本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種布魯氏菌104m疫苗株敲除omp25基因的重組菌及應用。

背景技術：

布魯氏菌病是由布魯氏菌(brucella)感染引起的一種慢性傳染性疾病，也是世界范圍內(nèi)危害公共衛(wèi)生安全的重大人畜共患傳染病。在家畜中，牛、羊、豬最常發(fā)生，且可傳染給人和其他家畜，其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起母畜流產(chǎn)、公畜不育和各種組織的局部病灶，患病的牛、羊、豬、犬等也是人類布魯氏菌病的主要傳染源。人感染布魯氏菌病可以引起發(fā)熱、關節(jié)痛、疲乏無力，部分患者轉(zhuǎn)為難以治愈的慢性病人。布魯氏菌病在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，自2000年以后，我國人畜布魯氏菌病發(fā)病率逐年上升，對畜牧業(yè)發(fā)展帶來巨大危害，同時給我國公共衛(wèi)生安全帶來了巨大威脅，防控形勢十分嚴峻。布魯氏菌病的疫苗免疫是控制布病的有效方法，但是目前我國使用的人布魯氏菌疫苗104m的安全性還存在很多問題。

全球預防動物布魯氏菌感染的疫苗主要有s19、rev1和rb51。人用布魯氏菌疫苗為ba-19(br.abortus縮寫)和104m(mockba的縮寫)菌苗。1923年美國人buck從牛體中分出一株牛種19號弱毒菌種，制成獸用19活菌苗。1946年蘇聯(lián)研究人員從19號菌種的變異菌落中選出一種純系光滑型菌體，稱之為ba-19菌苗，1951年正式用于人群接種。104m菌苗是上世紀五十年代，在蘇聯(lián)中部地區(qū)病牛的胎盤中分離出一株牛種菌，該菌種編號為104m(mockba的縮寫)。小量豚鼠實驗證明該菌種對動物的免疫原性優(yōu)于ba-19，毒力較ba-19強，在之后的十余年中蘇聯(lián)學者利用實驗動物和家畜對104m進行了大量的研究，并少量用于人體的研究，證明它在一定條件下使用，對人和動物有效。我國引用該菌種后，于1959年-1965年進行了系統(tǒng)的研究，證明對人群預防布魯氏菌病感染有效，優(yōu)于ba-19菌種。1965年我國正式批準生產(chǎn)人用皮上劃痕104m布魯氏菌活疫苗。但是，使用過程中發(fā)現(xiàn)104m菌苗和ba-19一樣，能使被接種的機體產(chǎn)生過敏反應，表現(xiàn)局部皮試敏感性增高及出現(xiàn)某些臨床癥狀，存在著一些嚴重的問題而逐漸不被使用。其主要問題為：一、接種采用皮膚劃痕的方法，不僅疼痛而且讓人難以接受；二、因其是弱毒疫苗株，接種后副反應也較大，可致接種人員感染；三、免疫后與自然感染無法區(qū)分，嚴重地影響著對布病的診斷與檢疫工作。

布魯氏菌的毒力因子與布魯氏菌病的發(fā)病及免疫機制、治療及預防等均關系密切。由于現(xiàn)代分子生物學領域的不斷進步，對布魯氏菌毒力因子的認識也逐漸深化。目前公認的布魯氏菌毒力相關因子有：脂多糖合成基因、bvrr/bvrs雙組分調(diào)控蛋白基因、 iv型分泌系統(tǒng)、h2o2酶基因、超氧歧化酶基因、外膜蛋白、熱休克蛋白等。

外膜蛋白不僅是布魯氏菌的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，而且也是布魯氏菌重要的抗原和毒力因子。對外膜蛋白及其基因的深入研究是十分重要，可以為布魯氏菌病的診斷、分型和新型疫苗的研制提供理論上的支持。omp25是ompa家族成員之一，屬于布魯氏菌第3組外膜蛋白omp25/omp31家族中的一員，是布魯氏菌的重要外膜蛋白，在維持細菌外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用。

基因缺失疫苗作為新型的基因工程疫苗之一，對預防和控制布病具有廣闊的研究前景。目前布魯氏菌弱毒疫苗株是實踐應用中控制布魯氏菌最有效的疫苗，但多數(shù)疫苗表現(xiàn)出一定的毒性，當在懷孕前使用會引起流產(chǎn)，并且免疫所產(chǎn)生的抗體難以與自然感染區(qū)別。因此，急需研制一種能夠用于人的安全、有效免疫的布魯氏菌疫苗。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種重組菌。

本發(fā)明提供的重組菌，為降低和/或抑制布魯氏菌104m中omp25蛋白活性得到的菌。

上述重組菌中，所述降低和/或抑制布魯氏菌104m中omp25蛋白活性為抑制或沉默布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因的表達。

上述重組菌中，所述抑制或沉默布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因的表達為敲除布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因。

上述重組菌中，所述敲除布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因為將布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因替換為抗性基因。

上述重組菌中，所述布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因替換為抗性基因均采用基因組定點編輯或同源重組的方式進行；

所述同源重組具體為λ-red同源重組或sacb基因介導篩選的同源重組或自殺質(zhì)粒介導的同源重組。

上述重組菌中，所述布魯氏菌104m中omp25蛋白編碼基因替換為抗性基因為將含有抗性基因的同源重組片段導入布魯氏菌104m中；

所述含有抗性基因的同源重組片段包括omp25蛋白編碼基因上游同源臂、抗性基因和omp25蛋白編碼基因下游同源臂。

上述重組菌中，所述含有抗性基因的同源重組片段通過重組載體導入布魯氏菌104m中；

所述重組載體為將含有抗性基因的同源重組片段插入表達載體得到的載體。

上述重組菌中，所述抗性基因為kan；

所述含有所述抗性基因的同源重組片段的核苷酸序列為序列1。

上述的重組菌在制備如下1)-6)中任一種產(chǎn)品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍：

1)、布魯氏菌減毒疫苗；

2)、布魯氏菌疫苗；

3)、促進淋巴細胞增值產(chǎn)品；

4)、促進cd3+、cd4+和/或cd8+細胞增加產(chǎn)品；

5)、提高cd4+細胞與cd8+細胞的數(shù)量比產(chǎn)品；

6)、降低細胞因子il-2、il-4和/或inf-γ的含量產(chǎn)品。

本發(fā)明另一個目的是提供一種如下1)-6)中任一種產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為上述的重組菌；

1)、布魯氏菌減毒疫苗；

2)、布魯氏菌疫苗；

3)、促進淋巴細胞增值產(chǎn)品；

4)、促進cd3+、cd4+和/或cd8+細胞增加產(chǎn)品；

5)、提高cd4+細胞與cd8+細胞的數(shù)量比產(chǎn)品；

6)、降低細胞因子il-2、il-4和/或inf-γ的含量產(chǎn)品。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明經(jīng)過敲除布魯氏菌104m的毒力基因omp25得到重組菌，通過對其毒力和免疫原性的研究，篩選出毒力減弱且保持免疫原性的布魯氏菌減毒疫苗候選株△omp25。

附圖說明

圖1為kan基因的pcr產(chǎn)物。

圖2為omp25基因上、下游同源臂的pcr擴增。

圖3為融合pcr擴增打靶片段omp25::kan電泳圖。

圖4為敲除載體菌液pcr的鑒定結(jié)果。

圖5為突變株的篩選結(jié)果。

圖6為△omp25缺失株連續(xù)穩(wěn)定傳代pcr鑒定結(jié)果。

圖7為布魯氏菌特異性引物的pcr鑒定。

圖8為不同免疫劑量感染小鼠結(jié)果。

圖9為菌株免疫后小鼠體溫、體重變化。

圖10為小鼠感染后脾重及脾指數(shù)變化情況。

圖11為小鼠感染后平均克脾含菌數(shù)。

圖12為菌株特異性毒性生存率分析結(jié)果。

圖13為基因缺失對菌株誘導機體抗體水平消長水平的影響。

圖14為小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化結(jié)果。

圖15為淋巴細胞轉(zhuǎn)化結(jié)果。

圖16為抗原特異性脾淋巴細胞增殖實驗。

圖17為小鼠脾淋巴細胞上清細胞因子含量檢測。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

布魯氏菌疫苗株104m由蘭州生物制品有限公司提供；大腸桿菌dh5α(escherichiacolidh5α)、phsg298質(zhì)粒載體、pmd-19tsimplevector均購自takara公司；胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基購自美國bd公司。清潔級balb/c小鼠(雌性)購自北京軍科院動物中心。

下述實施例1中主要試劑的配制：

(1)amp儲存液(100mg/ml)：取1g氨芐西林溶于5ml去離子水中，定容至10ml，用0.22μm濾膜過濾，分裝成每管1ml，保存于－20℃冰箱。

(2)kan儲存液(100mg/ml)：取1g硫酸卡那霉素溶于5ml去離子水中，定容至10ml，用0.22μm濾膜過濾，分裝成每管1ml，保存于－20℃冰箱。

(3)lb液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨2g，酵母粉1g，氯化鈉2g，加蒸餾水200ml混勻，121℃滅菌20min。

(4)lb固體培養(yǎng)基：lb液體培養(yǎng)基加入1.5％瓊脂粉，121℃滅菌20min。

(5)tsb液體培養(yǎng)基：稱取tsb粉末6g，加蒸餾水混勻定容至200ml，115℃滅菌15min。

(6)tsa固體培養(yǎng)基：tsb液體培養(yǎng)基中加入1.5％瓊脂，115℃滅菌15min。

(7)75％甘油：量取75ml丙三醇，加入25ml蒸餾水，充分混勻，121℃滅菌20min。

cck8細胞增殖檢測試劑盒購自美國promega公司；鼠源的ifn-γ、il-2、il-4細胞因子檢測試劑盒，小鼠淋巴細胞分離液均購自深圳達科為生物技術有限公司；細胞培養(yǎng)液rpmi1640、胎牛血清購自gibco公司；雙抗購自hyclone公司；牛血清白蛋白購自北京索萊寶科技有限公司；hrp標記山羊抗小鼠igg購自美國earthox公司；可溶型單組分tmb底物溶液購自天根生化科技有限公司；抗小鼠cd3epercpcyanine5.5、抗小鼠cd4fitc、抗小鼠cd8ape抗體購自美國ebioscience公司；紅細胞裂解液、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基購自美國bd公司；常規(guī)化學試劑購自軍事醫(yī)學科學院條件處，均為國產(chǎn)分析純。

下述實施例2主要試劑的配制：

(1)包被液：稱量na2co31.59g，nahco32.93g，加入900ml蒸餾水，調(diào)節(jié)ph值至9.6，加蒸餾水定容至1000ml，4℃保存。

(2)洗滌液：1l的pbs液中加入1mltween～20混勻4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)封閉液：稱取5gbsa，加入500ml蒸餾水，制備濃度為1％的bsa溶液。

(4)終止液：量取355.6ml蒸餾水，緩慢滴加44.4ml濃硫酸，并不斷攪拌，配成2mol/l硫酸溶液。

(5)細胞培養(yǎng)液：400mlrpmi1640、25ml胎牛血清、10ml雙抗，加入rpmi1640定量至500ml，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存。

下述實施例檢測所需方法

1、活菌計數(shù)

將布魯氏菌104m菌株，轉(zhuǎn)接到無抗性tsb液體培養(yǎng)基中，180rpm/min，37℃空氣搖床震蕩培養(yǎng)至細菌開始渾濁，用紫外分光光度計測其od600值，分別收集0.3-0.8對數(shù)期間的菌液，并將菌液稀釋成10¹-10⁶梯度的菌懸液取0.1ml涂在無抗性tsa固體培養(yǎng)基上，計算出每毫升總活菌數(shù)。(每毫升總活菌數(shù)＝稀釋度菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10)

2、統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用graphpadprism5和spss17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析。p<0.05為差異顯著，p<0.01為差異極顯著，p>0.05為差異不顯著。

實施例1、敲除布魯氏菌疫苗株104m的omp25基因

在本研究中以克隆載體pmd19-tvector(以下簡稱t載體)作為載體來構(gòu)建布魯氏菌的插入失活突變株。在此基礎上構(gòu)建了帶有卡那抗性基因的pmd19-t質(zhì)粒，采用抗性基因替換的方法來構(gòu)建布魯氏菌的缺失突變株，這種方法避免了載體的影響，而且只需要一次抗性篩選即可得到突變株。采用融合pcr的方法，將待缺失基因上下游的同源臂與卡那霉素抗性基因融合起來，構(gòu)建打靶片段，其中抗性基因位于基因上下游同源臂之間。然后將打靶片段連接到t載體，構(gòu)建突變載體，進而獲得布魯氏菌的缺失突變株。

1、引物的設計與合成

根據(jù)布魯氏菌疫苗株104m全基因組測序結(jié)果，設計擴增omp25基因的上、下游同源臂序列。用primer5.0軟件遵循gc含量約占50％原則，長度均約為40個堿基。同時引用鑒別布魯氏菌種屬特異性引物，分析并設計特異性引物(見表1)。引物由北京賽百盛生物科技公司合成。

表1為目的基因上、下游同源臂基因及鑒定引物序列

2、敲除載體的構(gòu)建

以帶有kan^r抗性的phsg298質(zhì)粒為模板，用引物k1、k2擴增得到950bp卡那霉素抗性基因kan(圖1)；

以布魯氏菌104m菌液為模板，使用引物o1、o2擴增得到820bpomp25基因上游同源臂omp25-u，用引物o4、o5擴增834bpomp25基因下游同源臂omp25-d(圖2，m：dl2000dnamarker；1：omp25基因上游同源臂pcr產(chǎn)物；2：omp25基因下游同源臂pcr產(chǎn)物)；

將omp25-u、omp25-d和kan純3個片段化產(chǎn)物(50ng/μl)按1：1：1濃度等量混合作為融合擴增模板進行如下融合pcr反應：融合pcr反應體系為：模板3μl，dntp1μl，q5high-fidelitydnapolymerase0.3μl，5×q5reactionbuffer4μl，ddh2o加至終體積20μl。反應條件：95℃3min，95℃1min，65℃1min，72℃1min，10個循環(huán)。得到的pcr反應液命名為pcr-a。將pcr-a反應液稀釋10倍作為模板，進行pcr擴增。反應體系：模板3μl，dntp1μl，o1(20μmol/l)1μl，o5(20μmol/l)1μl，lataqdnapolymerase0.5μl，10×buffer2.5μl，ddh2o加至終體積25μl。反應條件：95℃5min，95℃30s，55℃1min，72℃3min，35個循環(huán)后72℃10min延伸4℃保存。得到2604bppcr產(chǎn)物(圖3)。

將pcr產(chǎn)物進行dna瓊脂糖凝膠電泳并切膠純化，所得到的打靶片段命名為：omp25::kan。

經(jīng)過測序，打靶片段omp25::kan的核苷酸序列為序列1，其中序列1第1-820位為omp25基因上游同源臂omp25-u、序列1第821-1770位為卡那霉素抗性基因kan、序列1第1771-2604位為omp25基因下游同源臂omp25-u。

將打靶片段omp25::kan直接與pmd19t載體連接，得到重組質(zhì)粒pmd19t-omp25::kan，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，用o1和o5進行菌落pcr鑒定，鑒定大小為2604bp(如圖4)。

經(jīng)過測序，重組質(zhì)粒pmd19t-omp25::kan為將序列表中序列1所示的打靶片段與pmd19t載體進行ta連接，得到的質(zhì)粒。

3、重組菌的獲得

將3μl重組質(zhì)粒pmd19t-omp25::kan(200ng/pl)和48μl104m菌株的感受態(tài)細胞，混勻后加入預冷的0.1ml電擊杯中，使用bio－radgenepulser電轉(zhuǎn)儀，按1.8kv、25μf、200ohms條件電穿孔轉(zhuǎn)化。電擊后立即加入1ml無抗性tsb液體培養(yǎng)液。37℃震動培養(yǎng)6h涂布于kan抗性tsa固體平板，生長的為陽性克隆。

將陽性克隆提取基因組dna，用目的基因omp25鑒定引物(引物為626)進行pcr驗證，以野生型104m菌株作為陰性對照；

結(jié)果如圖5所示，m：dl250dnamarker；1-5：篩選的重組菌落克?。?：野生型104m菌落對照；得到1423bp的陽性克隆為重組菌，其擴增出的片段比野生株擴增出片段(626bp)大，則說明重組菌構(gòu)建正確，命名為△omp25(以下簡稱△omp25，又稱為104m突變株)。

重組菌△omp25為將kan基因替換104m基因組中omp25基因得到的重組菌。4、重組菌的檢測

1)遺傳穩(wěn)定性試驗

將重組菌△omp25在無抗性tsb液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，記錄并保存每一代菌液，存放到－80℃。對104m菌株、△omp25菌株第1代、△omp25菌株第10代及△omp25菌株第20代菌液進行pcr驗證(引物為626)，結(jié)果如圖6，m：dl2000dnamarker；1：野生型104m菌落對照；2-24：△omp25第1-23代傳代菌株，野生型陰性條帶片段大小為：626bp；傳代菌株條帶片段大小均為：1423bp。

與此同時，對布魯氏菌omp25基因突變株△omp25第1代、△omp25第10代及△omp25第20代菌株進行測序驗證，利用dnaman軟件將104m株與omp25基因序列比對，omp25基因與親本株同源性為100％；kan基因序列與△omp25第1代、第10代及第20代菌株測序結(jié)果比對，同源性為100％。

可以看出，抗性基因成功替換了目的基因，并且連續(xù)傳至第20代也穩(wěn)定存在。

2)菌株的pcr鑒定

將△omp25菌株連續(xù)傳代的培養(yǎng)物采用布魯氏菌鑒定引物進行菌種鑒定(引物為699和279)。

結(jié)果如圖7所示，圖7a為引物699的擴增產(chǎn)物，大小為699bp，圖7b為引物279 的擴增產(chǎn)物，大小為279bp；m：dl2000dnamarker；1：野生型菌落對照；2-24：104m△omp25第1-23連續(xù)穩(wěn)定傳代菌株；可見，重組菌△omp25突變株與104m有同樣的特征條帶。說明篩選到的突變菌株來自出發(fā)菌株，而非其他污染。

3)培養(yǎng)特性的鑒定

將布魯氏菌104m菌株、△omp25菌株第1代、△omp25菌株第10代及△omp25菌株第20代保存菌種接種于無抗性tsb液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm/min空氣搖床震蕩培養(yǎng)2d，收集菌體，制成2.5×10⁹cfu/ml的菌懸液分別取100μl涂在含有1:1000的品紅和硫堇的無抗性tsa固體培養(yǎng)基上。在37℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3d，觀察細菌生長情況。

結(jié)果如表2所示，品紅平板有細菌生長，硫堇培養(yǎng)基沒有細菌生長。

表2菌株培養(yǎng)特性鑒定結(jié)果

“+”：有細菌生長；“－”：沒有細菌生長

4)菌株的變異檢查

用生理鹽水將新鮮培養(yǎng)物104m菌株、△omp25菌株第1代、△omp25菌株第10代及△omp25菌株第20代保存的菌液接種于無抗性tsb液體培養(yǎng)基中，制成含菌2.5×10⁹-3.0×10⁹/ml的菌懸液，置90℃水浴30min，觀察凝集現(xiàn)象；同時取相同濃度的菌懸液與1:1000三勝黃素水溶液等量混合，于37℃放置24h，觀察凝集現(xiàn)象。

結(jié)果如表3所示，親本株104m與△omp25菌株第1代、△omp25菌株第10代及△omp25菌株第20代均沒有產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。

表3菌株培養(yǎng)特性檢查結(jié)果

“+”：凝集；“－”：不凝集

實施例2、omp25基因缺失株△omp25對細菌毒力及免疫原性的影響

一、免疫方案

1、免疫劑量的確定

為選取一個合適的感染劑量，將1×10⁵-1×10⁸cfu/ml的104m菌液通過腹腔接種方式感染小鼠，在感染后不同時間點(4-8天)處死小鼠，分離脾臟，涂板計算平均脾臟重量及平均克脾含菌數(shù)(脾指數(shù)＝脾重(mg)/小鼠體重(g)；克脾菌數(shù)＝小鼠脾總含菌數(shù)/脾重)。

小鼠免疫104m菌株感染后4-8天觀察并處死小鼠，分離脾臟，涂板計數(shù)(見圖8)。陰性對照組的小鼠脾臟中一直沒有分離到細菌。10⁸組在感染后第4天脾臟菌量達高峰，然后開始下降；10⁷組在感染后第6天脾臟菌量達高峰，然后開始下降。10⁸組的小鼠雖沒有死亡，但出現(xiàn)明顯的精神萎靡，被毛逆立。布魯氏菌對動物的毒力主要表現(xiàn)為其在體內(nèi)的生存能力，評價指標主要是比較細菌在體內(nèi)的定植和復制能力，因此過高或過低的感染劑量均不能正確反映細菌對小鼠的毒力。因此，選取了10⁷cfu/ml的感染菌量。

將布魯氏菌104m、△omp25菌株涂布于無抗性tsa固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)4d后，挑取單菌落接種于無抗性tsb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期(od600：0.435)將菌液5000r/min離心2min后，棄上清，用pbs液洗滌重懸菌體3次，最終將菌體重懸于pbs中，分裝1ml在1.5ml離心管中，用pbs稀釋含菌為5×10⁷cfu/ml，即為布魯氏菌104m免疫用疫苗和△omp25菌株免疫用疫苗。

2、動物的免疫及分組

(1)分組方案：6-8周齡balb/c雌性小鼠，各實驗(包括安全性實驗、體液免疫實驗、細胞免疫實驗)隨機分3組，每組5只。

(2)免疫方案：

104m組：布魯氏菌104m免疫用疫苗，免疫劑量1×10⁷cfu/只；

△omp25組：△omp25菌株免疫用疫苗，免疫劑量1×10⁷cfu/只；

空白對照組：pbs免疫200μl/只。

(3)免疫方式：小鼠腹腔注射。

二、毒性檢測

1、皮毛、體重、體溫檢測

將104m組、△omp25組和pbs組分別免疫小鼠，觀察小鼠皮毛體態(tài)、體溫并記錄2周平均體重、體溫。

結(jié)果如圖9所示，a為免疫后小鼠體重；b為免疫后小鼠體溫；顯示104m組、△omp25組和pbs組小鼠表現(xiàn)正常，無明顯異常?！鱫mp25組小鼠與104m組小鼠體重無顯著差 異，均顯著低于空白對照pbs組。而各組體溫之間無明顯變化。檢測各組小鼠平均體重(見圖9a)，各組小鼠平均體溫變化情況(見圖9b)。

2、脾指數(shù)和克脾菌數(shù)計算

從第1-10周分別取各組小鼠斷頸處死，在75％酒精中浸泡5min，無菌取脾稱重，計算平均脾指數(shù)，脾指數(shù)＝脾重(mg)/小鼠體重(g)。

104m組及△omp25組小鼠平均脾重相比于空白對照組有顯著差異(p<0.01)。小鼠脾重和脾臟指數(shù)呈正相關，突變株與親本株組小鼠感染后1周內(nèi)小鼠脾重變化較大，均在第2周達到最高值，5周后呈下降趨勢，第7周后脾重趨勢逐漸穩(wěn)定，突變株△omp25感染的小鼠脾臟重量于親本株104m差異顯著(p<0.05)(見圖10a)。進而結(jié)合脾指數(shù)結(jié)果看，第3周后，△omp25突變株脾指數(shù)與親本株相比差異顯著(p<0.05)(見圖10b)。

感染后分別于1-10周分別取小鼠，斷頸、消毒、取脾、研磨，用pbs液適當稀釋脾臟研磨組織梯度涂無抗性tsa固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～6d，計算長出單菌落。最后計算平均克脾菌數(shù)，克脾菌數(shù)＝小鼠脾總含菌數(shù)/脾重。

通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)，感染10周后，突變株△omp25與親本對照組表現(xiàn)差異顯著(p<0.01)(圖11)。pbs空白對照組無細菌生長。親本株104m與△omp25突變株在感染后前四周的菌落數(shù)無顯著差異，第五周后，親本株無下降趨勢而突變株感染的脾菌數(shù)菌呈下降趨勢，到第十周親本菌株104m和△omp25突變株的平均脾菌數(shù)差異顯著(p<0.05)，說明突變株△omp25的毒力較親本104m顯著下降。

3、特異性毒性檢測

根據(jù)《皮上劃痕人用布氏菌活疫苗規(guī)程－中華人民共和國藥典2010年版三部》對新布魯氏菌疫苗株的鑒定中的特異性毒性試驗規(guī)定。

104m組：小鼠皮下注射0.5ml1.0×10⁹/ml布魯氏菌104m；

△omp25組：小鼠皮下注射0.5ml1.0×10⁹/ml△omp25菌株；

空白對照組：小鼠皮下注射0.5mlpbs。

每組用體重18～20g小鼠6只。

觀察7天死亡情況。

結(jié)果如圖12所示，pbs組小鼠全部存活，體重精神狀態(tài)情況良好。104m組小鼠第2天體重嚴重下降，被毛直立，精神狀態(tài)萎靡，眼睛緊閉。104m組小鼠在第1天有死亡情況，僅有1只小鼠存活?！鱫mp25組在第1天及第2天有小鼠死亡，第7天時有2只小鼠存活。通過對兩組存活率分析結(jié)果顯示，△omp25株毒力略小于104m株。

三、免疫原性檢測

1、體液免疫檢測

在免疫后第1周至第10周斷尾采集104m組、△omp25組和pbs組小鼠血，全血室溫放置2h后，4℃，8000r/min離心10min，收集上層血清，用間接elisa法檢測小鼠血清特異性igg水平，步驟如下：

(1)抗原處理：將布魯氏菌104菌株接種于無抗性tsb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2d，收集菌體，一部分適當稀釋涂板計數(shù)，其余用pbs液重懸，于80℃加熱滅活處理2h。

(2)包被抗原：將處理的重懸菌8000r/min離心2min，棄上清，用包被液充分重懸并稀釋到1×10⁷cfu/ml，再包被于96孔elisa平板，100μl/孔，37℃放置2h后4℃包被過夜(包被的elisa板可于4℃保存1周)。

(3)洗板：棄去包被液，拍干，加入250μl洗滌液(pbst)靜置1min，棄去洗滌液，拍干，重復3次。

(4)封閉：加入封閉液，100μl/孔，37℃封閉1h。

(5)洗板：重復步驟(3)。

(6)加一抗：將待測血清按1:200到1:12800倍比稀釋，100μl/孔，37℃孵育1h。

(7)洗板：重復步驟(3)。

(8)加二抗：將hrp標記山羊抗小鼠igg抗體用pbs按1:5000稀釋，100μl/孔，37℃孵育1h。

(9)洗板：重復步驟(3)。

(10)顯色：加入可溶型單組分tmb底物溶液，100μl/孔，37℃避光顯色15min。

(11)終止：加入終止液，100μl/孔，輕輕搖晃1min。

(12)讀數(shù)：先將酶標儀預熱15min，在15min內(nèi)讀取elisa平板數(shù)值(波長450)。

(13)分析：結(jié)果數(shù)據(jù)處理。

采用elisa方法檢測igg抗體效價，取測波長450nm處效價為縱坐標，取樣時間為橫坐標，繪制抗體消長曲線(見圖13)。親本株與突變株免疫小鼠2周后，小鼠血清中igg水平逐漸上升，到第10周也未見抗體水平明顯下降。從變化趨勢上看，免疫第5周時，親本104m和突變株△omp25免疫小鼠的抗體效價與突變株無明顯差異；而免疫第6周，突變株抗體效價水平顯著高于親本株(p<0.05)。

2、細胞免疫檢測

1)、小鼠脾淋巴細胞的制備

(1)取104m組、△omp25組和pbs組免疫第4周小鼠眼球取血后，斷頸處死，用75％酒精浸泡5min，無菌取脾。

(2)無菌條件下在35mm培養(yǎng)皿中加入4ml小鼠淋巴細胞分離液，蓋一層200目尼龍篩網(wǎng)，將脾臟放于篩網(wǎng)上，用注射器活塞小心研磨脾臟，直至充分溶解于液體。

(3)吸取脾細胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管，并緩緩加入500μlrpmi1640培養(yǎng)液(含10％血清)，室溫1200r/min離心10min。

(4)從液面頂部輕輕吸取800μl液體，轉(zhuǎn)移至另一15ml離心管，加入10mlrpmi1640培養(yǎng)液，1000r/min離心5min，棄上清。

(5)加入4ml紅細胞裂解液，輕輕混勻，室溫靜置15min，使紅細胞破碎裂解，1000r/min離心5min，棄上清。

(6)加入10mlrpmi1640培養(yǎng)液沖洗，1000r/min離心5min，棄上清，重復2次。

(7)最后將細胞重懸于2mlrpmi1640培養(yǎng)液中，用細胞計數(shù)器稀釋進行計數(shù)，并調(diào)整細胞濃度至5×10⁷cfu/ml，備用，為104m組脾淋巴細胞、△omp25組脾淋巴細胞和pbs組脾淋巴細胞。

2)、抗原特異性淋巴細胞增殖試驗(cck8法)

分別將5×10⁶個/ml104m組脾淋巴細胞、△omp25組脾淋巴細胞和pbs組脾淋巴細胞稀釋液100μl加入到96孔培養(yǎng)板中，加入100μl5×10⁷cfu/ml的滅活抗原(滅活104m)，陰性對照為rpmi1640培養(yǎng)基，空白為不含細胞和抗原的rpmi1640培養(yǎng)基。37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。加入20μl的cck8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，測波長450nm值。

is＝(od－od1640)/(odpbs－od1640)

結(jié)果如圖16所示，用滅活抗原去刺激104m組脾淋巴細胞、△omp25組脾淋巴細胞和pbs組脾淋巴細胞，經(jīng)cck8法檢測后，計算si。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，突變株和親本對照組均能刺激小鼠淋巴細胞增殖，且△omp25突變株刺激小鼠淋巴細胞增殖能力高于與親本對照組。

上述結(jié)果表明，δomp25的免疫原性略高于親本株104m。

3)、omp25缺失對菌株誘導淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響

(1)將104m組脾淋巴細胞、△omp25組脾淋巴細胞和pbs組脾淋巴細胞分別用rpmi1640培養(yǎng)液稀釋至5×10⁶個/ml。

(2)取1ml脾細胞懸液，1200r/min離心10min，吸出900μl上清，剩余液用槍頭輕輕混勻。

(3)加入抗小鼠cd3epercpcyanine5.50.25μl、抗小鼠cd4fitc0.5μl、抗小鼠cd8ape0.5μl抗體，4℃避光孵育1h(其中陰性對照組分別加入3種熒光抗體，用于流式細胞儀的校對)。

(4)加入1mlpbs洗滌，1200r/min離心10min，棄上清。

(5)加入1mlpbs洗滌，1200r/min離心10min，棄上清。用300μlpbs重懸。

(6)用流式細胞儀(型號：facscalibur，美國bd公司)進行檢測。

104m組脾淋巴細胞、△omp25組脾淋巴細胞和pbs組脾淋巴細胞采用cd3、cd4、cd8熒光標記抗體進行標記，將標記后的細胞采用流式細胞儀進行計數(shù)，測定cd3+、cd4+、cd8+的免疫細胞數(shù)，并計算cd4+/cd8+的值。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，突變株和親本對照組免疫后小鼠淋巴細胞分化均發(fā)生變化，均能引起cd3+、cd4+、cd8+細胞增加(如圖15，a為pbs引起的cd4+細胞，b為pbs引起的cd8+細胞，c為104m引起的cd4+細胞，d為104m引起的cd8+細胞，e為△omp25引起的cd4+細胞，f為△omp25引起的cd8+細胞)。從cd4+/cd8+的結(jié)果看來(圖14)，△omp25突變株顯著高于104m親本株。

上述結(jié)果表明，δomp25的免疫原性高于親本株104m。

4)、細胞因子檢測

(1)將104m組脾淋巴細胞、△omp25組脾淋巴細胞和pbs組脾淋巴細胞用rpmi1640培養(yǎng)液(5％血清)稀釋至5×10⁶個/ml。

(2)取1.9ml細胞懸液加入24孔細胞培養(yǎng)皿中，加入100μl相應抗原刺激(為5×10⁷cfu/ml，使其每孔抗原終濃度達到與免疫劑量等同)，同時設空白對照組。

(3)將細胞培養(yǎng)皿置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48h。

(4)根據(jù)小鼠細胞因子elisa檢測試劑盒說明書步驟操作。

(5)統(tǒng)計數(shù)據(jù)并繪制相關圖表。

免疫小鼠后，取脾淋巴細胞培養(yǎng)，體外檢測了部分重要的免疫相關細胞因子ifn-γ，il-2，il-4。通過elisa分析inf-γ，il-2和il-4含量。

結(jié)果如圖17所示，表明，親本株104m誘導的細胞因子il-2高于δomp25突變株(圖17a)；與親本株104m相比δomp25突變株誘導的il-4降低(圖17b)；親本株104m誘導的細胞因子inf-γ高于δomp25突變株(圖17c)。