本發(fā)明屬于植物蛋白和植物抗除草劑領域。具體而言，本發(fā)明涉及水稻的乙酰乳酸合成酶(ALS)突變蛋白，該蛋白能賦予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑的特性。本發(fā)明公開了該蛋白的序列，以及它們在植物抗除草劑領域中的應用。

背景技術：
雜草是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的不利因素。與傳統(tǒng)依靠栽培措施、人工除草和機械除草等方法相比，化學除草劑的使用是一種高效的、簡便的和經(jīng)濟的治理雜草方法。乙酰乳酸合成酶(ALS)(也稱乙酰羥酸合成酶，AHAS；EC4.1.3.18)抑制劑類除草劑以ALS作為靶標而導致雜草死亡，主要包括磺酰脲類(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮類(Imidazolinones,IMI)、三唑嘧啶類(Triazolopyrimidines,TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸類[Pyrimidinylthio(oroxy)–benzoates,PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮類(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones,SCT)等13類化合物。ALS抑制劑類除草劑具有選擇性強、殺草譜廣、低毒高效等特點，目前已大面積推廣使用。但這些除草劑對一般不具有抗(耐)除草劑特性的農(nóng)作物本身也產(chǎn)生藥害，極大限制了其使用時間和使用空間，如需要在農(nóng)作物播種前一段時間使用除草劑才能避免農(nóng)作物遭受藥害。培育抗(耐)除草劑作物品種可減少作物藥害、拓寬除草劑的使用范圍。成熟的ALS蛋白大約由670個氨基酸組成，其序列在不同物種間高度保守。ALS蛋白在Gly95、Ala96、Ala122、Pro171、Pro196、Pro197、Ala205、Asp376、Trp537、Trp548、Trp552、Trp557、Trp563、Trp574、Ser621、Ser627、Ser638、Ser653、Gly654、Val669等氨基酸位點(以模式植物擬南芥的ALS氨基酸位置計算)發(fā)生突變可以產(chǎn)生ALS抑制劑類除草劑抗性，這在多種農(nóng)作物(包括玉米、小麥、水稻、油菜、向日葵等)、模式植物擬南芥和上百種雜草中均有報道。其中，水稻已知的抗ALS抑制劑突變位點包括Gly95、Ala96、Ala122、Trp548、Ser627、Ser653和Gly654。ALS突變體抗除草劑水平與ALS氨基酸突變的位置有關，還與突變后的氨基酸種類及突變氨基酸的數(shù)目有關。目前，ALS抑制劑類除草劑的作用機理尚未確定，很難提前預測ALS蛋白其它氨基酸位點的突變是否會產(chǎn)生除草劑抗性，只能依賴于科研人員長期、艱苦的實踐探索，并憑借一些運氣才可能發(fā)現(xiàn)ALS蛋白新的除草劑抗性位點。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是提供一種ALS突變型基因。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述ALS突變型基因所編碼的ALS蛋白。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了含有上述的ALS突變型基因的表達盒、重組載體或細胞。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了上述ALS突變型基因、蛋白、表達盒、重組載體或細胞在制備綠色植物除草劑方面的應用。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了獲得具有除草劑抗性的綠色植物的方法。本發(fā)明最后要解決的技術問題是提供了鑒定具有除草劑抗性的綠色植物的方法。本發(fā)明人通過長期、艱苦的研究，對秈稻優(yōu)良恢復系9311的EMS突變植株進行長期、不斷地篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列ALS突變蛋白，包括前文所述的某些已知ALS突變蛋白和新ALS突變蛋白，其對ALS抑制劑類除草劑不敏感，從而使得植物具有ALS抑制劑類除草劑抗性。本發(fā)明在植物育種中的應用，可用于培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農(nóng)作物，還開發(fā)了這些蛋白及其編碼基因在轉基因或者非轉基因如水稻等作物中的應用。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：一種ALS突變型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G變成核苷酸C、第339位核苷酸由A變成核苷酸C。上述ALS突變型基因其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。本

技術實現(xiàn)要素：
還包括上述的ALS突變型基因所編碼的ALS蛋白。該突變來源于水稻，與對ALS抑制劑類除草劑敏感的野生型水稻ALS(如Genbank登錄號BAB20812.1)相比，其氨基酸在Gln25、Gln113(突變植株1)上發(fā)生的突變。上述的ALS蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明還包括其氨基酸在Gln25、Gln113、Ala237(突變植株2)位點上發(fā)生突變該ALS突變型基因其核苷酸序列如SEQIDNo:3所示。目前還沒有報道表明，在來自水稻的ALS的Gln25、Gln113和Ala237位點突變(該ALS蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示)，會使得水稻具有ALS抑制劑類除草劑抗性。本

技術實現(xiàn)要素：
還包括表達盒、重組載體或細胞，其含有上述的ALS突變型基因。本

技術實現(xiàn)要素：
還包括上述的ALS突變型基因、蛋白、表達盒、重組載體或細胞在綠色植物抗除草劑方面的應用。上述綠色植物為水稻、煙草、擬南芥、棉花等。本

技術實現(xiàn)要素：
還包括獲得具有除草劑抗性的綠色植物的方法，包括如下步驟：1)使綠色植物包含所述的ALS突變型基因；或2)使綠色植物表達所述的ALS蛋白。上述的方法，包括轉基因、雜交、回交或無性繁殖步驟。鑒定權利要求上述的方法獲得的綠色植物的方法，包括以下步驟：1)測定所述綠色植物是否包含上述的ALS突變型基因；或，2)測定所述綠色植物是否表達上述的ALS蛋白。有益效果：田間噴施ALS抑制劑類除草劑“百壟通”的實驗結果表明，含有本發(fā)明的ALS突變蛋白的水稻3-4葉幼苗在施用3mL百壟通/L水(9倍推薦使用濃度)后，植株仍然正常生長發(fā)育和結實，而野生型水稻3-4葉幼苗在施用1mL百壟通/3L水(1倍推薦使用濃度)30天后表現(xiàn)為整株死亡。附圖說明圖1百壟通除草劑篩選獲得的抗性水稻突變體；圖2PCR擴增ALS基因5’端結果圖；第1泳道為Marker；Marker分子量從上到下依次為5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第2泳道為9311野生型水稻DNA，第3～13泳道為抗除草劑突變植株1的DNA，其它泳道為抗除草劑突變植株2的DNA；目的片段長度1162bp；圖3PCR擴增ALS基因3’端結果圖；第1泳道為Marker；Marker分子量從上到下依次為5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第2泳道為9311野生型水稻DNA，第3～13泳道為抗除草劑突變植株1的DNA，其它泳道為抗除草劑突變植株2的DNA；目的片段長度1207bp；圖4A和圖4B分別為百壟通除草劑對野生型和抗除草劑突變植株1和突變植株2的ALS酶活性抑制；圖5百壟通除草劑對野生型和抗除草劑水稻突變體突變植株1和突變植株2的ALS酶活性抑制的吸光值測定；圖6A和圖6B分別為甲嘧磺隆除草劑對野生型和抗除草劑水稻突變體突變植株1和突變植株2的ALS酶活性抑制；圖7甲嘧磺隆除草劑對野生型和抗除草劑水稻突變體突變植株1和突變植株2的ALS酶活性抑制的吸光值測定。圖8A突變突變植株1的ALS基因的過量表達載體BamHI/SacI雙酶切驗證圖；第1泳道為Marker；Marker分子量從上到下依次為19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925bp，第2泳道為未經(jīng)酶切的重組載體，第3泳道為重組載體經(jīng)BamHI/SacI雙酶切后產(chǎn)生的基因片段和質粒片段DNA；圖8B突變突變植株2的ALS基因的過量表達載體BamHI/SacI雙酶切驗證圖；第1泳道為未經(jīng)酶切的重組載體，第2泳道為Marker，分子量從上到下依次為5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第3、4泳道為重組載體經(jīng)BamHI/SacI雙酶切后產(chǎn)生的基因片段和質粒片段DNA，基因片段大小符合預期，證明載體構建成功；圖9轉突變型ALS基因水稻PCR檢測圖；總共有21個泳道，第1泳道、第9泳道、第19泳道為Marker；Marker分子量從上到下依次為5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第8泳道、第18泳道為為野生型DNA，作為陰性對照，第20、21泳道為質粒DNA，作為陽性對照，第3～7泳道為突變植株1的轉基因DNA，其他泳道為突變植株2的轉基因DNA。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1：水稻抗咪唑啉酮類除草劑突變體獲取過程(百壟通)將秈型常規(guī)水稻9311種子(購自江蘇省農(nóng)業(yè)種質資源保護與利用平臺)(此為M0，用清水浸泡2小時)150kg分6次用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS)室溫下浸泡6-9小時，期間每1小時搖動一次種子；棄去EMS溶液，自來水翻動浸泡種子5次，每次5分鐘，然后用自來水沖洗種子過夜，次日進行田間播種，并進行常規(guī)肥水管理(此為M1)。植株成熟后，種子混收、晾干，過冬保存。次年播種田間。待水稻(此為M2)幼苗長至3-4葉期時，噴施為3mL百壟通/L水(“百壟通”是德國巴斯夫公司生產(chǎn)一種水劑型咪唑啉酮類除草劑，推薦最低使用濃度為1mL百壟通/1.5～3L水)，30天后還呈正常綠色植株即為抗咪唑啉酮類除草劑的水稻突變植株(圖1)。共計獲得抗除草劑的M2單株370株，這些抗性單株進行常規(guī)肥水管理，有320個M2單株可正常結實，種子成熟后，單株收種、晾干，過冬保存。實施例2：抗咪唑啉酮類除草劑水稻突變體突變位點分析取上述實施例1獲得的抗除草劑水稻突變植株選取突變植株1和突變植株2的葉片，分別提取基因組DNA，送上海翰宇生物科技有限公司進行基因組測序。測序結果與9311參考基因組序列(http://rise2.genomics.org.cn/page/rice/download.jsp)相比，發(fā)現(xiàn)上述抗除草劑水稻突變體在ALS基因上發(fā)生了多個位點的突變，其中抗除草劑突變植株1在ALS基因的第75、339位點堿基發(fā)生突變，分別由G變成C、A變成C，導致其相應編碼的氨基酸序列的第25、113位點由谷氨酰胺變?yōu)榻M氨酸、谷氨酰胺變?yōu)榻M氨酸，即抗除草劑突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；抗除草劑突變植株2在ALS基因的第75、339、710位點堿基發(fā)生突變，分別由G變成C、A變成C、C變成T，導致其相應編碼的氨基酸序列的第25、113、237位點分別由谷氨酰胺變?yōu)榻M氨酸、谷氨酰胺變?yōu)榻M氨酸、丙氨酸變成纈氨酸，即抗除草劑突變植株的ALS基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其編碼的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本發(fā)明的突變植株1(9311M1)其分類命名為秈型常規(guī)水稻9311(OryzasativaindicaGroupcultivar9311)的抗除草劑突變體，該菌株已于2016年3月30號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏編號為CGMCCNo.12265。本發(fā)明的突變植株2(9311M2)其分類命名為秈型常規(guī)水稻9311(OryzasativaindicaGroupcultivar9311)的抗除草劑突變體，該菌株已于2016年3月30號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏編號為CGMCCNo.12266。該保藏的水稻種子與普通水稻種子的培養(yǎng)條件一致，喜高溫、多濕、短日照，對土壤要求不嚴，在20-32℃、濕潤的土壤(pH5.5-7.5)、正常日照條件下都可較好地生長。將水稻種子用清水浸...