本發(fā)明涉及人工合成的pseudomonasveroniicip104663蛋白編碼基因及其應用，特別是涉及一種根據大腸桿菌偏好密碼子設計并合成的pseudomonasveroniicip104663蛋白編碼基因及其應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
：我們發(fā)現來源于pseudomonasveroniicip104663的氨基酸序列為序列表中序列2所示的pseudomonasveroniicip104663蛋白可以作為一種催化劑用于l-2-哌啶甲酸的合成。將編碼其的基因序列克隆到某一菌體中，從而通過這一重組菌體以全細胞催化劑的形式來實現其催化效果。但是用于其編碼的如序列表中序列1所示的野生型基因序列無法滿足上述需求。因此，為了更好地實現這一蛋白的催化效果，我們就需要提供一種方式，使其可以在某一菌體中高效表達。技術實現要素：首先我們選擇大腸桿菌作為用于高效表達pseudomonasveroniicip104663蛋白的菌體。并通過全基因合成的方法，對基因的二級結構以及密碼子偏好性進行調整，采用大腸桿菌偏好性密碼子對其進行優(yōu)化，從而實現大腸桿菌中的高效表達。具體來說我們利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)進行設計，并保證tm差異控制在3℃以內，引物長度控制在50base以內。按照設計好的引物合成，得到目標引物后，將獲得的引物加雙蒸水溶解后，加到如下的反應體系中，使得各引物的終濃度為30nm，首尾引物的終濃度為0.6μm。將配制好的pcr反應體系置于博日xpcycler基因擴增儀中，按下列程序進行擴增：98℃30s，60℃45s，72℃120s，35x。將pcr得到的dna片段進行切膠純化，利用同源重組的方法克隆進pet30a的ndei/xhoi位點。利用這一方法，我們獲得了如序列表中序列3所示的dna序列。其引物序列為：同時，含有所述dna分子的重組載體、大腸桿菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。其中重組載體既可以是克隆載體，也可以是表達載體。本發(fā)明中還要求保護含有所述dna分子的大腸桿菌作為全細胞催化劑的用途。特別是作為l-賴氨酸鹽酸鹽生物轉化制備l-2-哌啶甲酸這一反應的全細胞催化劑。采用含有所述dna分子的大腸桿菌后，形成了一高效率的生物催化體系?？梢蕴岣叩孜飈-賴氨酸鹽酸鹽投量，縮短反應時間，獲得高ee值的目標產物。附圖說明圖1為seqidno.3的表達質粒圖譜圖2為含有seqidno.3表達質粒的大腸桿菌的sds-page圖譜。圖3為生物轉化反應的tlc圖譜圖4為l-2-哌啶甲酸的hplc譜圖圖5為l-2-哌啶甲酸的ms譜圖具體實施方式為了更好的解釋本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明進行進一步的闡述。在本實施例中所用到的儀器、試劑，除非有特殊說明，均為市售產品。以下實施例中涉及到的tlc檢測中：展開劑：三氯甲烷：甲醇：水＝6:5:1，混勻后放置10min左右。硅膠板規(guī)格：薄層層析硅膠板5*10。顯色劑：茚三酮顯色100ml乙醇加入0.1g茚三酮，500ul冰乙酸混勻。以下實例中涉及到的lc-ms檢測條件為：prevailc18色譜柱(250×4.6mm，i.d.5μm)；柱溫：30℃；流動相：0.4％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0.5ml/min；檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器(elsd)；檢測器溫度：120℃；載氣：氮氣(純度99.9％)；載氣流速：4l/min；進樣體積：10μl。實施例1將pseudomonasveroniicip104663置于lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，控制溫度為28.0℃，180rpm培養(yǎng)3天，離心收集沉淀，用dna提取純化試劑盒qiaampkit(qiagen，germany)提取純化pseudomonasveronii基因組dna。用pfu高保真酶對pseudomonasveronii基因組dna進行pcr擴增，所用引物為pve-f5'atggtggcacagcgagcaac3'pve-r5'tcatgctaattttaaggtacggtcg3'由于pseudomonasveroniicip104663的dna的gc含量接近50％，故使用pfu高保真酶直接擴增。之后將擴增的片段用taq聚合酶72℃處理10分鐘，在dna3'端添加堿基a。之后將其連接到pmd19t-simple(takara寶生物公司，北京)克隆載體中，挑取單克隆送至南京金斯瑞生物進行測序。測序得到dna序列為seqidno.1，相應的氨基酸序列為seqidno.2。實施例2通過全基因合成的方法，對基因的二級結構以及密碼子偏好性進行調整，并且調整dna序列的gc含量到40％～60％，以實現在大腸桿菌中的高表達。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)進行設計，并保證tm差異控制在3℃以內，引物長度控制在50base以內，得到以下引物：合成上述引物，并將獲得的引物加雙蒸水溶解后，加到如下的反應體系中，使得各引物的終濃度為30nm，首尾引物的終濃度為0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反應體系總體積至50μl將配制好的pcr反應體系置于博日xpcycler基因擴增儀中，按下列程序進行擴增：98℃30s，65℃45s，72℃120s，35x。將pcr得到的dna片段進行切膠純化，利用同源重組的方法克隆進pet30a的ndei/xhoi位點。挑取單克隆進行測序。測序成功的dna序列為seqidno.3。實施例3挑取含有seqidno.3表達載體的大腸桿菌單菌落接種于10ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氫二鈉3.55g/l，磷酸二氫鉀3.4g/l，氯化銨2.68g/l，硫酸鈉0.71g/l，七水硫酸鎂0.493g/l，六水氯化鐵0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm過夜培養(yǎng)。次日取1l三角瓶，按1：100的接種比例接入到100ml高壓滅菌后的培養(yǎng)基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氫二鈉3.55g/l，磷酸二氫鉀3.4g/l，氯化銨2.68g/l，硫酸鈉0.71g/l，七水硫酸鎂0.493g/l，六水氯化鐵0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培養(yǎng)至菌體od5-6，立刻將三角瓶置于25℃搖床中，250rpm培養(yǎng)1小時。加iptg至終濃度0.1mm，并于25℃，250rpm繼續(xù)培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)液于4℃，12000g下離心20分鐘收集濕菌體。然后將菌體沉淀用蒸餾水清洗兩次，收集菌體，-70℃保存。同時取少量菌體進行sds-page檢測。結果見圖2，其中1道為蛋白上清，2道為包涵體。sds-page蛋白膠顯示，含有seqidno.3表達質粒的大腸桿菌表達量高，滿足生物轉化反應實驗的需要。實施例4加入0.1m磷酸鉀緩沖液(ph8.0)，65g/l含有seqidno.3表達質粒的菌體，60g/ll-賴氨酸鹽酸鹽，0.1mmnad，敞口反應，25℃，搖床轉速設為180rpm。反應中不斷取樣進行tlc檢測，當反應16小時時，檢測結果如圖3，結果顯示28小時生成大量產物，無底物殘余。對獲得的產物進行定量實驗，產物最終濃度為48.7g/l。同時取樣進行l(wèi)c-ms檢測，檢測結果如圖4，圖5所示。當我們在體系中加入l-賴氨酸的時候，其快速轉變?yōu)閘-賴氨酸鹽酸鹽，然后按照前述實施例的方式進行反應。sequencelisting<110>南京諾云生物科技有限公司<120>人工合成pseudomonasveroniicip104663蛋白編碼基因及其應用<130>2016<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1116<212>dna<213>pseudomonasveronii<400>1atggtggcacagcgagcaactattatcctctctgaggaaaacattggtgaaattgtcgca60gcagtcgggctcgacactttaatggatgaaacgattgcaaaactacgtgatgccctcaac120gtgtttggtgatggccaggttgaaatacaaccgcgcaccggctttgtctatgaaactccg180gaaatggggctgatagagtttatgccggcttaccgccgggataaaaatgtcgcgttaaaa240gttgttggctaccatccgggaaatccgtttaaccggggcatgccgacggtcatcgccact300aactccctatatgacgtaagggacggccaccttattgcggtgatcgatggtgtatttgca360acagcagtacgaacgggcgcagcatccgctgtggcttcgaagttgctggctcatcctgaa420agcaaaacccttgggctgatcggagctggcgccatggcagtgacccaggcccatgccctc480agtcgaatttatgactttgacgcagtcttgatccacgatattgaccccgcagtggaaaaa540actttcgccaagcgggtatccgccctgggaattacaccgatcatcgcttccaaagacagg600gtactggcagagtccgacatcatctgtgttgctacctccattggccttgatgcaggcccg660gttctccacgctggcgggatgaaaccacatgtacacatcaatgctattggtgccgacacg720ccgcgcaaatatgaattatcaacagagctgctcaaaagctcgttccttgtcacggattat780ctggaacaggccattaacgaaggtgaatgccagcaattgagtaaagacgaatacggctat840atcggccctgagttgcacaaaatagtgaaagagccgcaagcctatatccaatatcagatg900aaacagaccatctttgatagcaccggtatttcattggaagatcagataatgaccgaggtc960ttgatcgatcaggcggagagactagggcttggtcagcggatcctgattgaagcgggatgt1020gatgaccccatgaacccatatcttttctcaaattccgcgaacgctcttgataccgtcaag1080aatacagtgcacgaccgtaccttaaaattagcatga1116<210>2<211>371<212>prt<213>pseudomonasveronii<400>2metvalalaglnargalathrileileleuserglugluasnilegly151015gluilevalalaalavalglyleuaspthrleumetaspgluthrile202530alalysleuargaspalaleuasnvalpheglyaspglyglnvalglu354045ileglnproargthrglyphevaltyrgluthrproglumetglyleu505560ilegluphemetproalatyrargargasplysasnvalalaleulys65707580valvalglytyrhisproglyasnpropheasnargglymetprothr859095valilealathrasnserleutyraspvalargaspglyhisleuile100105110alavalileaspglyvalphealathralavalargthrglyalaala115120125seralavalalaserlysleuleualahisprogluserlysthrleu130135140glyleuileglyalaglyalametalavalthrglnalahisalaleu145150155160serargiletyrasppheaspalavalleuilehisaspileasppro165170175alavalglulysthrphealalysargvalseralaleuglyilethr180185190proileilealaserlysaspargvalleualagluseraspileile195200205cysvalalathrserileglyleuaspalaglyprovalleuhisala210215220glyglymetlysprohisvalhisileasnalaileglyalaaspthr225230235240proarglystyrgluleuserthrgluleuleulysserserpheleu245250255valthrasptyrleugluglnalaileasngluglyglucysglngln260265270leuserlysaspglutyrglytyrileglyprogluleuhislysile275280285vallysgluproglnalatyrileglntyrglnmetlysglnthrile290295300pheaspserthrglyileserleugluaspglnilemetthrgluval305310315320leuileaspglnalagluargleuglyleuglyglnargileleuile325330335glualaglycysaspaspprometasnprotyrleupheserasnser340345350alaasnalaleuaspthrvallysasnthrvalhisaspargthrleu355360365lysleuala370<210>3<211>1116<212>dna<213>人工序列<400>3atggttgctcagcgtgctaccatcatcctgtctgaagaaaacatcggtgaaatcgttgct60gctgttggtctggacaccctgatggacgaaaccatcgctaaactgcgtgacgctctgaac120gttttcggtgacggtcaggttgaaatccagccgcgtaccggtttcgtttacgaaaccccg180gaaatgggtctgatcgaattcatgccggcttaccgtcgtgacaaaaacgttgctctgaaa240gttgttggttaccacccgggtaacccgttcaaccgtggtatgccgaccgttatcgctacc300aactctctgtacgacgttcgtgacggtcacctgatcgctgttatcgacggtgttttcgct360accgctgttcgtaccggtgctgcttctgctgttgcttctaaactgctggctcacccggaa420tctaaaaccctgggtctgatcggtgctggtgctatggctgttacccaggctcacgctctg480tctcgtatctacgacttcgacgctgttctgatccacgacatcgacccggctgttgaaaaa540accttcgctaaacgtgtttctgctctgggtatcaccccgatcatcgcttctaaagaccgt600gttctggctgaatctgacatcatctgcgttgctacctctatcggtctggacgctggtccg660gttctgcacgctggtggtatgaaaccgcacgttcacatcaacgctatcggtgctgacacc720ccgcgtaaatacgaactgtctaccgaactgctgaaatcttctttcctggttaccgactac780ctggaacaggctatcaacgaaggtgaatgccagcagctgtctaaagacgaatacggttac840atcggtccggaactgcacaaaatcgttaaagaaccgcaggcttacatccagtaccagatg900aaacagaccatcttcgactctaccggtatctctctggaagaccagatcatgaccgaagtt960ctgatcgaccaggctgaacgtctgggtctgggtcagcgtatcctgatcgaagctggttgc1020gacgacccgatgaacccgtacctgttctctaactctgctaacgctctggacaccgttaaa1080aacaccgttcacgaccgtaccctgaaactggcttaa1116當前第1頁12