本發(fā)明涉及一種核酸檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，具體涉及一種用于禽流感病毒n亞型基因分型的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：禽流感病毒(avianinfluenzavirus，簡(jiǎn)稱aiv)屬于正粘病毒科的一種rna病毒。自從1997年發(fā)現(xiàn)其可以感染人類并致死以來(lái)，引起世界極大的關(guān)注。禽流感病毒的基因組由8條獨(dú)立的單股負(fù)鏈組成，分別編碼不同的蛋白質(zhì)，具有高度的重組性。其中na和ha變異性最強(qiáng)，也是劃分病毒不同亞型的依據(jù)。人感染aiv后典型癥狀特征是突發(fā)高熱、頭暈頭痛、咳嗽(通常干咳)、疲勞、食欲不振、肌肉和關(guān)節(jié)痛、嚴(yán)重身體不適，同時(shí)可伴有喉嚨痛和鼻塞、流涕、胸痛等癥狀。發(fā)熱體溫可達(dá)39～40℃，一般持續(xù)3～4天后漸退。目前禽流感病毒n亞型被分為n1-9亞型，禽流感病毒的反復(fù)感染可能就與不同亞型的存在有關(guān)。開展禽流感病毒n亞型的監(jiān)測(cè)對(duì)流行病學(xué)研究及疫苗的發(fā)展都有極其重要的意義。目前醫(yī)院診斷禽流感病毒感染的方法主要有病毒分離培養(yǎng)、免疫學(xué)診斷以及核酸檢測(cè)法。病毒分離培養(yǎng)檢測(cè)操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，需幾周才能報(bào)告結(jié)果，且敏感性低；免疫學(xué)診斷主要以金標(biāo)法和eia為主，具有快速，簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但特異性和敏感性較差；核酸檢測(cè)法是剛剛興起的最新的檢測(cè)方法，發(fā)展迅速，具有非常高的特異性和敏感性，技術(shù)操作也不復(fù)雜，可以有利于早期診斷、無(wú)癥狀病人診斷、以及病程的跟蹤。目前國(guó)內(nèi)的核酸診斷中應(yīng)用最為廣泛的是以熒光標(biāo)記探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)。檢測(cè)探針為包括5’端報(bào)告基團(tuán)和3’端淬滅基團(tuán)的寡核苷酸。當(dāng)探針完整時(shí)，由于淬滅基團(tuán)靠近報(bào)告基團(tuán)而極大降低了報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光。引物延伸時(shí)，與模板結(jié)合的探針被taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切斷，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光信號(hào)。在每次pcr循環(huán)中，都有新的報(bào)告基團(tuán)被剪切，因此熒光信號(hào)強(qiáng)度的增加與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量成正比。對(duì)于熒光pcr檢測(cè)病毒來(lái)說(shuō)，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，其直接影響檢測(cè)的特異性。如果引物的特異性不夠，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)。多重?zé)晒舛縫cr技術(shù)則是在同一反應(yīng)體系中加入多條不同熒光標(biāo)記的探針。例如，針對(duì)靶基因1的探針標(biāo)記fam，針對(duì)靶基因2的探針標(biāo)記vic，針對(duì)靶基因3的探針標(biāo)記rox。pcr反應(yīng)過(guò)程中，若待檢樣本包含靶基因1，則標(biāo)記fam的探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含靶基因2，則標(biāo)記vic的探針產(chǎn)生熒光信號(hào)；若待檢樣本包含靶基因3，則標(biāo)記rox的探針產(chǎn)生熒光信號(hào)。這樣，同一管反應(yīng)則可確定多個(gè)靶基因(如圖1所示)。現(xiàn)有的禽流感病毒n亞型基因分型檢測(cè)試劑盒大多存在特異性差、靈敏性較低無(wú)分型檢測(cè)等缺陷，有待改進(jìn)。本發(fā)明針對(duì)不同n亞型禽流感病毒的靶序列分別設(shè)計(jì)了不同引物和taqman探針，在很大程度上保證了用于檢測(cè)病毒時(shí)的結(jié)果的特異性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的禽流感病毒n亞型基因分型檢測(cè)試劑盒特異性差、靈敏性較低等缺陷，提供一種用于禽流感病毒n亞型基因分型的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，該試劑盒具有高通量、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果快速客觀等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)禽流感病毒n亞型的分型檢測(cè)具有良好的應(yīng)用前景。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：本發(fā)明的一種用于禽流感病毒n亞型基因分型的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，包括以下各組分：核酸擴(kuò)增反應(yīng)液、酶混合液、禽流感病毒n亞型反應(yīng)液a、禽流感病毒n亞型反應(yīng)液b、禽流感病毒n亞型反應(yīng)液c、陽(yáng)性對(duì)照a、陽(yáng)性對(duì)照b、陽(yáng)性對(duì)照c和空白對(duì)照；其中，所述的禽流感病毒n亞型反應(yīng)液a包含以下4組組分：組分(1)：六條分別用于檢測(cè)禽流感病毒n1-3亞型的引物；其中，六條引物的堿基序列分別為seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示；組分(2)：一條用于檢測(cè)禽流感病毒n1亞型的探針，所述探針的堿基序列為seqidno.7所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；組分(3)：一條用于檢測(cè)禽流感病毒n2亞型的探針；其中，所述探針的堿基序列為seqidno.8所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；組分(4)：一條用于檢測(cè)禽流感病毒n3亞型的探針；其中，所述探針的堿基序列為seqidno.9所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；其中，所述的禽流感病毒n亞型反應(yīng)液b包含以下4組組分：組分(1)：六條分別用于檢測(cè)禽流感病毒n4-6亞型的引物；其中，六條引物的堿基序列分別為seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14和seqidno.15所示；組分(2)：一條用于檢測(cè)禽流感病毒n4亞型的探針，所述探針的堿基序列為seqidno.16所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；組分(3)：一條用于檢測(cè)禽流感病毒n5亞型的探針；其中，所述探針的堿基序列為seqidno.17所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。組分(4)：一條用于檢測(cè)禽流感病毒n6亞型的探針；其中，所述探針的堿基序列為seqidno.18所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；其中，所述的禽流感病毒n亞型反應(yīng)液c包含以下4組組分：組分(1)：六條分別用于檢測(cè)禽流感病毒n7-9亞型的引物；其中，六條引物的堿基序列分別為seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23和seqidno.24所示；組分(2)：一條用于檢測(cè)禽流感病毒n7亞型的探針，所述探針的堿基序列為seqidno.25所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；組分(3)：一條用于檢測(cè)禽流感病毒n8亞型的探針；其中，所述探針的堿基序列為seqidno.26所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；組分(4)：一條用于檢測(cè)禽流感病毒n9亞型的探針；其中，所述探針的堿基序列為seqidno.27所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。在本發(fā)明中，用于禽流感病毒n亞型基因分型的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)引物及探針的核苷酸序列見(jiàn)表1：表1檢測(cè)禽流感病毒n亞型的引物及探針名稱序列(5′→3′)n1-fpagaccttgcttctgggttg(seqidno.1)n1-rpctacttgtcaatggtaaacgg(seqidno.2)n1-px1-tggactagtgggagcagcatatcttt-y1(seqidno.7)n2-fpttacagggtttgcacctttttct(seqidno.3)n2-rpgggcaaattgataacatttgt(seqidno.4)n2-px2-tgacaagagaaccttatgtgtcatgcga–y2(seqidno.8)n3-fpagatatgtgttgcttggtcaagtag(seqidno.5)n3-rpctccatgatttaatggagtccgtc(seqidno.6)n3-px3-agttgcttcgatggaaaggaatggat-y1(seqidno.9)n4-fpaacaatcggtagtgtcagcattgtac(seqidno.10)n4-rptgtttgagttacctgattataatggc(seqidno.11)n4-px1-acaataggactgctcctccaaataacaagc-y1(seqidno.16)n5-fpccaaatcagaaaataataacaattg(seqidno.12)n5-rpcttttgtcactgatattattcctatg(seqidno.13)n5-px2-caacatactgcttcatattgcatcaatag-y1(seqidno.17)n6-fpaaggggcaaatagaccagtaat(seqidno.14)n6-rpttggggcgacttgtatcggtta(seqidno.15)n6-px3-atgatgacccacacaagcaagtacttgtg-y1(seqidno.18)n7-fpgaatccaaatcagaaactatttgca(seqidno.19)n7-rpacagtagtgttgttttgattaatggt(seqidno.20)n7-px1-tctcaaatgtcggattgaatgtatctctaca-y1(seqidno.25)n8-fptgcttctgggttgagatgat(seqidno.21)n8-rpaagaatagctccatcgtgcca(seqidno.22)n8-px2-agtagctccattgtgatgtgtggagtaga-y1(seqidno.26)n9-fpgcaaatctagggttgaacataggac(seqidno.23)n9-rptaatagttgtttattattgtttggctt(seqidno.24)n9-px3-ctgcaattgctcacactcacaacctga-y1(seqidno.27)注：x1\x2\x3為熒光報(bào)告基團(tuán)，y1和y2為熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明對(duì)上述引物和探針的摩爾配比比例進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們之間不同的摩爾配比比例對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的特異性和靈敏性具有顯著的差異，本發(fā)明通過(guò)高通量的篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述引物和探針在下述配比下，具有最優(yōu)的檢測(cè)效果：在本發(fā)明中，優(yōu)選的，禽流感病毒n亞型反應(yīng)液a組分(1)中seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的引物序列按照摩爾比為4:4:6:6:6:6混合，禽流感病毒n亞型反應(yīng)液b組分(1)中seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14和seqidno.15，禽流感病毒n亞型反應(yīng)液c組分(1)中seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23和seqidno.24所示的引物序列均按照等摩爾配比混合。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，禽流感病毒n亞型反應(yīng)液a、b或c中組分(2)、組分(3)或組分(4)中所述的熒光報(bào)告基團(tuán)分別選自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texasred或lcred640中的任一種，且組分(2)、組分(3)或組分(4)中的熒光報(bào)告基團(tuán)不同；組分(2)、組分(3)或組分(4)中所述的熒光淬滅基團(tuán)分別選自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的任一種。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的檢測(cè)禽流感病毒n亞型反應(yīng)液a中，引物及探針的摩爾配比為：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9為4:4:6:6:6:6:3:4:3。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的檢測(cè)禽流感病毒n亞型反應(yīng)液b中，引物及探針的摩爾配比為：seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18為4:4:4:4:4:4:3:3:1.5。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的檢測(cè)禽流感病毒n亞型反應(yīng)液c中，引物及探針的摩爾配比為：seqidno.19、seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27為4:4:4:4:4:4:4:4:2。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)液包括三羥甲基氨基甲烷、氯化鉀、氯化鎂以及核苷酸混合液。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的酶混合液包括taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和rna酶抑制劑，更優(yōu)選的，所述的taq酶為熱啟動(dòng)taq酶，所述的逆轉(zhuǎn)錄酶為m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的陽(yáng)性對(duì)照a為滅活的禽流感病毒n1-3亞型的病毒培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照b為滅活的禽流感病毒n4-6亞型的病毒培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照c為滅活的禽流感病毒n7-9亞型的病毒培養(yǎng)液；所述的空白對(duì)照為去rna酶水。進(jìn)一步的，本發(fā)明還公開了以上任一項(xiàng)所述的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)禽流感病毒n亞型的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的試劑盒采用多重?zé)晒舛縫cr技術(shù)，分別設(shè)計(jì)針對(duì)禽流感病毒n亞型的特異性引物和探針，實(shí)現(xiàn)了在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)禽流感病毒n1-9亞型的目的。引物和探針的設(shè)計(jì)采用primer5.0專用軟件設(shè)計(jì)，將設(shè)計(jì)的引物和探針在ncbi的genebank進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)引物和探針的特異性。引物和探針在專業(yè)合成公司合成，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定光密度值(a260nm/a280nm在1.8-2.0之間為合格)。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的一種用于禽流感病毒n亞型基因分型的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒具有如下有益效果：1)本試劑盒操作簡(jiǎn)便且能有效防止污染，pcr熒光檢測(cè)時(shí)間(從標(biāo)本處理開始)僅為2-3小時(shí)，而且在同一反應(yīng)體系中三管實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)禽流感病毒n1-9亞型。pcr熒光檢測(cè)是全封閉操作，加入樣本抽提產(chǎn)物之后可以不再打開管蓋，減少了污染產(chǎn)生的機(jī)會(huì)。2)能夠同時(shí)檢測(cè)出禽流感病毒n1-9亞型，解決了現(xiàn)有產(chǎn)品只能單管中單獨(dú)檢測(cè)禽流感病毒n1-9亞型的問(wèn)題。本發(fā)明還具有靈敏度高、特異性好、可重復(fù)性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果快速客觀等優(yōu)點(diǎn)，在禽流感病毒n1-9亞型的臨床診斷、疾病預(yù)防監(jiān)測(cè)領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1是多重?zé)晒舛縫cr技術(shù)原理圖；圖2是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)樣本的曲線圖；圖3是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n1亞型的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n2亞型的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n3亞型的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖；圖6是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n4亞型的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖；圖7是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n5亞型的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖；圖8是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n6亞型的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖；圖9是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n7亞型的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖；圖10是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n8亞型的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖；圖11是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n9亞型的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖；圖12是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n1亞型的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；圖13是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n2亞型的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；圖14是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n3亞型的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；圖15是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n4亞型的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；圖16是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n5亞型的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；圖17是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n6亞型的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；圖18是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n7亞型的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；圖19是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n8亞型的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；圖20是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)禽流感病毒n9亞型的特異性試驗(yàn)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。以下實(shí)施例與試驗(yàn)例中所用試劑均為市售。實(shí)施例1一種快速檢測(cè)禽流感病毒n亞型的核酸分型檢測(cè)試劑盒的制備所述試劑盒包括核酸擴(kuò)增反應(yīng)液、酶混合液、禽流感病毒n亞型反應(yīng)液a、禽流感病毒n亞型反應(yīng)液b、禽流感病毒n亞型反應(yīng)液c、陽(yáng)性對(duì)照a、陽(yáng)性對(duì)照b、陽(yáng)性對(duì)照c和空白對(duì)照；其中，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液包括三羥甲基氨基甲烷、氯化鉀、氯化鎂、核苷酸混合液；禽流感病毒n亞型反應(yīng)液a包含以下組分：組分(1)：由六條檢測(cè)禽流感病毒n1-3亞型的引物組成；其中，六條引物的堿基序列分別為seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示；檢測(cè)呼禽流感病毒n1-3亞型的引物濃度為：seqidno.1為400nm(nmol/l)，seqidno.2為400nm，seqidno.3為600nm，seqidno.4為600nm，seqidno.5為600nm，seqidno.6為600nm；組分(2)：由一條檢測(cè)禽流感病毒n1的探針組成，探針的堿基序列為seqidno.7所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)vic，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq1；探針seqidno.7的濃度為300nm；組分(3)：由一條檢測(cè)禽流感病毒n2的探針組成；探針的堿基序列為seqidno.8所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)fam，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq1；探針seqidno.5的濃度為為400nm。組分(4)：由一條檢測(cè)禽流感病毒n3的探針組成；探針的堿基序列為seqidno.9所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)rox，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq2；探針seqidno.5的濃度為為300nm。禽流感病毒n亞型反應(yīng)液b包含以下組分：組分(1)：由六條檢測(cè)禽流感病毒n4-6亞型的引物組成；其中，六條引物的堿基序列分別為seqidno.10、seqidno.11和seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14和seqidno.15所示；檢測(cè)呼禽流感病毒n4-6亞型的引物濃度為：seqidno.10為400nm(nmol/l)，seqidno.11為400nm，seqidno.12為400nm，seqidno.13為400nm，seqidno.14為400nm，seqidno.15為400nm；組分(2)：由一條檢測(cè)禽流感病毒n4的探針組成，探針的堿基序列為seqidno.16所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)fam，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq1；探針seqidno.16的濃度為300nm；組分(3)：由一條檢測(cè)禽流感病毒n5的探針組成；探針的堿基序列為seqidno.17所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)vic，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq1；探針seqidno.17的濃度為為300nm。組分(4)：由一條檢測(cè)禽流感病毒n6的探針組成；探針的堿基序列為seqidno.18所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)rox，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq2；探針seqidno.18的濃度為為150nm。禽流感病毒n亞型反應(yīng)液c包含以下組分：組分(1)：由六條檢測(cè)禽流感病毒n7-9亞型的引物組成；其中，六條引物的堿基序列分別為seqidno.19、seqidno.20和seqidno.21、seqidno.22、seqidno.23和seqidno.24所示；檢測(cè)呼禽流感病毒n7-9亞型的引物濃度為：seqidno.19為400nm(nmol/l)，seqidno.20為400nm，seqidno.21為400nm，seqidno.22為400nm，seqidno.23為400nm，seqidno.24為400nm；組分(2)：由一條檢測(cè)禽流感病毒n7的探針組成，探針的堿基序列為seqidno.25所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)vic，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq1；探針seqidno.25的濃度為400nm；組分(3)：由一條檢測(cè)禽流感病毒n5的探針組成；探針的堿基序列為seqidno.26所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)rox，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq1；探針seqidno.26的濃度為為200nm。組分(4)：由一條檢測(cè)禽流感病毒n6的探針組成；探針的堿基序列為seqidno.27所示，該探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)fam，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq2；探針seqidno.27的濃度為為200nm。禽流感病毒n亞型反應(yīng)液用去rna酶水配制。酶混合液包括taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和rna酶抑制劑，其中，taq酶為熱啟動(dòng)taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶為m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶。陽(yáng)性對(duì)照a為滅活的禽流感病毒n1-3亞型的病毒培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照b為滅活的禽流感病毒n4-6亞型的病毒培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照c為滅活的禽流感病毒n7-9亞型的病毒培養(yǎng)液；所述的空白對(duì)照為去rna酶水。實(shí)施例2本發(fā)明的試劑盒禽流感病毒n亞型基因分型中的應(yīng)用1、提取樣本rna1.1取200ul臨床樣品，加入400ul添加了poly(a)的bindingbuffer，充分混勻后轉(zhuǎn)入高純化過(guò)濾管，8000rmp離心15s，棄去收集管中的廢液。1.2加入500ulinhibitorremovalbuffer至過(guò)濾管，8000rmp離心1min，棄去收集管中的廢液。1.3加入450ulwashingbuffer至過(guò)濾管，8000rmp離心1min，棄去收集管中的廢液。1.4重復(fù)步驟1.3，然后高速離心10s，此步驟務(wù)必將廢液去除干凈。1.5加入50ulelutionbuffer至過(guò)濾管中，室溫靜置2min，8000rmp離心1min，離心所得溶液即為純化的rna。2、在每個(gè)pcr反應(yīng)管放入組分如表2中所示的禽流感病毒n亞型檢測(cè)試劑(實(shí)施例1制備)和rna樣本：表2反應(yīng)液組分加量(ul)/1人份核酸擴(kuò)增反應(yīng)液7.5酶混合液5禽流感病毒n亞型反應(yīng)液4去rna酶水(陰性參考品)3.5rna樣本5總體積253、在熒光定量pcr擴(kuò)增儀中擴(kuò)增，按照下列程序進(jìn)行pcr擴(kuò)增：50℃30min95℃5min4、擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)熒光曲線判斷是否感染禽流感病毒n1-9亞型。擴(kuò)增曲線如圖2所示。結(jié)果判定：在a管內(nèi)fam通道內(nèi)熒光曲線呈“s”型曲線且ct≤35.3，判斷為禽流感病毒n2亞型陽(yáng)性；無(wú)典型“s”型擴(kuò)增或ct>35.3判斷為禽流感病毒n2亞型陰性。在vic通道內(nèi)熒光曲線呈“s”型曲線且ct≤35.0，判斷為禽流感病毒n1亞型陽(yáng)性；無(wú)典型“s”型擴(kuò)增或ct>35.0，判斷為禽流感病毒n1亞型陰性；在rox通道內(nèi)熒光曲線呈“s”型曲線且ct≤35.1，判斷為禽流感病毒n3亞型陽(yáng)性；無(wú)典型“s”型擴(kuò)增或ct>35.1，判斷為禽流感病毒n3亞型陰性。在b管內(nèi)fam通道內(nèi)熒光曲線呈“s”型曲線且ct≤35.0，判斷為禽流感病毒n4亞型陽(yáng)性；無(wú)典型“s”型擴(kuò)增或ct>35.0判斷為禽流感病毒n4亞型陰性。在vic通道內(nèi)熒光曲線呈“s”型曲線且ct≤35.0，判斷為禽流感病毒n5亞型陽(yáng)性；無(wú)典型“s”型擴(kuò)增或ct>35.0，判斷為禽流感病毒n5亞型陰性；在rox通道內(nèi)熒光曲線呈“s”型曲線且ct≤35.3，判斷為禽流感病毒n6亞型陽(yáng)性；無(wú)典型“s”型擴(kuò)增或ct>35.3，判斷為禽流感病毒n6亞型陰性。在c管內(nèi)fam通道內(nèi)熒光曲線呈“s”型曲線且ct≤35.5，判斷為禽流感病毒n9亞型陽(yáng)性；無(wú)典型“s”型擴(kuò)增或ct>35.5判斷為禽流感病毒n9亞型陰性。在vic通道內(nèi)熒光曲線呈“s”型曲線且ct≤35.0，判斷為禽流感病毒n7亞型陽(yáng)性；無(wú)典型“s”型擴(kuò)增或ct>35.0，判斷為禽流感病毒n7亞型陰性；在rox通道內(nèi)熒光曲線呈“s”型曲線且ct≤35.2，判斷為禽流感病毒n8亞型陽(yáng)性；無(wú)典型“s”型擴(kuò)增或ct>35.2，判斷為禽流感病毒n8亞型陰性。15個(gè)臨床樣本具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。表315個(gè)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)例1本發(fā)明試劑盒的靈敏性試驗(yàn)陽(yáng)性參考品為滅活的禽流感病毒n1-9亞型病毒培養(yǎng)液。分別將含有5×104tcid50/ml禽流感病毒n1-9亞型培養(yǎng)液的核酸提取液按照稀釋濃度為5×104、5×103、5×102、50、10、1tcid50/ml六個(gè)濃度進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。陰性參考品分別為乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠狀病毒、a組乙型鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌的病毒培養(yǎng)液。采用本發(fā)明試劑盒(實(shí)施例1制備)按照實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒具有良好的靈敏性，并且ct值隨濃度減少呈梯度改變，結(jié)果見(jiàn)圖3-11。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒對(duì)于禽流感病毒n1-9亞型的診斷具有高度的靈敏性。其中，對(duì)禽流感病毒n1亞型的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到1tcid50/ml，對(duì)禽流感病毒n2亞型的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到1tcid50/ml，對(duì)禽流感病毒n3亞型的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到5tcid50/ml，對(duì)禽流感病毒n4亞型的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到5tcid50/ml，對(duì)禽流感病毒n5亞型的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到1tcid50/ml，對(duì)禽流感病毒n6亞型的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到5tcid50/ml，對(duì)禽流感病毒n7亞型的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到5tcid50/ml，對(duì)禽流感病毒n8亞型的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到1tcid50/ml，對(duì)禽流感病毒n9亞型的檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到1tcid50/ml，。試驗(yàn)例3本發(fā)明試劑盒的特異性試驗(yàn)用本發(fā)明禽流感病毒n1-9亞型檢測(cè)試劑盒(實(shí)施例1制備)檢測(cè)禽流感病毒n1-9亞型、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠狀病毒等。檢測(cè)結(jié)果表明：a管fam通道僅對(duì)禽流感病毒n2亞型進(jìn)行擴(kuò)增，vic通道僅對(duì)禽流感病毒n1亞型進(jìn)行擴(kuò)增，rox通道僅對(duì)禽流感病毒n3亞型進(jìn)行擴(kuò)增。b管fam通道僅對(duì)禽流感病毒n4亞型進(jìn)行擴(kuò)增，vic通道僅對(duì)禽流感病毒n5亞型進(jìn)行擴(kuò)增，rox通道僅對(duì)禽流感病毒n6亞型進(jìn)行擴(kuò)增。c管fam通道僅對(duì)禽流感病毒n9亞型進(jìn)行擴(kuò)增，vic通道僅對(duì)禽流感病毒n7亞型進(jìn)行擴(kuò)增，rox通道僅對(duì)禽流感病毒n8亞型進(jìn)行擴(kuò)增。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明檢測(cè)試劑盒能特異性擴(kuò)增禽流感病毒n1-9亞型，而不與其它病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖12-圖20。當(dāng)前第1頁(yè)12