本技術(shù)領(lǐng)域涉及植物育種和遺傳學(xué)，特別是涉及用于調(diào)控植物開花期和/或抽穗期的重組dna構(gòu)建體和調(diào)控植物開花期和/或抽穗期的方法。

發(fā)明背景

植物的生長周期通常包括營養(yǎng)生長期和生殖生長期，從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變受到多種開花信號的影響，而開花信號受到諸如基因型的遺傳因子和諸如光周期和光強(qiáng)度的環(huán)境因子等多種因素的影響(dung等，theoreticalandappliedgenetics,97：714-720(1998))。

開花期或抽穗期是重要的農(nóng)業(yè)性狀，是植物分布和地域適應(yīng)性的重要決定因素。大部分被子植物品種響應(yīng)諸如日照長度和溫度等環(huán)境刺激和包括發(fā)育時期在內(nèi)的內(nèi)部信號的誘導(dǎo)開花。

從遺傳的角度來看，植物中存在兩種表型變化，控制營養(yǎng)生長和成花生長。第一種遺傳改變包括從營養(yǎng)到成花狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，如果這種遺傳改變不能正常發(fā)揮作用，那么將不會出現(xiàn)開花；第二個遺傳事件是形成花。植物器官的順序發(fā)育的觀察表明存在一個遺傳機(jī)制調(diào)控一系列基因依次被的開啟和關(guān)閉。

兩個遠(yuǎn)親雙子葉植物擬南芥和金魚草屬植物研究，鑒定了三類同源異型基因，單獨或聯(lián)合決定花器官特征(bowman等,development，112：1(1991)；carpenter和coen，genesdevl.，4：1483(1990)；schwarz-sommer等，science，250：931(1990))，其中的一些基因是轉(zhuǎn)錄因子，其保守dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域被指定為mads盒(schwarz-sommer等，supra)。

控制花分生組織特征的早期活性基因也被分析確定。在擬南芥和金魚草屬植物中，花分生組織源于花序分生組織?？刂品稚M織細(xì)胞發(fā)育成花的兩個因子是已知的，擬南芥中為leafy基因的產(chǎn)物(weige等，cell69：843(1992))和apetala1基因的產(chǎn)物(mandel等，nature360：273(1992))。當(dāng)其中任何一個基因被突變失活時，花或花序的結(jié)構(gòu)特征發(fā)生改變(weigel，etal.，supra；irish和sussex，plantcell,2：741(1990))。在金魚草屬植物中，與擬南芥leafy基因同源的基因為floricaula(coen等，cell，63：1311(1990))和apetala1基因的同源基因squamosa(huijser等，emboj.，11：1239(1992))。后兩個因子包含mads盒結(jié)構(gòu)域。

有效的開花在植物中是很重要的，尤其是當(dāng)預(yù)期的產(chǎn)品是花或由此產(chǎn)生的種子時。促進(jìn)或延緩開花的起始對農(nóng)民或種子生產(chǎn)者是有用的，理解影響開花的遺傳機(jī)制為改變目標(biāo)植物開花特征提供了方法。多種植物中開花對作物生產(chǎn)非常重要，基本上所有農(nóng)作物都是種子長成的，谷物是重要的例子，水稻和玉米是溫帶氣候區(qū)最重要農(nóng)藝作物，小麥、大麥、燕麥和黑麥?zhǔn)菧貛夂騾^(qū)的重要農(nóng)作物。重要的種子產(chǎn)品是含油種子蕓苔、加拿大油菜、糖用甜菜、玉米、向日葵、大豆和高粱?？刂崎_花時間在園藝中很重要，開花時間可以控制的園藝作物包括萵苣、菊苣和包括卷心菜、花椰菜和菜花的蔬菜蕓苔，和康乃馨和天竺葵。

發(fā)明概述

一方面，本發(fā)明包括一個分離的調(diào)控植物開花時間的多核苷酸，其包括：(a)一種多核苷酸，其核苷酸序列與seqidno：2和5的序列一致性至少為85％；(b)一種多核苷酸，其核苷酸序列與seqidno：3和6的序列一致性至少為85％；(c)一種多核苷酸，其編碼的多肽的氨基酸序列與seqidno：4或7的序列一致性至少為90％；或(d)(a)、(b)或(c)核苷酸序列的全長互補(bǔ)序列，其中在植物中，過量表達(dá)所述的多核苷酸促進(jìn)營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，降低所述多核苷酸的表達(dá)量延長營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變時間。核苷酸序列包括其包括seqidno：2、seqidno：3、seqidno：5或seqidno：6的核苷酸序列。多肽的氨基酸序列包括seqidno：4或seqidno：7。

另一方面，本發(fā)明包括重組dna構(gòu)建體，其包含分離的多核苷酸和與之可操作連接的至少一個調(diào)控序列，其中所述多核苷酸包含(a)一種多核苷酸，其核苷酸序列與seqidno：2、3、5或6一致性至少為85％；(b)一種多核苷酸，其編碼的多肽的氨基酸序列與seqidno：4或7的序列一致性至少為90％；或(c)(a)或(b)核酸序列的全長互補(bǔ)序列；至少一個調(diào)控序列是植物中有功能的啟動子。

另一方面，本發(fā)明包括含有重組dna構(gòu)建體的植物或種子，其中所述重組dna構(gòu)建體包含一個多核苷酸序列和與之可操作連接的至少一個調(diào)控序列，所述多核苷酸包含(a)一種多核苷酸，其核苷酸序列與seqidno：2、3、5或6的序列一致性至少為85％；(b)一種多核苷酸，其編碼的多肽的氨基酸序列與seqidno：4或7的序列一致性至少為90％；或者(c)(a)或(b)核苷酸序列的全長互補(bǔ)序列。

另一方面，本發(fā)明包含在其基因組中含有重組dna構(gòu)建體的植物，所述重組dna構(gòu)建體包含一個多核苷酸和與之相連的可操作連接的至少一個調(diào)控元件，其中，所述多核苷酸包含(a)一種多核苷酸，其核苷酸序列與seqidno：2、3、5或6的序列一致性至少為85％；(b)一種多核苷酸，其編碼的多肽的氨基酸序列與seqidno：4或7的序列一致性至少為90％；或者(c)(a)或(b)核苷酸序列的全長互補(bǔ)序列，其中與對照植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物顯示改變的開花時間，在所述植物中過量表達(dá)所述多核苷酸促進(jìn)營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，降低所述多核苷酸的表達(dá)延長營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變時間。

另一方面，本發(fā)明包括本發(fā)明公開的任意植物，其中植物選自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麥、苜蓿、棉花、大麥、栗、甘蔗和柳枝稷。

另一方面，本發(fā)明還公開了調(diào)控植物開花時間的方法，其包含：(a)將重組dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)入可再生植物細(xì)胞，所述重組dna構(gòu)建體包含與至少一個調(diào)控序列可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列與seqidno：4或7相比序列一致性至少為80％；(b)由步驟(a)后的可再生細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組dna構(gòu)建體；和(c)由步驟(b)的轉(zhuǎn)基因植物獲得子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組dna構(gòu)建體；與不含有重組dna構(gòu)建體的對照植物相比，所述子代植物顯示改變的開花時間。在所述植物中，過量表達(dá)所述多核苷酸促進(jìn)植物營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變；降低所述多核苷酸的表達(dá)延長營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的時間。

另一方面，本發(fā)明涉及一個重組dna構(gòu)建體，其包含本發(fā)明中任意分離的多聚核苷酸，并與至少一個調(diào)控序列可操作連接；以及包含重組dna構(gòu)建體的細(xì)胞、植物和種子。所述細(xì)胞包括真核細(xì)胞，如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞；或原核細(xì)胞，如細(xì)菌。

附圖簡述和序列表

根據(jù)以下的發(fā)明詳述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的發(fā)明詳述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。

圖1為實時pcr分析測定的不同轉(zhuǎn)基因株系葉片中osmbd1基因的相對表達(dá)水平。zh11-tc葉片中基因的表達(dá)水平設(shè)置為1.00，每個轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量柱上面的數(shù)字表示與zh11-tc相比的變化倍數(shù)。zh11-tc為組織培養(yǎng)獲得的zh11，zh11-wt是野生型中花11，dp0158代表轉(zhuǎn)空載體dp0158的zh11。

圖2為實時pcr分析測定的不同轉(zhuǎn)基因株系葉片中osusp1基因的相對表達(dá)水平。zh11-tc葉片中基因的表達(dá)水平設(shè)置為1.00，每個轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量柱上面的數(shù)字表示與zh11-tc相比的變化倍數(shù)。zh11-tc為組織培養(yǎng)獲得的zh11，zh11-wt是野生型中花11，dp0158代表轉(zhuǎn)空載體dp0158的zh11。

圖3為干旱試驗中寧夏田間土壤體積含水量在osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻不同發(fā)育時期的變化。osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在斷水后20天開始抽穗，zh11-tc水稻在斷水后43天開始抽穗。

圖4為干旱試驗中寧夏田間土壤體積含水量在osusp1轉(zhuǎn)基因水稻不同發(fā)育時期的變化。osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在斷水后22天開始抽穗，zh11-tc水稻在斷水后43天開始抽穗。

表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列編號

表2.克隆水稻花期調(diào)控基因的引物

表3.pcr反應(yīng)混合液

表4.克隆水稻花期調(diào)控基因的pcr循環(huán)狀況

表5.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第一次北京驗證)

表6.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上產(chǎn)量分析(第一次北京驗證)

表7.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上植株高度分析(第一次北京驗證)

表8.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上有效穗數(shù)分析(第一次北京驗證)

表9.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在海南的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

表10.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第二次北京驗證)

表11.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在寧夏的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

表12.t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在海南的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

表13.t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第一次試驗)

表14.t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第二次試驗)

表15.t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在寧夏的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

表16.osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在田間干旱條件下的產(chǎn)量分析

表17.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第一次北京驗證)

表18.t1代osusp11轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上產(chǎn)量分析(第一次北京驗證)

表19.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上植株高度分析(第一次北京驗證)

表20.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上有效穗數(shù)分析(第一次北京驗證)

表21.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在海南的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

表22.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第二次北京驗證)

表23.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在寧夏的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

表24.t2代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在海南的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

表25.t2代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第一次試驗)

表26.t2代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第二次試驗)

表27.t2代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在寧夏的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

表28.osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在田間干旱條件下的產(chǎn)量分析

表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列編號

序列描述以及關(guān)聯(lián)的序列表遵循如37c.f.r.§1.821-1.825中所列出的管理專利申請中的核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)則。序列表包含核苷酸序列字符的單字母碼以及氨基酸的三字母碼，如遵照iupac-iubmb標(biāo)準(zhǔn)所定義的，該標(biāo)準(zhǔn)在nucleicacidsres.13：3021-3030(1985)以及在biochemicalj.219(no.2)：345-373(1984)中有所描述，這兩篇文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循37c.f.r.§1.822中列出的規(guī)則。

seqidno：1為dp0158載體的核苷酸序列。

seqidno：2為osmbd1基因cdna的核苷酸序列。

seqidno：3為osmbd1基因cds的核苷酸序列。

seqidno：4為osmbd1蛋白的氨基酸序列。

seqidno：5為osusp1基因cdna的核苷酸序列。

seqidno：6為osusp1基因cds的核苷酸序列。

seqidno：7為osusp1蛋白的氨基酸序列。

seqidno：8為克隆osmbd1基因cdna的正向引物。

seqidno：9為克隆osmbd1基因cdna的反向引物。

seqidno：10為克隆osusp1基因cdna的正向引物。

seqidno：11為克隆osusp1基因cdna的反向引物。

seqidno：12為osmbd1基因?qū)崟rrt-pcr分析的正向引物。

seqidno：13為osmbd1基因?qū)崟rrt-pcr分析的反向引物。

seqidno：14為osusp1基因?qū)崟rrt-pcr分析的正向引物。

seqidno：15為osusp1基因?qū)崟rrt-pcr分析的反向引物。

詳細(xì)說明

本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容的全文均以引用的方式并入本文。

如本文所用的并在所附權(quán)利要求書中的單數(shù)形式“一個”和“所述”包括復(fù)數(shù)涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵義包括多株該類植物。“一個細(xì)胞”的涵義包括一個或多個細(xì)胞及其本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的等同物，等等。

如本文所述：

“osmbd1”是甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白(methyl-bindingdomainprotein，mbd)，涉及水稻基因位點loc_os05g33550.1編碼的能夠調(diào)控水稻開花性狀的多肽。“mbd1多肽”此處涉及osmbd1多肽和源于其他植物的同源物。

osmbd1多肽(seqidno:4)是水稻基因位點loc_os05g33550.1的編碼序列(cds)(seqidno:3)或核酸序列(seqidno:2)編碼的氨基酸序列。tigr(theinternetatplantbiologymsu.edu/index.shtml)中，該多肽的注釋為“甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白mbd，推測，表達(dá)”，但是沒有在先的功能介紹。

“osusp1(普遍脅迫蛋白1)”指水稻基因位點loc_os07g36600.1編碼的調(diào)控水稻開花特征的水稻多肽。“usp1多肽”此處指osusp1多肽和源于其他植物的同源物。

osusp1多肽(seqidno:7)是水稻基因位點loc_os07g36600.1的編碼序列(cds)(seqidno:6)或核酸序列(seqidno:5)編碼的氨基酸序列)。tigr中，該多肽的注釋為“含有普遍脅迫蛋白的蛋白，推測，表達(dá)”，然而沒有在先的功能介紹。

本發(fā)明中的單子葉植物包括禾本科的植物；雙子葉植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。

“開花”指開花的過程，即在適宜的溫度和濕度下，穎殼開裂，花藥散射，或花的形成過程。此處開花用于表示從幼穗分化、成熟到幼穗抽出的過程。

“花發(fā)育”的意思是指從花分生組織開始到發(fā)育成熟花的花或花序的發(fā)育。

“生殖發(fā)育”的意思是指從花分生組織開始經(jīng)過授粉到果實成熟的花或花序發(fā)育過程。

此處“早開花”的植物指開花早于對照的植物，因此這個詞指的是顯示開花起始較早的植物。植物的開花時間指播種到第一個花序出現(xiàn)的天數(shù)，例如，植物的“開花時間”可以使用wo2007/093444中描述的方法確定。

“抽穗”此處指禾谷類作物發(fā)育完全的幼穗從劍葉鞘內(nèi)伸出的時期或狀態(tài)。

“抽穗期”和“抽穗時間”本文可互換使用，指從種子播種50％幼穗從水稻植株劍葉鞘抽出的天數(shù)。抽穗期是重要的農(nóng)業(yè)性狀，由基本的營養(yǎng)基因和光周期敏感基因調(diào)控，在水稻品種的適應(yīng)性和地理分布起關(guān)鍵的作用。適當(dāng)?shù)某樗肫谑谦@得理想產(chǎn)量的前提。

通常情況下，水稻穗抽出后即開花，因此本文抽穗期也用于表示開花期。

“植株高度”本文指從地面到單株植株最高穗或葉頂部的高度。

“全長互補(bǔ)序列”是指給定核苷酸序列的互補(bǔ)序列，互補(bǔ)序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸數(shù)，并且100％的互補(bǔ)。

“表達(dá)序列標(biāo)簽”(“est”)是得自cdna文庫的dna序列，并且因此是已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄的序列。est通常通過cdna插入序列單程測序獲取。將完整的cdna插入序列稱為“全長插入序列”(“fis”)?！爸丿B群”序列是由選自但不限于est、fis和pcr序列的兩個或更多個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為“完全基因序列”(“cgs”)，該序列可得自fis或重疊群。

“轉(zhuǎn)基因的”指其基因組因異源核酸(如重組dna構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過有性雜交或無性生殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。

“對照”、“對照植物”或“對照植物細(xì)胞”為測定受測試植物或植物細(xì)胞的表型變化提供參考，由于轉(zhuǎn)化，受測植物或植物細(xì)胞的基因組改變影響到目的基因，測試的植物或植物細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的子代。

對照植物或?qū)φ罩参锛?xì)胞包括，例如：(a)用于基因改變產(chǎn)生受測植物或細(xì)胞的野生型植物或細(xì)胞；(b)相同基因組作為起始材料但是轉(zhuǎn)入空載體(如帶有標(biāo)記基因的并對目標(biāo)的性狀沒有影響的載體)的植物或植物細(xì)胞；(c)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞性狀分離，獲得的非轉(zhuǎn)基因的子代植物或植物細(xì)胞；(d)沒有暴露于可以誘導(dǎo)基因表達(dá)的條件或刺激下的，與轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞基因組相同的植物或植物細(xì)胞；(e)特定的目標(biāo)基因不表達(dá)情況下的，轉(zhuǎn)基因植物或者植物細(xì)胞本身。

本文中，zh11-wt、zh11-tc和空載體植物指對照植物。zh11-wt代表野生型中花11，zh11-tc代表通過組織培養(yǎng)中花11獲得的水稻植株，空載體代表轉(zhuǎn)化空載dp0158獲得水稻植株。

“基因組”在用于植物細(xì)胞時不僅涵蓋存在于細(xì)胞核中的染色體dna，而且還包括存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組分(如線粒體、質(zhì)粒)中的細(xì)胞器dna。

“植物”包括整個植株、植物器官、植物組織、種子和植物細(xì)胞以及同一植株的子代。植物細(xì)胞包括但不限于得自下列物質(zhì)的細(xì)胞：種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后續(xù)世代。

“轉(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸能夠穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組中，并遺傳連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨地或作為重組dna構(gòu)建體的部分整合進(jìn)基因組中。t0植物直接源于轉(zhuǎn)化和再生過程，t0植物的子代為t1代(第一個子代)，t2代(第二個子代)等。

針對序列而言的“異源”意指來自外來物種的序列，或者如果來自相同物種，則指通過蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用并且是任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈rna或dna聚合物。核苷酸(通常以它們的5′-單磷酸形式存在)通過如下它們的單個字母名稱來指代：“a”為腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對應(yīng)rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“g”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脫氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”還可包括修飾形式，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的γ羧化、羥化和adp-核糖基化。

“信使rna(mrna)”指無內(nèi)含子并且可通過細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的rna。

“cdna”指與mrna模板互補(bǔ)并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mrna模板合成的dna。cdna可為單鏈的或者可用dna聚合成酶i的klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。

“成熟”蛋白質(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)去除了存在于初級翻譯產(chǎn)物中的任何前肽或原肽的多肽。

“前體”蛋白質(zhì)指mrna的翻譯初級產(chǎn)物；即帶有前肽和原肽的蛋白質(zhì)。前肽和原肽可為并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號。

“分離的”指物質(zhì)，例如核酸和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說是該物質(zhì)被從所述組分移出。分離的多核苷酸可從它們天然存在的宿主細(xì)胞中純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。

“重組體”指(例如)通過化學(xué)合成或者通過用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸片段來實現(xiàn)的兩個原本分離的序列片段的人工組合?！爸亟M體”也包括指已經(jīng)通過引入異源核酸而進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事件(如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)對細(xì)胞或載體的改變，例如沒有蓄意人為干擾而發(fā)生的那些。

“非基因組核酸序列”、“非基因組核酸分子”或“非基因組多核苷酸”指與天然或基因組核酸序列相比，存在一處或多處核酸序列改變的核酸分子。在某些實施方案中，天然或基因組核酸分子的改變包括但不限于：由于遺傳密碼的簡并性而產(chǎn)生的核酸序列變化；植物表達(dá)的核酸序列密碼子優(yōu)化；與天然或基因組序列相比，至少一個氨基酸的替代、插入、刪除和/或添加而引起的核酸序列的變化；與基因組核酸序列相連的一個或多個內(nèi)含子的移除；一個或多個異源內(nèi)含子的插入；與基因組核酸序列相連一個或多個上游或下游調(diào)控區(qū)域的刪除，一個或多個異源上游或下游調(diào)控區(qū)域的插入；與基因組核酸序列相連的5’和/或3’非翻譯區(qū)的刪除；一個異源5’和/或3’非翻譯區(qū)的插入；和多聚腺苷酸位點的修飾。在一些實施方案中，非基因組核酸分子是cdna。在一些實施方案中，非基因組核酸分子為合成的核酸序列。

“重組dna構(gòu)建體”指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此，重組dna構(gòu)建體可包含源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來源但以不同于通常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。

術(shù)語“入門克隆”和“入門載體”本文可互換使用。

“調(diào)控序列”和“調(diào)控元件”可互換使用，指位于編碼序列的上游(5′非編碼序列)、中間或下游(3′非編碼序列)，并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、rna加工或穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。

“啟動子”指能夠控制另一核酸片段轉(zhuǎn)錄的核酸片段。

“植物啟動子功能”是能夠控制植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，無論其是否來源于植物細(xì)胞。

“組織特異性啟動子”和“組織優(yōu)選啟動子”可互換使用，并且指主要但非必須專一地在一種組織或器官中表達(dá)，而是也可在一種特定細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。

“發(fā)育調(diào)控啟動子”指其活性由發(fā)育事件決定的啟動子。

術(shù)語“可操作地連接”指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個核酸片段的功能受到另一個核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動子能夠調(diào)節(jié)核酸片段的轉(zhuǎn)錄時，該啟動子與該核酸片段進(jìn)行了可操作地連接。

“表達(dá)”指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。例如，核酸片段的表達(dá)可指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(如轉(zhuǎn)錄生成mrna或功能rna)和/或rna翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。

“表型”意指細(xì)胞或生物體的可檢測的特征。

有關(guān)將核酸片段(例如重組dna構(gòu)建體)插入細(xì)胞內(nèi)的“導(dǎo)入”是指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體dna)內(nèi)，轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mrna)。

“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”是將核酸片段(如重組dna構(gòu)建體)導(dǎo)入其中的任何細(xì)胞。

本文所用的“轉(zhuǎn)化”指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化兩者。

“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”指將核酸片段導(dǎo)入宿主生物體的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。一旦穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸片段穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主生物體和任何連續(xù)世代的基因組中。

“瞬時轉(zhuǎn)化”指將核酸片段導(dǎo)入宿主生物體的核中或包含dna的細(xì)胞器中，引起基因表達(dá)而沒有基因穩(wěn)定遺傳。

“等位基因”是占據(jù)染色體上給定位點的基因的幾種供選擇形式的其中一種。當(dāng)二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時，該植物在該基因座處是純合的。如果二倍體植物中一對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同，則該植物在該基因座處是雜合的。如果轉(zhuǎn)基因存在于二倍體植物中一對同源染色體中的其中之一上，則該植物在該基因座處是半合子的。

“葉綠體轉(zhuǎn)運肽”是與蛋白協(xié)同翻譯并將蛋白導(dǎo)向葉綠體或翻譯蛋白的細(xì)胞中存在的其它質(zhì)體類型的氨基酸序列。“葉綠體轉(zhuǎn)運序列”指編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列?！靶盘栯摹笔且环N與蛋白協(xié)同翻譯并將蛋白導(dǎo)向分泌器官的氨基酸序列(chrispeels，m.(1991)ann.rev.plantphys.plantmol.biol.42：21-53)。如果將所述蛋白導(dǎo)向液泡，可另外加上液泡靶向信號，或者如果將所述蛋白導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號。如果將蛋白導(dǎo)向細(xì)胞核，將移除任何存在的信號肽并用以核定位信號替代(raikhel(1992)plantphys.100：1627-1632)?！熬€粒體信號肽”是引導(dǎo)前體蛋白進(jìn)入線粒體的氨基酸序列(zhang和glaser(2002)trendsplantsci7：14-21)。

dna核酸酶和其他的突變酶結(jié)構(gòu)域可以與dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合在靶dna上產(chǎn)生雙鏈斷裂(dsb)，dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括，例如一個特異dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或一個位點特異dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。位點特異dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括但不限于tal(轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子)或鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域與dna核酸酶融合的例子包括但不限于talen和多talen。轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(talens)是tal效應(yīng)因子dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到dna酶的結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的人工限制性酶。tal蛋白是細(xì)菌產(chǎn)生的，包括高度保守的33～34氨基酸dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列(pct公開號wo2014127287，美國專利公開號us20140087426)。

起初的talen嵌合體是由野生型的foki核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域制備的，而talen也包括源于foki核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域變異提高了切割特異性和切割活性突變嵌合體。在一些例子中，多個talen可以靶向多個基因區(qū)域表達(dá)。

鋅指是另一種類型的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以將突變到引入靶dna。

各種蛋白工程技術(shù)可以用于改變鋅指dna結(jié)合特異性，這樣設(shè)計的鋅指的串聯(lián)重復(fù)序列可用于靶向期望的基因組dna序列。融合第二個蛋白結(jié)構(gòu)域例如轉(zhuǎn)錄抑制子到鋅指，可以與附近的yep基因啟動子結(jié)合，從而降低mbd1和usp1基因表達(dá)水平。

在一個實施例中，一個調(diào)控元件驅(qū)動內(nèi)源基因表達(dá)或編碼序列本身，例如，可能會通過crispr/cas9體系的基因組編輯技術(shù)被編輯或插入植物中。

crispr位點(成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)，也被稱作spidrs，間隔穿插的順向重復(fù))構(gòu)成近來描述的dna位點家族，crispr位點由短且高度保守的dna重復(fù)(典型的24～40bp，重復(fù)1～140次，也稱為crispr重復(fù))組成，crispr位點部分回文。重復(fù)序列(通常具有品種特異性)被固定長度(代表性的20～58bp，根據(jù)crispr位點而不同)的可變序列間隔開(公布與2007年3月1日的wo2007/025097)。

cas基因指通常耦合的，關(guān)聯(lián)或鄰近crispr位點或在crispr位點側(cè)翼的附近的基因。術(shù)語“cas基因”、“crispr關(guān)聯(lián)(cas)基因”此處可以互換使用。(haft等(2005)，計算生物學(xué)，ploscomputbiol1(6)：e60，doi:10.1371/journal.pcbi.0010060)。如本文所描述，41個crispr關(guān)聯(lián)(cas)基因家族進(jìn)行了描述，除了四個已知基因家族。這表明crispr系統(tǒng)屬于不同的類別，具有不同的重復(fù)模式，基因組別和物種范圍。一個給定的crispr位點不同物種間的cas基因數(shù)目不同。

cas核酸內(nèi)切酶指cas基因編碼的cas蛋白，其中，所述cas蛋白可以向靶dna序列導(dǎo)入雙鏈斷裂。cas核酸切酶由引導(dǎo)多聚核苷酸引導(dǎo)識別和選擇性的向細(xì)胞基因組特定靶位點導(dǎo)入雙鏈斷裂(u.s.2015/0082478)。引導(dǎo)多聚核苷酸/cas核酸內(nèi)切酶體系包括cas核酸內(nèi)切酶和引導(dǎo)多聚核苷酸組成的復(fù)合體，引導(dǎo)多聚核苷酸可以向dna靶序列導(dǎo)入雙鏈斷裂。如果一個正確的前間區(qū)序列鄰近基序(pam)導(dǎo)向的靶序列的3’端，cas核酸內(nèi)切酶解開基因組靶位點鄰近dna雙鏈，引導(dǎo)rna切割靶序列dna雙鏈的識別位點。cas核酸內(nèi)切酶可以通過本領(lǐng)域已知的方法直接導(dǎo)入細(xì)胞，例如，但不限于瞬時導(dǎo)入方法，轉(zhuǎn)染和/或局部適用。

如本文中使用，術(shù)語“引導(dǎo)rna”指兩個rna分子合成的融合，crrna(crisprrna)包括一個可變的靶結(jié)構(gòu)域，和一個tracrrna。在一個實施例中，引導(dǎo)rna包括一個12～30bp核苷酸序列的可變的靶結(jié)構(gòu)域和可以與cas核酸內(nèi)切酶相互作用的rna片段。

如本文所述，術(shù)語“引導(dǎo)多聚核苷酸”指可以與cas核酸內(nèi)切酶構(gòu)成復(fù)合體的多聚核苷酸序列，可以使cas核酸內(nèi)切酶識別并隨意切割dna靶位點(u.s.2015/0082478)。引導(dǎo)多聚核苷酸可以是單鏈分子也可以是雙鏈分子，可以是rna序列，dna序列或它們的組合(rna-dna組合序列)?？蛇x的，引導(dǎo)多聚核苷酸可以包括至少一個核苷酸，磷酸二酯鍵或修飾鍵，例如，但不限于鎖定核苷酸(lna)、5-甲基脫氧胞苷、2，6-二氨基嘌呤、2-氟腺苷，2-氟脲苷、2-甲基rna、硫代磷酸酯鍵，一種膽固醇分子鏈、聚乙二醇分子鏈、以間隔18(六乙二醇鏈)分子鏈、或5至3共價鍵產(chǎn)生的環(huán)。引導(dǎo)多聚核苷酸僅包括脫氧核糖核酸的也被稱作”引導(dǎo)rna”。

術(shù)語“可變靶結(jié)構(gòu)域”或“vt結(jié)構(gòu)域”此處可互換使用，包括與雙鏈dna靶位點的一條單鏈(核苷酸序列)互補(bǔ)的核苷酸序列。第一個核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(vt結(jié)構(gòu)域)與靶序列的互補(bǔ)百分?jǐn)?shù)至少為50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％?？勺儼薪Y(jié)構(gòu)域的長度至少為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30bp的核苷酸。在一些實施例中，可變靶結(jié)構(gòu)域由鄰近延伸的12～30bp核苷酸組成。可變靶結(jié)構(gòu)域是由dna序列、rna序列、修飾的dna序列、修飾的rna序列或它們的任意組合組成。

術(shù)語“cas核酸內(nèi)切酶識別結(jié)構(gòu)域”或引導(dǎo)多聚核苷酸的“cer結(jié)構(gòu)域”此處可互換使用，包括可以與cas核酸內(nèi)切酶多肽相互作用的核苷酸序列(諸如引導(dǎo)多聚核苷酸的第二核苷酸序列)。cer結(jié)構(gòu)域由dna序列、rna序列、修飾的dna序列、修飾的rna序列(例如此處描述的修飾)或它們的任意組合構(gòu)成。

核苷酸序列連接單引導(dǎo)多聚核苷酸的crnucleotide和tracrnucleotide可以組成rna序列、dna序列、，或rna-dna組合序列。在一個實施例中，核苷酸序列連接單引導(dǎo)多聚核苷酸的crnucleotide和tracrnucleotide組成長度至少為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100bp的核苷酸序列。在另一個實施例中，核苷酸序列連接單多聚核苷酸的crnucleotide和tracrnucleotide組成四核苷酸環(huán)序列，諸如，但不限于gaaa四核苷酸環(huán)序列。

序列比對和同一性百分比可用設(shè)計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定，這些方法包括但不限于生物信息計算包(inc.，madison，wi)的程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用clustalv比對方法(higgins和sharp，1989，cabios.5：151-153)采用默認(rèn)參數(shù)(空位罰分＝10，空位長度罰分＝10)執(zhí)行。用clustalv方法進(jìn)行成對比對和蛋白質(zhì)序列的同一性百分比計算的默認(rèn)參數(shù)為ktuple＝1、空位罰分(gappenalty)＝3、窗口(window)＝5并且diagonalssaved＝5。而對于核酸，這些參數(shù)為ktuple＝2，空位罰分＝5，窗口＝4并且diagonalssaved＝4。用clustalv程序比對序列后，可通過查看同一程序中的“序列距離”表來獲得“同一性百分比”和“趨異”值。除非另外說明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計算。

本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組dna和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn)中有更全面的描述：sambrook，j.，fritsch，e.f.和maniatis，t.，molecularcloning：alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress：coldspringharbor，1989(下文稱為“sambrook”)。

現(xiàn)在轉(zhuǎn)向?qū)嵤┓桨福?/p>

實施方案包括分離的多核苷酸和多肽、用于調(diào)控植物開花時間的重組dna構(gòu)建體、包含這些重組dna構(gòu)建體的組合物(例如植物或種子)，以及利用這些重組dna構(gòu)建體的方法。

分離的多核苷酸和多肽：

本發(fā)明包括如下分離的多核苷酸和多肽：

在一些實施方案中，多核苷酸編碼mbd1或usp1多肽。

在一些實施方案中，分離的多核苷酸包含(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列在與seqidno：4或7進(jìn)行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列，其中全長互補(bǔ)序列和(i)的核酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100％互補(bǔ)的。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組dna構(gòu)建體。

在一些實施方案中，分離的多肽，其氨基酸序列在與seqidno：4或7進(jìn)行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。所述多肽優(yōu)選地為花期調(diào)控多肽mbd1或usp1。

在一些實施方案中，分離的多核苷酸，其包括：(i)核酸序列，所述核酸序列在與seqidno：2、3、5或6進(jìn)行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組dna構(gòu)建體。分離的多核苷酸優(yōu)選為編碼花期調(diào)控蛋白。過量表達(dá)該花期調(diào)控多肽促進(jìn)植物從營養(yǎng)生長到生殖生長轉(zhuǎn)變；減少該多肽的表達(dá)量延長了從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變時間。

重組dna構(gòu)建體和抑制dna構(gòu)建體

在一方面，本發(fā)明包括重組dna構(gòu)建體和抑制dna構(gòu)建體。

在一個實施方案中，重組dna構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列編碼的氨基酸序列與seqidno：4或者7進(jìn)行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列。

在另一個實施方案中，重組dna構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列在與seqidno：2、3、5或6進(jìn)行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)(i)的核酸序列的全長互補(bǔ)序列。

在另一實施方案中，重組dna構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(如，在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼mbd1或usp1。這些多肽具有調(diào)控花期的活性，并可來自，例如水稻(oryzasativa)、野生稻(oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(oryzabarthii)、非洲型稻(oryzaglaberrima)、闊葉稻(oryzalatifolia)、長雄野生稻(oryzalongistaminata)、南方野生稻(oryzameridionalis)、藥用野生稻(oryzaofficinalis)、斑點野生稻(oryzapunctata)、普通野生稻(oryzarufipogon)(紅稻)、印度野生稻(oryzanivara)、擬南芥(arabidopsisthaliana)、玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、煙豆(glycinetabacina)、野大豆(glycinesoja)和短絨野大豆(glycinetomentella)。

在另一方面，本發(fā)明包括抑制dna構(gòu)建體。

抑制dna構(gòu)建體包括至少一個調(diào)控序列(如植物中有功能的啟動子)可操作的連接至全部或部分如下序列：(i)核酸序列，所述核酸序列編碼的多肽，其氨基酸序列與seqidno：4或7的序列一致性至少為50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％，或者(ii)(a)(i)核酸序列的全長互補(bǔ)序列；或者(b)源于目標(biāo)基因的正義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，所述區(qū)域的核酸序列與該目標(biāo)基因的正義鏈或反義鏈的全部或部分相比具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％得序列一致性，其中所述目標(biāo)基因編碼花期調(diào)控多肽mbd1或usp1；或者(c)全部或部分(i)與seqidno:2或5的核酸序列一致性至少為50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％，或者(ii)與seqidno:3或6的核酸序列一致性至少為50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％，或者(iii)(c)(i)或者(c)(ii)的全長互補(bǔ)核酸序列。抑制dna構(gòu)建體包括共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒抑制構(gòu)建、發(fā)夾抑制構(gòu)建體、莖-環(huán)抑制構(gòu)建體、雙鏈rna產(chǎn)生構(gòu)建體、rnai構(gòu)建體或小rna構(gòu)建體(例如sirna構(gòu)建體或mirna構(gòu)建體)。

應(yīng)當(dāng)理解(正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的)，本發(fā)明不僅僅涵蓋這些具體的示例性序列。導(dǎo)致給定位點處產(chǎn)生化學(xué)上等價的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核酸片段中的改變是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，丙氨酸(一種疏水性氨基酸)的密碼子可被編碼另一個疏水性較弱的殘基(例如甘氨酸)或疏水性較強(qiáng)的殘基(例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。類似地，導(dǎo)致一個帶負(fù)電荷的殘基替換為另一個帶負(fù)電荷的殘基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一個帶正電荷的殘基替換為另一個帶正電荷的殘基(例如，賴氨酸替換精氨酸)的改變也可預(yù)期產(chǎn)生功能上等價的產(chǎn)物。導(dǎo)致多肽分子的n-末端和c-末端部分改變的核苷酸變化也將預(yù)計不會改變多肽的活性。所提出的修飾中的每一種均完全在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)內(nèi)，如測定所編碼的產(chǎn)物的生物活性的保留。

“抑制dna構(gòu)建體”是在轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組時，導(dǎo)致該植物中的靶基因“沉默”的重組dna構(gòu)建體。對該植物來說，該靶基因可為內(nèi)源性的或是轉(zhuǎn)基因的。如本文針對靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表達(dá)的mrna或蛋白質(zhì)/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白質(zhì)功能性的水平上的抑制。本文中可交換使用的術(shù)語“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、減少、減退、減小、抑制、消除或防止?！俺聊被颉盎虺聊辈惶刂笝C(jī)理并且包括但不限于反義、共抑制、病毒-抑制、發(fā)夾抑制、莖-環(huán)抑制、基于rnai的方法以及基于小rnai的方法。

抑制dna構(gòu)建體可包含源自所關(guān)注的靶基因的區(qū)域并且可包含所關(guān)注的靶基因的有義鏈(或反義鏈)的核酸序列的全部或部分。取決于所要利用的方法，該區(qū)域可與所關(guān)注基因的有義鏈(或反義鏈)的全部或部分100％相同或者具有少于100％序列的一致性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性)。

抑制dna構(gòu)建體是本領(lǐng)域所熟知的，一旦選定所關(guān)注的靶基因就很容易構(gòu)建，并且包括但不限于共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒-抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制構(gòu)建體、莖-環(huán)抑制構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈rna的構(gòu)建體，以及更通常的是，rnai(rna干擾)構(gòu)建體和小rna構(gòu)建體，例如sirna(短干擾rna)構(gòu)建體和mirna(微rna)構(gòu)建體。

“反義抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的反義rna轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xrna”指與靶初級轉(zhuǎn)錄物或mrna的全部或部分互補(bǔ)，并阻斷分離的靶核酸片段表達(dá)的rna轉(zhuǎn)錄物(美國專利號5,107,065)。反義rna可與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即5′非編碼序列、3′非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列互補(bǔ)。

“共抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的有義rna轉(zhuǎn)錄物?！坝辛x”rna指包括mrna并且可在細(xì)胞內(nèi)或體外翻譯成蛋白質(zhì)的rna轉(zhuǎn)錄物。此前，已通過著眼于以有義方向過表達(dá)與內(nèi)源mrna具有同源性的核酸序列(其導(dǎo)致與過表達(dá)的序列具有同源性的所有rna減少)設(shè)計出了植物中的共抑制構(gòu)建體(參見vaucheret等人，plantj.，16：651-659(1998)；以及gura，nature404：804-808(2000))。

另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導(dǎo)對近端mrna編碼序列的抑制(于1998年8月20日公開的pct公開wo98/36083)。

rna干擾(rnai)是指由短干擾性rna(sirna)介導(dǎo)的動物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程(fire等人，nature391：8061998)。在植物中的對應(yīng)過程通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(ptgs)或rna沉默，并且在真菌中也稱為阻抑作用(quelling)。據(jù)信轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程是用于防止外來基因表達(dá)的進(jìn)化保守性細(xì)胞防御機(jī)制，并且通常由不同植物區(qū)系和門所共有(fire等人，trendsgenet.15：358(1999))。

小rna在控制基因表達(dá)中起重要作用。很多發(fā)育過程(包括開花)的調(diào)節(jié)是由小rna控制的。現(xiàn)在有可能通過使用在植物中產(chǎn)生小rna的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體來以工程手段改變植物基因的基因表達(dá)。

小rna似乎是通過與互補(bǔ)rna或dna靶序列堿基配對來行使功能的。當(dāng)與rna結(jié)合時，小rna或者引發(fā)靶序列的rna裂解或者引發(fā)翻譯抑制。當(dāng)與dna靶序列結(jié)合時，據(jù)信小rna可介導(dǎo)靶序列的dna甲基化。無論具體機(jī)制是什么，這些事件的后果是基因表達(dá)受到抑制。

微rna(mirna)是長度為約19至約24個核苷酸(nt)的已經(jīng)在動物和植物中鑒定出的非編碼rna(lagos-quintana等人，science294：853-8582001，lagos-quintana等人，curr.biol.12：735-739(2002)；lau等人，science294：858-862(2001)；lee和ambros，science294：862-864(2001)；llave等人，plantcell14：1605-1619(2002)；mourelatos等人，genes.dev.16：720-728(2002)；park等人，curr.biol.12：1484-1495(2002)；reinhart等人，genes.dev.16：1616-1626(2002))。它們是由大小為大約70至200nt較長的前體轉(zhuǎn)錄物加工生成的，并且這些前體轉(zhuǎn)錄物能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

微rna(mirna)看起來通過與位于由這些基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物中的互補(bǔ)序列結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因?？雌饋碛锌赡躮irna可進(jìn)入至少兩條靶基因調(diào)控途徑：(1)翻譯抑制；和(2)rna裂解。進(jìn)入rna裂解途徑的微rna類似于在動物中的rna干涉作用(rnai)和植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(ptgs)期間生成的21-25nt的短干涉rna(sirna)，并且可能摻入了rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(risc)，該復(fù)合物與rnai相似或相同。

調(diào)控序列：

本發(fā)明的重組dna構(gòu)建體(包括抑制dna構(gòu)建體)可包含至少一種調(diào)控序列。

調(diào)控序列可為啟動子或增強(qiáng)子。

多種啟動子可用于本發(fā)明的重組dna構(gòu)建體中?？筛鶕?jù)所需結(jié)果來選擇啟動子，并且可包括用于在宿主生物體中表達(dá)的組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或其他啟動子。

一般將引起基因在多數(shù)細(xì)胞類型中在多數(shù)情況下表達(dá)的啟動子稱為“組成型啟動子”。

雖然候選基因當(dāng)通過組成型啟動子驅(qū)動表達(dá)時可預(yù)測其效應(yīng)，但候選基因在35s或ubi啟動子控制下的高水平、組成型表達(dá)可具有多重效應(yīng)。使用組織特異和/或脅迫特異啟動子可消除不需要的效應(yīng)但保留調(diào)控植物開花時間的能力。在擬南芥屬中已經(jīng)觀察到了該效應(yīng)(kasuga等人(1999)naturebiotechnol.17：287-91)。

適用于植物宿主細(xì)胞的組成型啟動子包括(例如)rsyn7啟動子的核心啟動子和在wo99/43838和美國專利6,072,050中公開的其他組成型啟動子；camv35s核心啟動子(odell等人，nature313：810-812(1985))；稻肌動蛋白(mcelroy等人，plantcell2：163-171(1990))；泛素啟動子(christensen)等人，plantmol.biol.12：619-632(1989)和christensen等人，plantmol.biol.18：675-689(1992))；pemu(last等人，theor.appl.genet.81：581-588(1991))；mas(velten等人，emboj.3：2723-2730(1984))；als啟動子(美國專利5,659,026)等。其他組成型啟動子包括例如在美國專利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公開的那些啟動子。

在選擇啟動子用于本發(fā)明方法時，可能有利的是使用組織特異性啟動子或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子。

組織特異性啟動子或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子是這樣的dna序列，其調(diào)節(jié)dna序列選擇性地在對雄穗發(fā)育、結(jié)籽或兩者重要的植物細(xì)胞/組織中表達(dá)，并限制這種dna序列只在植物的雄穗發(fā)育或種子成熟期間表達(dá)。任何引起所需時空表達(dá)的可鑒定啟動子均可用于本發(fā)明的方法中。

種子或胚特異性的并且可用于本發(fā)明的啟動子包括大豆kunitz胰蛋白酶抑制劑(kti3，jofuku和goldberg，plantcell1：1079-1093(1989))、patatin(馬鈴薯塊莖)(rocha-sosa，m.等人，1989，emboj.8：23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子葉)rerie，w.g.等人，1991，mol.gen.genet.259：149-157；newbigin，e.j.等人，1990，planta180：461-470；higgins，t.j.v.等人，1988，plant.mol.biol.11：683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(schemthaner，j.p.等人，1988，emboj.7：1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子葉)(segupta-gopalan，c.等人，1985，proc.natl.acad.sci.u.s.a.82：3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子葉)(voelker，t.等人，1987，emboj.6：3571-3577)、b-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子葉)(chen，z-l等人，1988，emboj.7：297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麥醇溶蛋白(大麥胚乳)(marris，c.等人，1988，plantmol.biol.10：359-366)、麥谷蛋白和麥醇溶蛋白(小麥胚乳)(colot，v.等人，1987，emboj.6：3559-3564)和甘薯貯藏蛋白(sporamin)(甘薯塊根)(hattori，t.等人，1990，plantmol.biol.14：595-604)?？刹僮鞯剡B接至嵌合基因構(gòu)建體異源編碼區(qū)的種子特異性基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中保持它們的時空表達(dá)模式。這樣的實施例包括在擬南芥和甘藍(lán)型油菜(brassicanapus)種子中表達(dá)腦啡肽的擬南芥屬2s種子儲藏蛋白基因啟動子(vanderkerckhove等人，bio/technology7：l929-932(1989))、表達(dá)熒光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白啟動子(riggs等人，plantsci.63：47-57(1989))，以及表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的小麥谷蛋白啟動子(colot等人，emboj6：3559-3564(1987))。

可誘導(dǎo)啟動子響應(yīng)內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如，通過化合物(化學(xué)誘導(dǎo)劑)，或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)信號和/或發(fā)育信號而選擇性表達(dá)可操縱連接的dna序列?？烧T導(dǎo)的或受調(diào)控的啟動子包括(例如)受光、熱、脅迫、水澇或干旱、植物激素、創(chuàng)傷或諸如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類的化學(xué)品調(diào)控的啟動子。

用于本發(fā)明的啟動子包括以下啟動子：1)脅迫誘導(dǎo)型rd29a啟動子(kasuga等人，1999，naturebiotechnol.17：287-91)；2)大麥啟動子b22e；b22e的表達(dá)是發(fā)育中的玉米籽粒中的柄所特異性的(“primarystructureofanovelbarleygenedifferentiallyexpressedinimmaturealeuronelayers(在未成熟糊粉層中差異表達(dá)的新大麥基因的一級結(jié)構(gòu))”。klemsdal，s.s.等人，mol.gen.genet.228(1/2)：9-16(1991))；和3)玉米啟動子，zag2(“identificationandmolecularcharacterizationofzag1，themaizehomologofthearabidopsisfloralhomeoticgeneagamous”，schmidt，r.j.等人，plantcell5(7)：729-737(1993)；“structuralcharacterization，chromosomallocalizationandphylogeneticevaluationoftwopairsofagamous-likemads-boxgenesfrommaize”，theissen等人，gene156(2)：155-166(1995)；ncbigenbank登錄號x80206))。zag2轉(zhuǎn)錄物可在授粉前5天至授粉后(dap)7至8天被檢測到，并且引導(dǎo)ciml在發(fā)育中的雌花序的心皮中表達(dá)，ciml對發(fā)育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。ciml轉(zhuǎn)錄物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被檢測到。其他可用的啟動子包括可源自其表達(dá)與發(fā)育中的雌小花母系相關(guān)的基因的任何啟動子。

對于在發(fā)育種子組織中表達(dá)的多聚核苷酸，特殊的啟動子包括種子優(yōu)選的啟動子，尤其是早期籽粒/胚胎啟動子和晚期籽粒/胚乳啟動子，授粉后籽粒的發(fā)育大致可以分為三個基本階段，籽粒生長的停滯期起始于授粉后0天到10-12天，在此期間，籽粒不再明顯的生長，但是決定籽粒活力的重要事件將在此期間發(fā)生(如細(xì)胞建成數(shù)目)。線性籽粒灌漿期起始于授粉后的10-12天并延續(xù)到授粉后的40天左右。在籽粒發(fā)育期間，籽粒達(dá)到最終的質(zhì)量，并產(chǎn)生多種儲藏物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)和油等；最終的成熟期起始于授粉后大約40天到收獲，籽粒發(fā)育的這一過程中，籽粒開始休眠，變干。本發(fā)明中的“早期籽粒/胚乳啟動子”指主要在種子發(fā)育的停滯期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期間)驅(qū)動基因表達(dá)的啟動子；“后期籽粒/胚乳啟動子”主要驅(qū)動基因在授粉后12天到成熟過程中的種子中表達(dá)；表達(dá)窗口可能會有一些重疊，將根據(jù)使用的aba偶聯(lián)的序列和期望的表型選擇啟動子。

早期籽粒/胚胎啟動子包括，cim1，授粉后第5天活躍在特定組織中(wo00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎啟動子包括種子偏愛啟動子end1，在授粉后7-10天表達(dá)，和end2，授粉后9-14天在整個籽粒中表達(dá)，在授粉后10天在胚乳和果皮中表達(dá)(wo00/12733)。本發(fā)明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚乳啟動子包括種子偏愛啟動子ltp2(美國專利號5,525,716)；玉米zm40啟動子(美國專利號6,403,862)；玉米nuc1c(美國專利號6,407,315)；玉米ckx1-2啟動子(美國專利號6,921,815和美國專利申請公開號2006/0037103)；玉米lec1啟動子(美國專利號7,122,658)；玉米esr啟動子(美國專利號7,276,596)；玉米zap啟動子(美國專利申請公開號20040025206和20070136891)；玉米啟動子eep1(美國專利申請公開號20070169226)；和玉米啟動子adf4(美國專利申請?zhí)?0/963,878，2007年8月7日申請)。

本發(fā)明中調(diào)控核酸序列在植物中表達(dá)的其它啟動子是莖特異啟動子，包括苜蓿s2a啟動子(genbank登錄號ef030816；abrahams等(1995)plantmol.biol.27：513-528)和s2b啟動子(genbank登錄號ef030817)和類似的啟動子。

啟動子可以整個源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的啟動子的不同元件組成，或者甚至包括合成的dna片段。

用于本發(fā)明的啟動子包括：rip2、mlip15、zmcor1、rab17、camv35s、rd29a、b22e、zag2、sam合成酶、泛素、camv19s、nos、adh、蔗糖合成酶、r-等位基因、維管組織優(yōu)選啟動子s2a(genbank登錄號ef030816)和s2b(genbank登錄號ef030817)及來自玉米的組成型啟動子gos2。其他啟動子包括根優(yōu)選的啟動子，例如玉米nas2啟動子、玉米cyclo啟動子(us2006/0156439，公開于2006年7月13日)、玉米rootmet2啟動子(wo05063998，公開于2005年7月14日)、crlbio啟動子(wo06055487，公開于2006年5月26日)、crwaq81(wo05035770，公開于2005年4月21日)和玉米zrp2.47啟動子(ncbi登錄號：u38790；gino.1063664)。

本發(fā)明的重組dna構(gòu)建體也可包括其他調(diào)控序列，包括但不限于翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的重組dna構(gòu)建體還包括增強(qiáng)子或沉默子。

內(nèi)含子序列可加至5’非翻譯區(qū)、蛋白編碼區(qū)或3’非翻譯區(qū)以增加積聚在胞漿中的成熟信息的量。已經(jīng)顯示，在植物和動物兩者的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接內(nèi)含子可使基因表達(dá)在mrna和蛋白質(zhì)水平上均增強(qiáng)高達(dá)1000倍。參見buchman和berg，mol.cellbiol.8：4395-4405(1988)；callis等人，genesdev.1：1183-1200(1987)。

增強(qiáng)子或增強(qiáng)子元件指的是一個順式作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，即順式元件，它可調(diào)控多核苷酸序列整體表達(dá)模式的一個方面，但通常不足以單獨驅(qū)動轉(zhuǎn)錄可操作連接的多核苷酸序列。分離的增強(qiáng)子元件可以與一個啟動子融合形成一個嵌合的啟動子順式元件，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員均知道增強(qiáng)子，增強(qiáng)子包括sv40增強(qiáng)子區(qū)域、camv35s增強(qiáng)子元件等。一些增強(qiáng)子也可以改變普通調(diào)控元件的表達(dá)模式，例如，當(dāng)沒有增強(qiáng)子時，導(dǎo)致調(diào)控元件組成型表達(dá)，當(dāng)存在增強(qiáng)子時，同一調(diào)控元件在某一特定組織或某些特定組織表達(dá)。camv35s啟動子重復(fù)上游區(qū)域顯示出大約增強(qiáng)10倍的表達(dá)量(kay,r.等,(1987)science236：1299-1302)。

本發(fā)明中使用的增強(qiáng)子包括camv35s(benfey等,(1990)emboj.9：1685-96)、4xb3p-camv35s增強(qiáng)子區(qū)域—四拷貝串聯(lián)b3區(qū)域(208到155)(美國專利號5,097,025)、4xas-1p-camv35s增強(qiáng)子區(qū)域-四拷貝串聯(lián)激活序列(83到62)(美國專利號5,097,025)、2xb1-b2p-camv35s增強(qiáng)子區(qū)域—二拷貝串聯(lián)b1-b2區(qū)域(148到90)(美國專利號5,097,025)、2xa1-b3p-camv35s增強(qiáng)子區(qū)域—二拷貝串聯(lián)a1-b3區(qū)域(208到46)(美國專利號5,097,025)、2xb1-b5p-camv35s增強(qiáng)子區(qū)域—二拷貝b1-b5區(qū)域(343到90)(美國專利號5,097,025)、歐米伽增強(qiáng)子或歐米伽基本增強(qiáng)子(gallie等(1989)molecularbiologyofrnaed.cech(liss,newyork)237-256和gallie等(1987)gene60:217-25)、美國專利號7,803,992的增強(qiáng)子和甘蔗棒狀病毒(scbv)增強(qiáng)子元件(wo2013130813)。

任何植物都可以選擇用來鑒定將用于本發(fā)明重組dna構(gòu)建體的調(diào)控序列和基因。適用于分離基因和調(diào)控序列的靶植物的實例應(yīng)該包括但不限于苜蓿、蘋果、杏、擬南芥、洋薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、西蘭花、抱子甘藍(lán)、卷心菜、加拿大油菜、香瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻子、菜花、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽、柑桔、克萊門氏小柑橘、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、柚子樹、白蘭瓜、豆薯、獼猴桃、生菜、韭蔥、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、堅果、燕麥、油棕、油菜、秋葵、橄欖樹、洋蔥、橙、觀賞植物、棕櫚、木瓜樹、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃樹、花生、梨樹、胡椒、柿樹、松樹、菠蘿、車前草、李樹、石榴樹、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、紅菊苣、蘿卜、油菜、樹莓、稻、黑麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香樹、柑橘、茶、煙草、蕃茄、黑小麥、草皮草、蕪菁、葡萄樹、西瓜、小麥、薯蕷和西葫蘆。

組合物：

本發(fā)明的組合物是其基因組中包含本發(fā)明的任何重組dna構(gòu)建體(例如上面所討論的任何一種構(gòu)建體)的植物。組合物也包括任何植物的子代，以及獲取自植物或其子代的任何種子，其中所述子代或種子在其基因組中包含重組dna構(gòu)建體。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連續(xù)世代。子代也包括雜交種和自交系。

在雜交種子繁殖的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可自花授粉而產(chǎn)生純合的自交系植物。該自交系植物產(chǎn)生含有新導(dǎo)入的重組dna構(gòu)建體的種子。這些種子可生長而產(chǎn)生將會表現(xiàn)出改變的農(nóng)學(xué)特性的植物，或者可用于育種程序以產(chǎn)生雜交種子，這些雜交種子可生長而產(chǎn)生將會表現(xiàn)出如改變的農(nóng)學(xué)特性的植物。所述種子可為玉米種子或水稻種子。

植物可為單子葉植物或雙子葉植物，例如玉米或大豆植物，如玉米雜種植物或玉米自交系植物。植物還可為向日葵、高梁、油菜、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥或黍。

重組dna構(gòu)建體可穩(wěn)定地整合進(jìn)植物的基因組中。

實施方案包括但不限于以下實施方案：

1.在基因組中包含重組dna構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重組dna構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種異源調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列在與seqidno：4或7進(jìn)行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，并且其中所述植物在與不包含所述重組dna構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出改變的開花期，過量表達(dá)所述多肽促進(jìn)植物營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，減少該多肽的表達(dá)量延長了植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變時間。

2.在基因組中含有重組dna構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重組dna構(gòu)建體包含可操作連接至少一個調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼mbd1或usp1多肽，所述植物與對照植物相比，顯示改變的開花時間。當(dāng)與對照植物相比，所述植物可進(jìn)一步顯示至少一個農(nóng)藝特征的改變。

3.在基因組中含有抑制dna構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述抑制dna構(gòu)建體包含至少一個調(diào)控元件可操作連接至源于目的基因正義鏈或反義鏈的全部或部分的片段，所述片段的核苷酸序列與該片段來源的正義鏈或反義鏈全部或部分的目的基因相比，至少為50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，其中所述目的基因編碼mbd1或usp1多肽，與對照植物相比，所述植物的開花時間延遲。

4.在基因組中含有抑制dna構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述抑制dna構(gòu)建體包含至少一個調(diào)控元件可操作連接至全部或部分(a)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列與seqidno：4或7相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％得序列一致性，或者(b)(a)核酸序列的全長互補(bǔ)序列，其中所述植物與對照植物相比，顯示延遲的開花時間。

5.實施方案1到4的轉(zhuǎn)基因植物，其中多聚核苷酸編碼mbd1或usp1多肽，所述mbd1或usp1多肽可來自水稻(oryzasativa)、野生稻(oryzaaustraliensis)、短舌野生稻(oryzabarthii)、非洲型稻(oryzaglaberrima)、闊葉稻(oryzalatifolia)、長雄野生稻(oryzalongistaminata)、南方野生稻(oryzameridionalis)、藥用野生稻(oryzaofficinalis)、斑點野生稻(oryzapunctata)、普通野生稻(oryzarufipogon)(紅稻)、印度野生稻(oryzanivara)、擬南芥(arabidopsisthaliana)、鷹嘴豆(cicerarietinum)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、甘藍(lán)(brassicaoleracea)、玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、煙豆(glycinetabacina)、野大豆(glycinesoja)和短絨野大豆(glycinetomentella)。

6.1-5任意實施方案的轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一步包含至少一個多核苷酸，其編碼調(diào)控開花時間的多肽。

7.1-5任意實施方案的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一步包含至少一個重組多核苷酸，其編碼目的多肽。

8.1-7實施方案中上述植物的任意子代，實施方案1-7上述植物的任意種子，源于實施方案1-7任意上述植物的細(xì)胞和其子代。

前述實施方案1-8中的任意一項或本發(fā)明公開的其他實施方案中，重組dna構(gòu)建體還包括至少一個異源的在植物中有功能的啟動子作為調(diào)控序列。

下面的例子描述了一些代表性的方法和技術(shù)用于調(diào)控植物開花時間和觀測和/或評估植物在該條件下的農(nóng)藝特征。

1.轉(zhuǎn)化的植物的子代，該轉(zhuǎn)化的植物對于重組dna構(gòu)建體來說是半合子的，該子代分離成包含或不包含該dna構(gòu)建體的植株：包含該重組dna構(gòu)建體的子代將通常相對于不包含該重組dna構(gòu)建體的子代來進(jìn)行測量(即，不包含該重組dna構(gòu)建體的子代是對照或參照植物)。

2.重組dna構(gòu)建體基因滲入至近交系中，例如在玉米中，或基因滲入進(jìn)變種中，例如在大豆中：基因滲入品系將通常相對于親本近交系或變種品系進(jìn)行測量(即，親本近交系或品種品系是對照或參照植物)。

3.雙雜交系，其中第一雜交系由兩個親本近交系產(chǎn)生，而第二雜交系由相同的兩個親本近交系產(chǎn)生，不同的是其中一個親本近交系含有重組dna構(gòu)建體：第二雜交系通常將相對于第一雜交系進(jìn)行測量(即第一雜交系為對照植物或參照植物)。

4.包含重組dna構(gòu)建體的植物：該植株可以相對于這樣的對照植物進(jìn)行評價或測量，該對照植物不包含重組dna構(gòu)建體，但具有與該植株相當(dāng)?shù)倪z傳背景(例如，與包含重組dna構(gòu)建體的植株相比較，該遺傳物質(zhì)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。存在許多可用于分析、比較和表征植物遺傳背景的實驗室的技術(shù)；其中這些技術(shù)是同工酶電泳、限制性片段長度多態(tài)性(rflps)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna(rapds)、任何引物聚合成酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ap-pcr)、dna擴(kuò)增指紋(daf)、序列特異擴(kuò)增區(qū)域(scars)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性和也稱為微衛(wèi)星的簡單序列重復(fù)(ssrs)。

此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識到，評價或測量轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經(jīng)針對所需的農(nóng)學(xué)特性或表型，通過誘變或轉(zhuǎn)化而選擇的植物。

方法：

方法包括但不限于：調(diào)控植物開花時間的方法，觀測和/或評估植物農(nóng)業(yè)特征的方法，制備種子的方法。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，例如水稻、玉米、擬南芥、大豆植物。植物還可以是向日葵、高粱、加拿大油菜、小麥、苜蓿、棉花、大麥或黍。所述種子可為水稻、玉米、擬南芥或大豆種子，例如玉米雜交種子或玉米自交種子。

方法還包括但不限于如下方法：

轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法包含用本發(fā)明中任意分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞。也包括通過這種方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在具體實施方案中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如酵母、昆蟲或植物細(xì)胞，或原核細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞。

產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括用本發(fā)明的任何分離的多核苷酸或重組dna構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也涉及由該方法制備的轉(zhuǎn)基因植物，以及從該轉(zhuǎn)基因植物中獲取的轉(zhuǎn)基因種子。

用于從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基中分離本發(fā)明多肽的方法，其中所述細(xì)胞包含具有本發(fā)明多核苷酸的重組dna構(gòu)建體，所述重組dna構(gòu)建體包含本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接到至少一種調(diào)控序列，并且其中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適于重組dna構(gòu)建體表達(dá)的條件下生長。

改變宿主細(xì)胞中本發(fā)明多肽表達(dá)水平的方法，包括：(a)用本發(fā)明的重組dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及(b)在適于表達(dá)所述重組dna構(gòu)建體的條件下使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長，其中重組dna構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的本發(fā)明多肽含量改變。

調(diào)控植物開花時間的方法，包括(a)將重組dna構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組dna構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述所述多肽具有的氨基酸序列在與seqidno：4或7進(jìn)行比較時具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；和(b)在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組dna構(gòu)建體并且在與不包含所述重組dna構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)出改變的開花時間。所述方法還可包括(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組dna構(gòu)建體并且在與不包含所述重組dna構(gòu)建體的對照植物進(jìn)行比較時表現(xiàn)改變的開花時間。

在一些實施方案中，控制植物開花時間的方法包括在植物中過量表達(dá)mbd1或usp1多肽，在一些實施方案中，控制開花時間的方法包括采用本發(fā)明的dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞。

生產(chǎn)種子的方法包括任意前述方法，還包括從所述子代植物獲得種子，其中所述種子在其基因組中包含重組dna構(gòu)建體。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供的種子在其基因組中包含發(fā)明的重組dna構(gòu)建體。

在前述任意的方法中或本文其他實施方案披露的任意方法中確定轉(zhuǎn)基因植物農(nóng)藝性狀改變的步驟，如果適當(dāng)，可包括確定在可變的環(huán)境條件下，與不包含重組dna構(gòu)建體的對照植物相比，轉(zhuǎn)基因植物是否顯示至少一種農(nóng)藝性狀的變化。

在前述任意的方法中或本文其他實施方案披露的任意方法中確定轉(zhuǎn)基因子代植物農(nóng)藝性狀改變的步驟，如果適當(dāng)，可包括確定在可變的環(huán)境條件下，與不包含重組dna構(gòu)建體的對照植物相比，轉(zhuǎn)基因子代植物是否顯示至少一種農(nóng)藝性狀的變化。

在前述任意的方法中或本文其他實施方案披露的任意方法中，所述引入步驟中所述再生植物細(xì)胞可包括愈傷細(xì)胞、胚胎愈傷細(xì)胞、配子細(xì)胞、分生細(xì)胞、或不成熟的胚胎細(xì)胞?？稍偕参锛?xì)胞可源于近交玉米植株。

在前述任意方法或本文披露的其他實施方案中的任意方法中，所述再生步驟可包括：(i)在含有胚促激素培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞直至長出愈傷組織；(ii)將步驟(i)所述的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有組織促激素的第一培養(yǎng)基上；和(iii)將步驟(ii)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞接種到第二培養(yǎng)基上，使其莖伸長、根發(fā)育或兩者均發(fā)育。

在前述任意方法或本文披露的其他實施方案的任意方法中，存在將重組dna構(gòu)建體導(dǎo)入再生植物細(xì)胞的可替代方法，所述重組dna構(gòu)建體包含可操作地與至少一個調(diào)節(jié)序列連接的多核苷酸。例如，將調(diào)控序列(諸如一個或多個增強(qiáng)子、可作為轉(zhuǎn)座元件的一部分)導(dǎo)入再生植物細(xì)胞中，然后篩選調(diào)控序列可操作地與即時披露的編碼多肽的內(nèi)源基因連接的轉(zhuǎn)基因事件。

將本文披露的重組dna構(gòu)建導(dǎo)入植物的適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，包括，但不限于直接dna吸收、化學(xué)處理、電穿孔、微注射、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染、載體介導(dǎo)dna轉(zhuǎn)移、轟擊、或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。植物轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)在國際專利公開號wo2009/006276中描述，其全部內(nèi)容并入作為參考。

另外，也有修飾或改變宿主內(nèi)源基因組dna的方法，包括改變宿主天然dna序列或調(diào)控元件、編碼或非編碼序列等前體轉(zhuǎn)基因序列。這些方法也可以用于將核酸序列靶向到基因組中改造目標(biāo)識別序列。例如本文中轉(zhuǎn)基因修飾的細(xì)胞或植物使用傳統(tǒng)的基因工程核酸酶如產(chǎn)生修飾植物基因組的歸位核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生(例如wo2009/114321；gao等(2010)plantjournal1：176-187)。其他的位點定向工程是通過使用鋅指結(jié)構(gòu)域識別偶聯(lián)的限制性內(nèi)切酶的限制性特點修飾內(nèi)源基因(例如urnov等(2010)natrevgenet.11(9)：636-46；shukla等(2009)nature459(7245)：437-41)。轉(zhuǎn)錄激活因子類似-dna修飾酶(transcriptionactivator-likeeffector-dnamodifyingenzyme，tale或talen)可用于基因工程修飾植物基因組，參見例如us20110145940,cermak等(2011)nucleicacidsres.39(12)和boch等(2009),science326(5959)：1509-12。植物基因組定點修飾也可以使用細(xì)菌ii型crispr(成簇的規(guī)律的間隔的短回文的重復(fù)序列，clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/cas(crispr關(guān)聯(lián)蛋白，crispr-associated)系統(tǒng)，參考例如belhaj等(2013),plantmethods9:39.crispr/cas系統(tǒng)可以允許可定制的小的非編碼rna引導(dǎo)的基因組dna靶向切割。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉將編碼期望多肽的基因轉(zhuǎn)化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉產(chǎn)生純合子轉(zhuǎn)基因植物，或者將再生植物的花粉與種子長出的農(nóng)藝重要的植物雜交，或者農(nóng)藝重要的植物的花粉與再生的轉(zhuǎn)基因植物雜交。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知培育本文披露的含有期望多肽的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

轉(zhuǎn)基因植物中性狀的堆疊

轉(zhuǎn)基因植物可包含本發(fā)明公開的一個或多個花期調(diào)控多核苷酸與一個或多個另外的多核苷酸的堆疊，從而導(dǎo)致多個多肽序列的產(chǎn)生或抑制。包含多核苷酸序列的堆疊的轉(zhuǎn)基因植物可通過傳統(tǒng)育種方法或通過遺傳工程方法中的一者或兩者來獲得。這些方法包括但不限于培育各自包含所關(guān)注多核苷酸的單獨品系，用后續(xù)基因轉(zhuǎn)化包含本文所公開的基因的轉(zhuǎn)基因植物，以及將基因共轉(zhuǎn)化進(jìn)單個植物細(xì)胞中。如本文所用，術(shù)語“堆疊”包括具有存在于同一植物中的兩種或更多種性狀(例如，兩種性狀均摻入核基因組中，一種性狀摻入核基因組中且一種性狀摻入質(zhì)體的基因組中，或者兩種性狀均摻入質(zhì)體的基因組中)。在一個非限制性例子中，“堆疊性狀”包含序列彼此物理相鄰的分子堆疊。如本文所用的性狀是指衍自特定序列或序列群組的表型?？墒褂冒鄠€基因的單個轉(zhuǎn)化載體或單獨地攜帶于多個載體上的基因進(jìn)行基因的共轉(zhuǎn)化。如果序列通過遺傳轉(zhuǎn)化植株來堆疊，則所關(guān)注的多核苷酸序列可在任何時間以任何順序進(jìn)行組合。可以用共轉(zhuǎn)化方案將性狀與所關(guān)注多核苷酸同時引入，所述多核苷酸由轉(zhuǎn)化盒的任何組合提供。例如，如果將要引入兩條序列，則可將該兩條序列包含在單獨的轉(zhuǎn)化盒中(反式)或包含在同一轉(zhuǎn)化盒中(順式)?？赏ㄟ^相同啟動子或不同啟動子驅(qū)動所述序列表達(dá)。在某些情況中，可能期望引入會抑制所關(guān)注多核苷酸的表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒。這可以與其他抑制盒或過表達(dá)盒的任何組合進(jìn)行組合以在植物中生成所需的性狀組合。還認(rèn)識到可使用位點特異性重組系統(tǒng)在所需的基因組位置堆疊多核苷酸序列。參見，例如，wo1999/25821、wo1999/25854、wo1999/25840、wo1999/25855和wo1999/25853，上述專利均以引用的方式并入本文。

實施例

本文的具體實施進(jìn)一步在下列實例中示明。在這些實例中，除非特別說明，采用攝氏/公制。在這些實例中，僅用舉例說明具體的實施過程。通過上述討論和具體事例，本領(lǐng)域的專業(yè)人員可以查明本發(fā)明的基本特征，經(jīng)過各種改變和修改將本發(fā)明應(yīng)用于各種用途和條件，并不偏離本發(fā)明主體和范圍。因此，除了本專利表述和討論的各種修改外，本領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)人員所做的不偏離本發(fā)明主題的修改也將落入本專利的權(quán)力要求范圍內(nèi)。

實施例1.花期調(diào)控基因的克隆和過表達(dá)載體的構(gòu)建

基于基因位點loc_os05g33550.1和loc_os07g36600.1的序列信息，設(shè)計引物，并克隆水稻花期調(diào)控基因。引物序列和擴(kuò)增片段的長度如表2所示。

以中花11號水稻葉、莖和根混合的cdna庫為模板克隆osmbd1和osusp1基因的cdna，pcr反應(yīng)混合液和pcr程序如表3和4所示。

表2.克隆水稻花期調(diào)控基因的引物

表3.pcr反應(yīng)混合液

表4.克隆水稻花期調(diào)控基因的pcr循環(huán)狀況

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳分離后采用柱式試劑盒回收，并與ta克隆載體連接。通過測序確定pcr產(chǎn)物的核酸序列和在構(gòu)建體中的方向，然后將基因克隆到植物雙元載體dp0158(pcambia1300-dsred，seqidno:1)中。dp0995載體中克隆的核苷酸序列和osmbd1的編碼序列如seqidno：2和3所示，osmbd1的氨基酸序列如seqidno：4所示；dp0998載體中克隆的核苷酸序列和osusp1的編碼序列如seqidno：5和6所示，osusp1的氨基酸序列如seqidno：7所示。

實施例2.轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因水稻

過表達(dá)載體和空載體(dp0158)采用林擁軍和張啟發(fā)((2005)plantcellrep.23:540-547)描述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化入中花11號水稻。轉(zhuǎn)化實驗室獲得的t0代轉(zhuǎn)基因幼苗移栽至田間水田中獲得t1種子，t1和t2代種子儲藏在4℃冷庫中。過表達(dá)載體含有dsred和hyg基因，t1和t2代種子在綠色熒光燈下發(fā)紅色熒光的為轉(zhuǎn)基因種子，并用于下列開花性狀驗證試驗。

轉(zhuǎn)基因水稻植株中基因表達(dá)分析：

采用標(biāo)準(zhǔn)的實時rt-pcr程序諸如源于的反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時rt-pcr(sybr^rpremixextaq^tm,寶生物)分析轉(zhuǎn)基因水稻植株中基因的表達(dá)水平。ef1α基因用作內(nèi)參顯示轉(zhuǎn)基因水稻和對照植物的擴(kuò)增和上樣量類似。ef1αmrna水平用于規(guī)范基因表達(dá)量。

采集t1代灌漿期dp0995水稻植株的倒二葉，提取mrna，采用下面的引物測定osmbd1基因的表達(dá)水平。如圖1所示，zh11-tc水稻中基因的表達(dá)水平設(shè)置為1.00，zh11-wt和dp0158對照水稻中基因的表達(dá)水平與zh11-tc水稻中類似，osmbd1基因在所有15個轉(zhuǎn)基因株系中過量表達(dá)。

dp995-f1：5'-ctgactgctcgtgtgaagac-3'(seqidno：12)

dp995-r1：5'-tggaggctttggtatgttagg-3'(seqidno：13)

采集t1代灌漿期dp0998水稻植株的倒二葉，提取mrna，采用下面的引物測定osusp1基因的表達(dá)水平。如圖2所示，zh11-tc水稻中基因的表達(dá)水平設(shè)置為1.00，zh-wt和dp0158對照水稻中基因的表達(dá)水平與zh11-tc水稻中類似，osusp1基因在所測定的14個轉(zhuǎn)基因株系中過量表達(dá)，dp0998.15水稻植株中osusp1基因的表達(dá)量較低，僅為zh11-tc中基因表達(dá)量的1.87倍。

dp0998-f1：5'-ccctacaagatccacatcgtc-3'(seqidno：14)

dp0998-r1：5'-cttccaagcctccccttg-3'(seqidno：15)

實施例3.osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻開花性狀的觀測

t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因植株在北京田間(40°13’n,116°13’e)種植擴(kuò)繁收獲t2代種子，并記錄植株生長過程中的表型。

方法：

t1代轉(zhuǎn)基因種子于32℃800ppm多菌靈中消毒8h后，蒸餾水沖洗3～5次，然后在35-37℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)36h。萌發(fā)的種子于2014年5月14日種植在田間苗床上，6月12日，三葉期時，將幼苗移栽到北京田間稻田中。每個轉(zhuǎn)基因株系的10棵植株種植一行，zh11-wt(中花11號野生型)、zh11-tc(組織培養(yǎng)獲得的中花11號)和dp0158(轉(zhuǎn)化空載體dp0158的中花11號水稻)臨近轉(zhuǎn)基因水稻，種植在同一個小區(qū)，并用作對照。

水稻植株正常管理，并使用相應(yīng)的殺蟲劑和化肥，實驗過程中觀察并記錄植株表型。

本試驗記錄抽穗期和成熟期，抽穗期是指一行中每棵植株50％的幼穗抽出劍葉葉鞘的日期，成熟期指每穗谷粒穎殼90％以上變黃或95％以上谷粒小穗軸及副護(hù)穎變黃的日期，此時為最佳收獲時期。如果轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期早于對照水稻植物(中花11號、zh11-tc或dp0158植株)，那么轉(zhuǎn)基因水稻被認(rèn)為具有早抽穗的特征，轉(zhuǎn)入的基因在控制植物開花時間上發(fā)揮作用。

本試驗還測定了植株高度、有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量。植株高度指從地表到最高穗或葉頂部的長度。收獲時，將每個轉(zhuǎn)基因株系的全部或位于中間位置的六株收獲,先將稻穗剪下并存放在一個袋子中，然后將莖部貼地剪下放在另外的袋子中，測定每個單株的有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量。植株高度、有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量采用asreml混合線性模型分析。

結(jié)果：

2014年5月12日將15個osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻株系播種，于2014年6月12日移栽到北京田間。水稻植株正常管理，8月6日時，已有12個轉(zhuǎn)基因株系的50％幼穗從劍葉鞘中抽出；10棵dp0995.03水稻植株中有7棵植株和10棵dp0995.07水稻植株中有8棵植株也有50％的幼穗抽出；dp0995.12水稻植株中一半在8月6日有50％有穗抽出，另一半的抽穗期在8月10日；而對照植株zh11-wt、zh11-tc和dp0158在8月21日抽穗。上述結(jié)果表明幾乎所有的轉(zhuǎn)基因水稻株系比對照植株早抽穗月15天。轉(zhuǎn)基因水稻植株也比對照植株早成熟約15天。

表5.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第一次北京驗證)

抽穗期或開花期通過影響基本營養(yǎng)生長的時間調(diào)控作物的生物量，進(jìn)而影響籽粒產(chǎn)量。為進(jìn)一步證實這一觀點，我們測定了植株高度、單株有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量。表6-8表明osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株的單株平均籽粒產(chǎn)量低于zh11-wt，高于zh11-tc和dp0158兩個對照，且差異均未達(dá)到顯著水平；osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株比zh11-wt、zh11-tc和dp0158對照植株顯著的矮；有效穗數(shù)與對照植株相比沒有顯著性差異。

表6.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上產(chǎn)量分析(第一次北京驗證)

表7.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上植株高度分析(第一次北京驗證)

表8.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上有效穗數(shù)分析(第一次北京驗證)

收獲t2代種子后，在綠色熒光燈下測定了t2代種子熒光分離比，結(jié)果表明t2代種子顯示3:1的熒光和非熒光種子分離比，進(jìn)一步表明單拷貝的osmbd1基因插入不同的轉(zhuǎn)基因單株中。

實施例4.osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻的開花性狀驗證

抽穗期或開花期是一個重要的農(nóng)藝性狀，決定著水稻品種的適應(yīng)性和地理區(qū)域分布，適當(dāng)?shù)某樗肫谑谦@得理想產(chǎn)量水平的先決條件。

為進(jìn)一步探討osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻的開花性狀，并探討溫度或光周期是否影響轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期或開花期，我們將t1和t2代種子種植在不同的地理位置和環(huán)境條件下：hn(海南,18°30’n,109°3’e),bj(北京,40°13’n,116°13’e)andnx(寧夏,38°36'n,106°23'e,海拔高1106.3m)。

試驗方法與實施例3描述的方法相同。

結(jié)果

t1代植株

1)2015海南

2014年11月21日，在海南田間種植了6個t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻株系，zh11-tc水稻植株用作對照，12月15日將三葉期水稻移栽到稻田中。播種后84天zh11-tc對照水稻植株到達(dá)抽穗期，4個轉(zhuǎn)基因株系顯示出與zh11-tc相同的抽穗期，只有兩個轉(zhuǎn)基因株系比對照植株早抽穗3天。而早抽穗的株系與正常抽穗的四個株系成熟期沒有差別，轉(zhuǎn)基因水稻植株和對照植株同時成熟。

表9展示了單株平均籽粒產(chǎn)量，兩個早抽穗株系的平均單株籽粒產(chǎn)量低于zh11-tc對照，正常抽穗的四個株系的單株平均產(chǎn)量高于zh11-tc對照。

表9.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在海南的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

2)2015北京

6個t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因株系種植在北京稻田中，zh11-tc、dp0158和dp0995.bn(t1dp0995轉(zhuǎn)基因水稻種子擴(kuò)繁時分離的t2代非熒光種子)用作對照。2015年4月22日將t1代轉(zhuǎn)基因種子和對照種子播種，此時間早于2014年北京的播種時間。播種91天后，dp0995.15水稻植株的50％幼穗從劍葉鞘中抽出，其余5個轉(zhuǎn)基因株系也顯示出較早的抽穗期(表10)。這些結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株早抽穗/開花的性狀，osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株比對照植株早抽穗9～14天。

如表10所示,所有6個osmbd1轉(zhuǎn)基因株系均比對照植株矮；有效穗數(shù)少于zh11-tc，但與dp0158和dp0995.bn相比無差異；轉(zhuǎn)基因水稻的單株平均籽粒產(chǎn)量少于對照植株。

表10.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第二次北京驗證)

3)2015年寧夏

種植在北京的6個t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)一步在寧夏進(jìn)行驗證，zh11-tc和dp0158植株用作對照。于4月14日播種育秧，5月18日移栽到田間稻田中。播種后108天，dp0995.15水稻植株的50％幼穗抽出劍葉鞘，而zh11-tc和dp0158對照水稻植株在播種后128天到達(dá)抽穗期，與zh11-tc和dp0158植株相比，osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻提前抽穗13～20天(表11)。

進(jìn)一步分析表明osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻比兩個對照水稻植株高，且有效穗數(shù)多余對照。osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在九月份成熟，而由于溫度較低，zh11-tc和dp0158水稻在十月初并沒有完全成熟，影響了zh11-tc和dp0158的產(chǎn)量。osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻的平均單株籽粒產(chǎn)量高于zh11-tc和dp0158植株。

表11.t1代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在寧夏的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

t2代植株

1)2015海南

將t2代7個osmbd1轉(zhuǎn)基因株系的9個單株的種子種植在海南，zh11-tc水稻植株用作對照。與zh11-tc對照植株相比，dp0995.12水稻植株顯示出抽穗期早7天，其余轉(zhuǎn)基因株系水稻的抽穗期與zh11-tc相同。早抽穗株系的平均單株籽粒產(chǎn)量低于zh11-tc，而osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻的單株籽粒產(chǎn)量在載體水平與zh11-tc相近。

表12.t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在海南的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

2)2015北京

t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因種子在北京種植兩次，第一次試驗的播種時間早于2014年，第二次試驗的播種時間與2014年相近。兩次試驗中種植相同的osmbd1轉(zhuǎn)基因株系，zh11-tc、dp0158和dp0995.bn水稻植株用作對照，并臨近轉(zhuǎn)基因水稻植株種植。

如表13和14所示，與對照相比，第一次試驗中，除dp0995.03.61水稻單株外，源于6個轉(zhuǎn)基因株系的11個單株的抽穗期早8～14天，第二次試驗中，除dp0995.03.61和dp0995.03.62水稻單株外，10個單株的抽穗期早5～11天。這些結(jié)果進(jìn)一步表明t1和t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株在北京顯示早抽穗性狀。

進(jìn)一步分析表明，兩次試驗中，osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株比對照植株矮；轉(zhuǎn)基因水稻和對照之間有效穗數(shù)沒有明顯的差異；且osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻的平均單株籽粒產(chǎn)量低于zh11-tc對照。

表13.t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第一次試驗)

表14.t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第二次試驗)

3)2015寧夏

源于6個轉(zhuǎn)基因株系的12個單株的t2代osmbd1種子種植在寧夏田間，zh11-tc和dp0158植株用作對照。播種后128天，zh11-tc和dp0158水稻植株中50％的幼穗抽出劍葉鞘，除dp0995.03.61水稻外的11個單株的抽穗期比對照早18～23天。轉(zhuǎn)基因水稻植株比zh11-tc和dp0158早成熟。

植株高度和籽粒產(chǎn)量如表15所示，大部分osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株高于zh11-tc和dp0158水稻植株，且籽粒產(chǎn)量也高于zh11-tc和dp0158植株。zh11-tc和dp0158對照籽粒比較低的另一個原因為后期低溫和抽穗期比較晚。因此早抽穗或開花能夠避免成熟后期的霜降或低溫造成的不良影響。

表15.t2代osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在寧夏的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

實施例5.osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻的田間干旱驗證

開花期干旱脅迫是農(nóng)業(yè)實踐中的重要問題，osmbd轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)一步在田間干旱條件下測試。對于成熟水稻的田間干旱試驗，每個構(gòu)建體選擇12個轉(zhuǎn)基因株系，t2代種子首先按照實施例3描述的方法消毒，萌發(fā)的種子種植在田間苗床上，三葉期時，移栽到試驗田地中，每個轉(zhuǎn)基因株系種植一行10棵植株作為一個重復(fù)，一個小區(qū)設(shè)置四個重復(fù)，zh11-tc、dp0158和bn臨近轉(zhuǎn)基因株系種植，并種在一個小區(qū)中，用作統(tǒng)計分析的對照。

水稻植株正常管理，并施以相應(yīng)的化肥和殺蟲劑。水稻始穗期停止灌水，因此抽穗至開花期時能夠產(chǎn)生干旱脅迫，干旱時間長短和脅迫程度取決于溫度和濕度等天氣條件。使用tdr300(spectrumtechnologies，inc.)在每塊區(qū)域的十個地點每四天測定土壤體積含水量。

干旱脅迫過程中觀察記錄抽穗期、葉片卷曲，萎蔫，枯葉、敏旱或抗旱的表型。中午特別注意卷葉程度，收獲時，每個株系的每重復(fù)挑選6株具有代表性的植株(不包括邊緣植株)混合收割，脫粒并稱量每份水稻材料籽粒的重量，計算出單株水稻的籽粒重量。利用asreml軟件，采用混合線性模型，對單株籽粒重量進(jìn)行統(tǒng)計分析。在p≤0.1水平下，選擇陽性株系。

田間干旱試驗結(jié)果：

12個osmbd1轉(zhuǎn)基因株系在寧夏進(jìn)行試驗，zh11-tc、dp0158和dp0995.bn臨近轉(zhuǎn)基因株系種植，并用作對照。zh11-tc水稻植株幼穗分化ii期停止?jié)菜练N子成熟產(chǎn)生干旱脅迫。如圖3所示，osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株抽穗前，田間土壤體積含水量從45％降到10％，osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻抽穗之后和zh11-tc水稻植株抽穗后各出現(xiàn)了一次降雨增加了土壤含水量。與對照植株相比，大部分osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株早抽穗23天，dp0995.03.61、dp0995.06.61和dp0995.09.69水稻植株除外，且dp0995.03.61水稻植株比對照晚抽穗7天。早抽穗的轉(zhuǎn)基因水稻比對照植株早成熟，并能在九月份完全成熟，而對照水稻植株和dp0995.03.61、dp0995.06.61和dp0995.09.69水稻植株因為后期低溫不能完全成熟。osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻植株因為較早抽穗和成熟受到較短時間的干旱脅迫，因此11個轉(zhuǎn)基因單株的平均單株籽粒產(chǎn)量均高于三個對照(表16)。上述結(jié)果表明osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在干旱脅迫后具有較高的單株籽粒產(chǎn)量。

表16.osmbd1轉(zhuǎn)基因水稻在田間干旱條件下的產(chǎn)量分析

實施例6.osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株的開花性狀觀測

t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻種子在北京田間(40°13’n,116°13’e)擴(kuò)繁用于獲得t2代種子，試驗過程中觀察并記錄表型。

試驗方法如實施例3中所描述的相同。

結(jié)果：

2014年5月12日，將15個t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻株系的種子播種在田間的苗床上，并于6月12日移栽到北京田間的稻田中。水稻植株正常的澆水和管理，并記錄植株的表型。8月4日，14個轉(zhuǎn)基因株系的50％幼穗從劍葉鞘中抽出，只有一個轉(zhuǎn)基因株系dp0998.15于8月16日50％的幼穗從劍葉鞘中抽出；而三個對照植株于8月21日到達(dá)抽穗期。14個轉(zhuǎn)基因水稻株系的抽穗期比對照植株早17天，且osusp1基因在這14個轉(zhuǎn)基因株系的葉片中高量表達(dá)；dp0998.15株系的抽穗期比對照植株早5天，osusp1基因在其葉片中的表達(dá)量相對較低。因此推測早抽穗的時間與osusp1基因在不同轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量呈正相關(guān)(圖2)。這些結(jié)果清楚的表明osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株為早抽穗植物，osusp1基因可能在調(diào)控開花時間方面起重要作用。

與對照植株相比，osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株早成熟大約19天，dp0998.15水稻株系除外。

表17.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第一次北京驗證)

本試驗還測定了植株高度，單株有效穗數(shù)和單株籽粒產(chǎn)量，如表18-20所示。osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株的平均單株籽粒產(chǎn)量低于zh11-wt、zh11-tc和dp0158三個對照，但差別未達(dá)到顯著水平；有效穗數(shù)高于zh11-wt、zh11-tc和dp0158對照植株；植株高度方面，轉(zhuǎn)基因水稻植株和對照植株沒有顯著性差異。

表18.t1代osusp11轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上產(chǎn)量分析(第一次北京驗證)

表19.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上植株高度分析(第一次北京驗證)

表20.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在載體水平上有效穗數(shù)分析(第一次北京驗證)

獲得t2代種子后，在綠色熒光等下檢測了t2代種子的熒光分離比，結(jié)果表明獲得的t2代種子的熒光和非熒光分離比3：1，進(jìn)一步表明單拷貝osusp1基因插入到上述不同的轉(zhuǎn)基因株系中。

實施例7.osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株的開花性狀驗證

最佳的產(chǎn)量需要抽穗期或開花期的精確調(diào)控，而抽穗期或開花期依據(jù)位置和氣候而發(fā)生變化。

為進(jìn)一步探討osusp1轉(zhuǎn)基因水稻的開花性狀，并探討溫度或光周期是否影響轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期或開花期，我們將t1和t2代種子種植在不同的地理位置和環(huán)境條件下：hn(海南,18°30’n,109°3’e),bj(北京,40°13’n,116°13’e)andnx(寧夏,38°36'n,106°23'e,海拔高1106.3m)。

試驗方法與實施例3描述的方法相同。

結(jié)果：

t1代植株

1)2015海南

5個t1代osusp1轉(zhuǎn)基因植株種植在海南田間，zh11-tc用作對照。zh11-tc對照植株播種后84天達(dá)到抽穗期，3個轉(zhuǎn)基因株系的抽穗期與zh11-tc相同，1個轉(zhuǎn)基因株系比對照早抽穗2天，另外一個轉(zhuǎn)基因株系比對照晚抽穗2天，這5個轉(zhuǎn)基因株系的成熟期與zh11-tc對照植株相同。如表21所示，所有轉(zhuǎn)基因水稻株系的單株平均籽粒產(chǎn)量低于zh11-tc對照植株。

表21.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在海南的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

2)2015北京

6個t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻株系種植在北京稻田中再次進(jìn)行驗證，zh11-tc、dp0158和dp0998.bn(t1代dp0998轉(zhuǎn)基因種子擴(kuò)繁時分離的t2代非熒光種子)用作對照。2015年4月22日將t1代轉(zhuǎn)基因種子和對照種子播種在田間的苗床上，2015年的播種時間早于2014年。如表22所示，6個osusp1轉(zhuǎn)基因株系的抽穗期均早于對照植株。這些結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了osusp1轉(zhuǎn)基因植株的早抽穗特性，且轉(zhuǎn)基因植株的抽穗期比對照植株早7～14天。

osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株也比對照植株早成熟。植株高度、有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量分析表明osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株比三個對照植株均矮，有效穗數(shù)和單株籽粒產(chǎn)量較少。

表22.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第二次北京驗證)

3)2015寧夏

在北京驗證的6個t1代osusp1轉(zhuǎn)基因株系再次在寧夏進(jìn)行驗證，zh11-tc和dp0158植株用作對照。與zh11-tc和dp0158對照植株相比，5個osusp1轉(zhuǎn)基因株系早抽穗17～19天，dp0998.15水稻株系早抽穗8天。這些轉(zhuǎn)基因植株比對照早成熟大約19天。植株高度、有效穗數(shù)和單株籽粒產(chǎn)量的結(jié)果表明，osusp1轉(zhuǎn)基因水稻比兩個對照均高，且具有較多的有效穗數(shù)。osusp1轉(zhuǎn)基因水稻的單株籽粒產(chǎn)量高于zh11-tc和dp0158對照植株。

表23.t1代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在寧夏的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

t2代植株

1)2015海南

源于5個osusp1轉(zhuǎn)基因株系的6個不同單株的t2代種子種植在海南田間，zh11-tc水稻植株用作對照。dp0998.02水稻植株比zh11-tc早抽穗3天，而其他的轉(zhuǎn)基因植與zh11-tc對照植株的抽穗期相同。這些osusp1轉(zhuǎn)基因水稻和zh11-tc植株成熟期相同。除dp0998.02.09和dp0998.03.02水稻植株外，osusp1轉(zhuǎn)基因水稻的單株籽粒產(chǎn)量低于zh11-tc對照水稻植株。

表24.t2代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在海南的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

2)2015北京

t2代osusp1轉(zhuǎn)基因種子在北京田間驗證兩次，第一次試驗的播種時間早于2014年，第二次試驗的播種時間與2014年相近。兩次試驗驗證相同的osusp1轉(zhuǎn)基因株系，zh11-tc、dp0158和dp0998.bn水稻植株用作對照并臨近轉(zhuǎn)基因株系種植。

除dp0998.15.61和dp0998.15.62外，第一次試驗中osusp1轉(zhuǎn)基因株系比對照早抽穗6～14天，第二次試驗中早抽穗3～11天，osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株也比對照植株早成熟。這些結(jié)果進(jìn)一步表明t1和t2osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在北京田間具有早抽穗的性狀。

進(jìn)一步的分析顯示，在兩次試驗中，與zh11-tc和dp0158對照植株相比，osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株顯著矮，且具有顯著少的有效穗數(shù)；且osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株的單株籽粒產(chǎn)量低于zh11-tc水稻植株，與dp0158和dp0998.bn水稻植株的單株籽粒產(chǎn)量相近。

表25.t2代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第一次試驗)

表26.t2代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在北京的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量(第二次試驗)

3)2015寧夏

源于7個osusp1轉(zhuǎn)基因株系的12個單株的t2代種子種植在寧夏，zh11-tc和dp0158植株用于對照。播種后128天，zh11-tc和dp0158植株到達(dá)抽穗期，而轉(zhuǎn)基因水稻植株，除dp0998.15.61和dp0998.15.62外，抽穗期比對照植株早12～22天。zh11-tc和dp0158植株在播種后175天成熟，而osusp1轉(zhuǎn)基因水稻會成熟的更早些，且能夠避開成熟后期的低溫。

植株高度和籽粒產(chǎn)量如表27所示，與zh11-tc和dp0158植株相比，所有osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株較高，且籽粒產(chǎn)量也較高。

表27.t2代osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在寧夏的開花性狀、植株高度和產(chǎn)量

實施例8.osusp1轉(zhuǎn)基因水稻的田間干旱驗證試驗

osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株在寧夏進(jìn)行干旱試驗，結(jié)果如下所示：

田間干旱試驗結(jié)果：

12個osusp1轉(zhuǎn)基因株系在寧夏進(jìn)行驗證，zh11-tc、dp0158和dp0998.bn臨近轉(zhuǎn)基因株系種植，并用作對照。zh11-tc水稻株系幼穗分化ii期停止?jié)菜珊抵练N子成熟期產(chǎn)生嚴(yán)重干旱脅迫。osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株抽穗前土壤體積含水量從48％降到12％，osusp1轉(zhuǎn)基因水稻抽穗后和zh11-tc水稻植株抽穗后分別出現(xiàn)一次降雨增加了土壤體積含水量(表4)。除dp0998.15.61水稻植株外，osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株的抽穗期比對照18～25天，dp0995.15.61株系比對照晚抽穗3天。最終，osusp1轉(zhuǎn)基因水稻比對照植株早成熟，而對照植株因為后期低溫不能夠完全成熟。osusp1轉(zhuǎn)基因水稻植株受到干旱脅迫的時間比zh11-tc和dp0158植株短。如表28所示，所有轉(zhuǎn)基因事件的單株籽粒產(chǎn)量高于對照植株。上述結(jié)果表明osusp1水稻在干旱脅迫后，單株籽粒產(chǎn)量高于對照。

表28.osusp1轉(zhuǎn)基因水稻在田間干旱條件下的產(chǎn)量分析