺失。突變的msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno.:1所示。野生型msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno.:2所示。突變的msh6蛋白從195位纈氨酸(val)后發(fā)生了移碼突變，編碼蛋白終止于第210位。突變型msh6基因編碼的蛋白質(zhì)(該蛋白質(zhì)為msh6發(fā)生p.cys196valfster15突變得到的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由序列3編碼)氨基酸序列(序列表中序列1)，其中1至195位氨基酸與野生型msh6相同的序列。實(shí)施例2與林奇綜合征相關(guān)的基因突變的sanger測序驗(yàn)證分別對三個(gè)樣本中檢測到的突變進(jìn)行sanger測序驗(yàn)證。具體方法步驟如下：(1)基因組dna提取對檢測到msh6基因c.586delt突變的樣本，采用qiagenminikit從外周血中提取基因組dna。對提取的基因組dna進(jìn)行質(zhì)量控制，od260/280在1.8～2.0之間，od260/230在1.8～2.0之間。(2)引物設(shè)計(jì)及pcr反應(yīng)參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫grch37/hg19，采用primer3.0針對msh6基因的c.586delt突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表2：表2msh6基因的c.586delt突變的特異性引物(3)pcr反應(yīng)體系按表3向pcr管中加入各組分，反應(yīng)總體積20μl。表3pcr反應(yīng)體系試劑體積/每個(gè)反應(yīng)10×pcrbuffer(mg2+plus)2μldntpmixture(each10mm)0.4μltakarataq(5u/μl)0.1μl正向引物0.4μl反向引物0.4μl基因組dna100ngddh2oupto20μl(4)pcr熱循環(huán)條件將pcr管短暫離心，然后于pcr儀上按照表4中的熱循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。表4pcr擴(kuò)增程序(5)sanger測序?qū)cr產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果見圖2。圖2中a為林奇綜合征家系中患癌成員msh6基因第3個(gè)外顯子發(fā)生c.586delt的雜合突變峰，箭頭指示的位置為突變位點(diǎn)；b為林奇綜合征家系中未患癌成員第3個(gè)外顯子586位點(diǎn)野生型測序峰；c為msh6基因發(fā)生c.586delt突變，導(dǎo)致讀碼框發(fā)生移碼。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12