本發(fā)明屬于病毒的制備方法及其應(yīng)用，特別是涉及用傳代細(xì)胞系制備羊口瘡病毒強(qiáng)毒株的方法。

背景技術(shù)：

羊口瘡，又稱為羊傳染性膿皰病，是由副痘病毒成員羊傳染性膿皰病毒引起的羊的一種局部性傳染性疾病，以唇、鼻等部位皮膚的增生性病變?yōu)橹?，在進(jìn)行剪毛、交易、潮濕的環(huán)境及屠殺等情況下容易發(fā)生。羊口瘡主要感染羔羊和新生羊，其病變多集中于口部和鼻部周圍，其臨床癥狀會(huì)經(jīng)歷一個(gè)從紅斑到囊泡和膿皰的過程，之后形成痂皮，病毒會(huì)隨著痂皮的脫落進(jìn)入周圍環(huán)境。患羊口瘡的成年羊因采食困難導(dǎo)致攝入營養(yǎng)不足，嚴(yán)重影響各項(xiàng)生產(chǎn)指標(biāo)。新生羔羊患羊口瘡則難以充分?jǐn)z入母乳，嚴(yán)重影響羔羊生長發(fā)育，甚至饑餓死亡。除山羊和綿羊外，羊駝、馴鹿、海豹、麝牛、松鼠、羚牛、駱駝等一些野生動(dòng)物也可感染羊口瘡。用病毒滅活疫苗進(jìn)行免疫是防治羊口瘡癥的一種有效措施。

羊口瘡病毒制備方面，1957年，羊口瘡病毒在羊胚胎原代細(xì)胞上成功復(fù)制此病毒，但病變并不是十分明顯(plowrightw,whitcombma,ferrisrd.1959.studieswithastrainofcontagiouspustulardermatitisvirusintissueculture.archgesvirusforsch,9:214-231.)。此后，用犢牛睪丸原代細(xì)胞、羔羊睪丸原代細(xì)胞成功增殖了羊口瘡病毒，并觀察到了典型的細(xì)胞病變反應(yīng)(sandsjj,scottac,harknessjw.1984.isolationincellcultureofapoxvirusfromredsquirrel.vetrec,114(5):117-118.pyed.1990.

vaccinationofsheepwithcellculturegrownorfvirus.austvetj,67(5):182-186.robinsonaj,balassutt.1981.contagiouspustulardermatitis(orf).jvetbull,51:771-781.)。一些外國學(xué)者利用羔羊腎細(xì)胞系、雞胚成纖維細(xì)胞成功增殖了羊口瘡病毒(mariat,mercante,rosslla,lelli,gaetano,federico,ronchi.2008.productionandefficacyofanattenuatedlivevaccineagainstcontagiousovineecthyma.jveterinariaitaliana,44(3):543-547.)。

然而，用原代羊睪丸細(xì)胞培養(yǎng)羊口瘡病毒的過程中常受到羔羊日齡選擇、采集羊睪丸時(shí)間、制備羊睪丸原代細(xì)胞過程繁瑣、原代細(xì)胞不宜連續(xù)傳代、原代細(xì)胞可能會(huì) 帶有其他病原體等問題的制約。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中使用原代細(xì)胞存在的問題，本發(fā)明目的在于提供一種用傳代細(xì)胞系制備羊口瘡病毒的方法。

本發(fā)明所提供的用傳代細(xì)胞系(macr-145、mdbk細(xì)胞等)制備羊口瘡病毒的方法，是將羊口瘡病毒接種至傳代細(xì)胞系上，產(chǎn)生羊口瘡典型病變?cè)鲋逞蚩诏彶《尽Ｋ鰝鞔?xì)胞系為marc-145細(xì)胞或mdbk細(xì)胞(牛腎細(xì)胞)。

marc-145細(xì)胞，上皮樣細(xì)胞，來源于猴腎細(xì)胞，從母細(xì)胞(ma104細(xì)胞)克隆得到，可連續(xù)培養(yǎng)；mdbk細(xì)胞(牛腎細(xì)胞)，上皮樣貼壁細(xì)胞，來源于牛腎，可連續(xù)傳代。

具體的，本發(fā)明用傳代細(xì)胞系制備羊口瘡病毒的方法，是將羊口瘡病毒接種在傳代穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系上，在37℃培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至發(fā)生病變的傳代細(xì)胞病變率達(dá)85％及以上(優(yōu)選85％-95％)時(shí)收獲病毒液，得到增殖的羊口瘡病毒；所述培養(yǎng)液包含mem培養(yǎng)基、mem體積的1％新生牛血清、終濃度為2mmol/l的l-谷氨酰胺和終濃度為10mmol/l的hepes，用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)ph值為7.4±0.2。

所述傳代細(xì)胞系為macr-145細(xì)胞或mdbk細(xì)胞。

其中傳代穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系的獲得，是將已有凍存的傳代細(xì)胞系在細(xì)胞培養(yǎng)液中復(fù)蘇，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)20h以上(優(yōu)選24h)后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48h以上(優(yōu)選72h)，按照1：3或1:4的比例進(jìn)行傳代，調(diào)節(jié)接種密度至1-10×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，穩(wěn)定傳3-5代；所述細(xì)胞培養(yǎng)液的配方：培養(yǎng)基為mem，按mem的體積添加8-10％新生牛血清，終濃度2mmol/l的l-谷氨酰胺，終濃度為10mmol/l的hepes；用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)ph至7.0-7.3。

其中凍存的傳代細(xì)胞系復(fù)蘇方法為：從液氮中取出一支的傳代細(xì)胞系，融化，離心，棄上清液，加入所述細(xì)胞培養(yǎng)液作為復(fù)蘇液，調(diào)節(jié)接種密度至1-10×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶在37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

傳代細(xì)胞發(fā)生病變現(xiàn)象為細(xì)胞出現(xiàn)空洞、細(xì)胞破裂、聚堆、部分脫離瓶壁。

所述病變率數(shù)值用活細(xì)胞計(jì)數(shù)得到：

病變率＝(未接種病毒細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)-產(chǎn)生病變細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù))/未接種病毒細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)×100％。

其中：接種在傳代穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系上的羊口瘡病毒是經(jīng)羊睪丸細(xì)胞繁殖獲得的細(xì)胞毒，具體方法為：采集羊口瘡發(fā)病羊病料-痂皮毒，經(jīng)研磨、浸毒、離心后取上清，接種羊睪丸原代細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)85％以上時(shí)收獲病毒液，繼續(xù)接種至羊睪丸 原代細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)85％以上收獲病毒液，如此連續(xù)傳代至收獲時(shí)間穩(wěn)定、病變穩(wěn)定的病毒液作為接種用羊口瘡病毒。

本發(fā)明用傳代細(xì)胞系制備羊口瘡病毒的方法，更具體包括以下步驟：

1)傳代細(xì)胞系的傳代：從液氮中取出1支傳代細(xì)胞系進(jìn)行復(fù)蘇，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)20h以上(優(yōu)選24h)后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48h以上(優(yōu)選72h)，按照1：3或1:4的比例進(jìn)行傳代，調(diào)節(jié)接種密度至1-10×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，穩(wěn)定傳3-5代；

所述細(xì)胞培養(yǎng)液的配方：培養(yǎng)基為mem，按mem的體積添加8-10％新生牛血清，終濃度2mmol/l的l-谷氨酰胺，終濃度為10mmol/l的hepes；用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)ph至7.0-7.3；

2)羊口瘡病毒的繁殖：將步驟1)中傳代穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系按種毒含量為1-2％(體積比)的比例接種羊口瘡病毒，羊口瘡病毒傳代細(xì)胞系中繁殖的條件為：培養(yǎng)基為mem，培養(yǎng)基中按mem的體積添加1％新生牛血清、添加l-谷氨酰胺使終濃度為2mmol/l、添加hepes使終濃度為10mmol/l，用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)ph至7.4±0.2，培養(yǎng)溫度為37℃；

3)羊口瘡病毒的收獲：當(dāng)步驟2)中發(fā)生病變的傳代細(xì)胞病變率達(dá)85％及以上(85％-95％)時(shí)收獲病毒液，得到增殖的羊口瘡病毒。

所述收獲的羊口瘡病毒毒液在-20℃條件下凍融2-3次后保存。

用以上所述方法制備獲得的羊口瘡病毒也屬于本發(fā)明內(nèi)容。

本發(fā)明提供了一種用傳代細(xì)胞系制備羊口瘡病毒的方法。使用傳代細(xì)胞系接種羊口瘡病毒，接種24h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，48h后細(xì)胞開始腫脹、膨大，72-96h細(xì)胞出現(xiàn)羊口瘡典型病變，細(xì)胞病變(cpe)可達(dá)85％以上。

本發(fā)明用傳代細(xì)胞系制備羊口瘡病毒的方法可以保證病毒的均一、穩(wěn)定，同時(shí)可以防止因多次利用原代細(xì)胞而使所分離的病毒帶有其它病原的風(fēng)險(xiǎn)；此外，利用傳代細(xì)胞系制備的羊口瘡疫苗簡化了疫苗的生產(chǎn)工藝、縮短了生產(chǎn)周期，降低了生產(chǎn)成本、勞動(dòng)強(qiáng)度，同時(shí)還能保證制備得到的羊口瘡疫苗質(zhì)量穩(wěn)定，因此，對(duì)羊口瘡疫苗的規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

附圖說明

圖1為接種羊口瘡病毒前marc-145傳代細(xì)胞的生長狀況；

圖2為接種羊口瘡病毒前羊睪丸原代細(xì)胞的生長狀況；

圖3為用marc-145傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒后48h時(shí)的生長狀況；

圖4為用羊睪丸原代細(xì)胞接種羊口瘡病毒后48h時(shí)的生長狀況；

圖5為用marc-145傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒后91h時(shí)的生長狀況(即收獲時(shí))；

圖6為用羊睪丸原代細(xì)胞接種羊口瘡病毒后91h時(shí)的生長狀況(即收獲時(shí))；

圖7為收獲羊口瘡病毒時(shí)marc-145傳代細(xì)胞對(duì)照(91h)；

圖8為收獲羊口瘡病毒時(shí)羊睪丸原代細(xì)胞對(duì)照(91h)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明旨在提供一種用傳代細(xì)胞系(macr-145、mdbk細(xì)胞等)制備羊口瘡病毒的方法。設(shè)計(jì)思路為：將羊口瘡病毒接種至傳代細(xì)胞系上，產(chǎn)生羊口瘡典型病變，增殖后收獲羊口瘡病毒。

經(jīng)發(fā)明人深入分析與實(shí)驗(yàn)，確定可用于本發(fā)明的傳代細(xì)胞系為marc-145細(xì)胞或mdbk細(xì)胞(牛腎細(xì)胞)。其中：marc-145細(xì)胞屬上皮樣細(xì)胞，來源于猴腎細(xì)胞，從母細(xì)胞(ma104細(xì)胞)克隆得到，可連續(xù)培養(yǎng)；mdbk細(xì)胞(牛腎細(xì)胞)屬上皮樣貼壁細(xì)胞，來源于牛腎，可連續(xù)傳代。

以下以實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。

本發(fā)明中百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/體積(w/v，單位g/100ml)百分比濃度。

實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。

實(shí)施例1、用傳代細(xì)胞系marc-145制備羊口瘡病毒

用marc-145傳代細(xì)胞培養(yǎng)羊口瘡病毒，包括以下過程：

1)marc-145傳代細(xì)胞的傳代：從液氮中取出1支marc-145傳代細(xì)胞(購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)進(jìn)行復(fù)蘇,復(fù)蘇的具體方法為：從液氮中取出一支凍存的marc-145傳代細(xì)胞，融化，離心，棄上清液，加入細(xì)胞營養(yǎng)液；

細(xì)胞營養(yǎng)液配方：培養(yǎng)基為mem(購自gibco)，培養(yǎng)基中按mem的體積添加8-10％新生牛血清(購自金源康)，添加谷氨酰胺使其終濃度為2mmol/l、添加4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)使其終濃度為10mmol/l，用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)ph至7.0-7.3。

用細(xì)胞營養(yǎng)液調(diào)節(jié)接種密度至1-1.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)至t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)20h以上(優(yōu)選24h)后更換細(xì)胞培養(yǎng)液；

繼續(xù)培養(yǎng)至48-72h(優(yōu)選72h)，此時(shí)細(xì)胞已長滿單層，當(dāng)細(xì)胞濃度為3-5×10⁵ 個(gè)細(xì)胞/ml按照1：3的比例進(jìn)行傳代，用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)接種密度至1-1.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，穩(wěn)定傳3-5代后的傳代細(xì)胞液可用于病毒的接種。

2)羊口瘡病毒的繁殖：用marc-145傳代細(xì)胞培養(yǎng)羊口瘡病毒強(qiáng)毒株，接種前marc-145傳代細(xì)胞的生長狀況如圖1所示。

具體方法為：將步驟1)中傳代穩(wěn)定、長滿單層的marc-145傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒(外購或來源于經(jīng)羊睪丸細(xì)胞繁殖獲得的細(xì)胞毒，繁殖方法見下面)，按種毒含量為1～2％(體積比)的比例接種羊口瘡病毒在長滿單層的marc-145傳代細(xì)胞中。羊口瘡病毒在marc-145傳代細(xì)胞中繁殖的條件為：培養(yǎng)基為mem(gibco)，培養(yǎng)基中按mem的體積添加1％新生牛血清(金源康)、添加谷氨酰胺使終濃度為2mmol/l、添加hepes使終濃度為10mmol/l，用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)ph至7.4±0.2，培養(yǎng)溫度為37℃。

本實(shí)施例提供步驟2)用羊睪丸細(xì)胞繁殖獲得羊口瘡病毒的過程。繁殖方法為：采集羊口瘡發(fā)病羊(青島)病料-痂皮毒，經(jīng)研磨、浸毒、離心后取上清，接種羊睪丸原代細(xì)胞(采集3-5月齡羔羊的羊睪丸制備而成)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)85％以上時(shí)收獲病毒液，繼續(xù)接種至羊睪丸原代細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)85％以上收獲病毒液，如此方法,繼續(xù)傳代至收獲時(shí)間穩(wěn)定、病變穩(wěn)定時(shí)的病毒液作為羊口瘡病毒液。

用marc-145傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒48h的生長狀況如圖3所示，由圖3可以看出細(xì)胞膨大、拉網(wǎng)、分離、部分聚堆；用marc-145傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒91h的生長狀況如圖5所示，由圖5可以看出細(xì)胞出現(xiàn)空洞、聚堆、細(xì)胞圓縮、破裂、部分脫離瓶壁。

3)羊口瘡病毒的收獲：當(dāng)步驟2)中marc-145傳代細(xì)胞病變率達(dá)85％及以上(85％～95％)時(shí)收獲病毒液。細(xì)胞病變現(xiàn)象為細(xì)胞出現(xiàn)空洞、細(xì)胞破裂、聚堆、部分脫離瓶壁，病變率的數(shù)值通過活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)現(xiàn)。

細(xì)胞病變率：將產(chǎn)生病變的細(xì)胞(在t25細(xì)胞瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞)進(jìn)行消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)，記作1；將細(xì)胞對(duì)照即未接種病毒的細(xì)胞(在t25細(xì)胞瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞)進(jìn)行消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法算出后細(xì)胞數(shù)，記作2；細(xì)胞病變率的計(jì)算公式為[(2-1)/2×100％]，表述為：

病變率＝(未接種病毒細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)-產(chǎn)生病變細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù))/未接種病毒細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)×100％。

未接種羊口瘡病毒91h時(shí)marc-145傳代細(xì)胞對(duì)照(細(xì)胞對(duì)照就是一個(gè)平行參照物，與接種病毒后的細(xì)胞的區(qū)別就是細(xì)胞對(duì)照中不接種病毒)如圖7所示，由圖7可以看出細(xì)胞輪廓清晰，無病灶，雖偶有老化圓縮細(xì)胞，但并未破碎。比較用marc-145 傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒(圖5)和未接種羊口瘡病毒(圖7)后marc-145傳代細(xì)胞狀態(tài)(圖7是當(dāng)marc-145細(xì)胞長滿單層后未接種羊口瘡病毒繼續(xù)培養(yǎng)91h后的細(xì)胞狀態(tài)，而圖5是當(dāng)marc-145細(xì)胞長滿單層后接種了羊口瘡病毒繼續(xù)培養(yǎng)91h后的細(xì)胞狀態(tài))，圖7顯示細(xì)胞沒有產(chǎn)生病變的狀態(tài)，而圖5顯示細(xì)胞產(chǎn)生病變的狀態(tài)，兩種細(xì)胞形態(tài)不同，表明marc-145傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒后已發(fā)生病變。

收獲的羊口瘡病毒毒液可在-20℃條件下凍融(凍融的目的：破碎含毒細(xì)胞，將病毒釋放到培養(yǎng)液中)2-3次后保存，備用。

tcid50的測(cè)定：用羊睪丸原代細(xì)胞、marc-145傳代細(xì)胞分別測(cè)定實(shí)施例1制備的同一份羊口瘡病毒樣品的tcid50。測(cè)定tcid50的具體方法為：將病毒樣品按體積比做10倍比例稀釋，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)孔，每孔加入100微升稀釋后的毒液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再在每孔加入100微升羊睪丸原代細(xì)胞(調(diào)節(jié)接種密度至2×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml)或marc-145傳代細(xì)胞(調(diào)節(jié)接種密度至1.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml)，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，觀察96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞病變情況，利用karber法計(jì)算tcid50含量。測(cè)得該樣品的毒價(jià)結(jié)果分別為

10^-6.0tcid50/ml(羊睪丸原代細(xì)胞)、10^-6.5tcid50/ml(marc-145傳代細(xì)胞)，測(cè)定結(jié)果表明：用這兩種細(xì)胞分別測(cè)定同一份羊口瘡病毒樣品的毒價(jià)，測(cè)定結(jié)果之間沒有差異。

對(duì)照例：用羊睪丸原代細(xì)胞制備羊口瘡病毒(對(duì)照)

用羊睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)羊口瘡病毒進(jìn)行對(duì)照。進(jìn)行以下操作：

1)羊睪丸原代細(xì)胞的傳代：選擇3-5月齡綿羊采集羊睪丸，制備羊睪丸原代細(xì)胞，調(diào)節(jié)接種密度至1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)，72h(72-96h均可)后，按照1:2(這個(gè)細(xì)胞生長比較慢，所以一般以1:2的比例進(jìn)行傳代)的比例進(jìn)行傳代，穩(wěn)定傳代3-7代后可用于病毒的接種。

2)羊口瘡病毒的繁殖：用羊睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)羊口瘡病毒強(qiáng)毒株，接種前羊睪丸原代細(xì)胞的生長狀況如圖2所示。

具體方法為：將步驟1)中傳代穩(wěn)定、長滿單層的羊睪丸原代細(xì)胞接種羊口瘡病毒(與本例一使用相同的羊口瘡病毒液)，按種毒含量為1-2％(體積比)的比例接種羊口瘡病毒在長滿單層的羊睪丸原代細(xì)胞中，羊口瘡病毒在羊睪丸原代細(xì)胞中繁殖的條件為：培養(yǎng)基為mem(gibco)，培養(yǎng)基中按mem的體積添加1％新生牛血清(金源康)、添加l-谷氨酰胺使終濃度為2mmol/l、添加hepes使終濃度為10mmol/l，用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)ph至7.4±0.2，培養(yǎng)溫度為37℃。

用羊睪丸原代細(xì)胞接種羊口瘡病毒48h的生長狀況如圖4所示，由圖4可以看出細(xì)胞膨大、拉網(wǎng)、分離、部分聚堆，和圖3進(jìn)行比較，可以看出細(xì)胞變形趨勢(shì)基本一致；用羊睪丸原代細(xì)胞接種羊口瘡病毒91h的生長狀況如圖6所示，由圖6可以看出細(xì)胞出現(xiàn)空洞、細(xì)胞圓縮、破裂、聚堆、部分脫離瓶壁，和圖5進(jìn)行比較，可以看出變形細(xì)胞形態(tài)相似，基本一致。

3)羊口瘡病毒的收獲：當(dāng)步驟2)中羊睪丸原代細(xì)胞病變達(dá)85％以上時(shí)收獲病毒液，細(xì)胞病變現(xiàn)象為細(xì)胞出現(xiàn)空洞、細(xì)胞圓縮、破裂、聚堆、部分脫離瓶壁。未接種羊口瘡病毒的羊睪丸原代細(xì)胞對(duì)照如圖8所示(91h)，由圖8可以看出細(xì)胞輪廓清晰、呈長梭形，無病灶，雖偶有老化圓縮細(xì)胞，但并未破碎。比較用羊睪丸原代細(xì)胞接種羊口瘡病毒(圖6)和未接種羊口瘡病毒(圖8)后羊睪丸原代細(xì)胞狀態(tài)，表明羊睪丸原代細(xì)胞接種羊口瘡病毒后已發(fā)生病變。收獲的羊口瘡病毒毒液可在-20℃條件下凍融2-3次后保存，備用。凍融的目的：破碎含毒細(xì)胞，將病毒釋放到培養(yǎng)液中。

tcid50的測(cè)定：用羊睪丸原代細(xì)胞、marc-145傳代細(xì)胞分別測(cè)定對(duì)照例制備的同一份羊口瘡病毒樣品的tcid50。測(cè)定tcid50的具體方法為：將病毒樣品按體積比做10倍比例稀釋，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做4個(gè)重復(fù)孔，每孔加入100微升稀釋后的毒液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再在每孔加入100微升羊睪丸原代細(xì)胞(調(diào)節(jié)接種密度至2×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml)或marc-145傳代細(xì)胞(調(diào)節(jié)接種密度至1.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml)，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，觀察96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞病變情況，利用karber法計(jì)算tcid50含量。測(cè)得該樣品的毒價(jià)結(jié)果分別為10^-6.25tcid50/ml(羊睪丸原代細(xì)胞)、10^-6.5tcid50/ml(marc-145傳代細(xì)胞)，測(cè)定結(jié)果表明：用這兩種細(xì)胞分別測(cè)定同一份羊口瘡病毒樣品的毒價(jià)，測(cè)定結(jié)果之間沒有差異。

將上述實(shí)施例1和對(duì)照例的實(shí)驗(yàn)過程及測(cè)毒結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，使用marc-145傳代細(xì)胞和羊睪丸原代細(xì)胞接種羊口瘡病毒，接種24h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，48h后細(xì)胞開始腫脹、膨大，72-96h細(xì)胞出現(xiàn)羊口瘡典型病變，細(xì)胞病變(cpe)可達(dá)85％以上；表明這兩種細(xì)胞接種羊口瘡病毒后，培養(yǎng)一定時(shí)間后細(xì)胞均能產(chǎn)生羊口瘡的典型病變；使用marc-145傳代細(xì)胞和羊睪丸原代細(xì)胞分別測(cè)定同一份羊口瘡病毒樣品的毒價(jià)—tcid50，測(cè)定結(jié)果沒有差異。

實(shí)施例2、用傳代細(xì)胞系mdbk制備羊口瘡病毒

方法與實(shí)施例1相同。其中所用mdbk傳代細(xì)胞來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

tcid50含量的測(cè)定結(jié)果為：用羊睪丸原代細(xì)胞、mdbk傳代細(xì)胞分別測(cè)定實(shí)施例2 制備得到的同一個(gè)羊口瘡病毒樣品，測(cè)得該樣品的毒價(jià)結(jié)果分別為10^-6.5tcid50/ml(羊睪丸原代細(xì)胞)、10^-6.25tcid50/ml(mdbk傳代細(xì)胞)，測(cè)定結(jié)果表明：用這兩種細(xì)胞分別測(cè)定同一個(gè)羊口瘡病毒樣品的毒價(jià)，兩種細(xì)胞測(cè)定結(jié)果之間沒有差異。

使用mdbk傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒，接種24h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，48h后細(xì)胞開始腫脹、膨大，72-96h細(xì)胞出現(xiàn)羊口瘡典型病變，細(xì)胞病變(cpe)可達(dá)85％以上，表明mdbk傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒后，培養(yǎng)一定時(shí)間細(xì)胞均能產(chǎn)生羊口瘡的典型病變，能收獲一定毒力的羊口瘡病毒毒液。

以上實(shí)施例顯示使用marc-145傳代細(xì)胞或mdbk傳代細(xì)胞接種羊口瘡病毒與使用羊睪丸原代細(xì)胞同樣能制備得到羊口瘡病毒。本發(fā)明的特點(diǎn)是使用傳代細(xì)胞，因傳代細(xì)胞本身具有每個(gè)細(xì)胞特征均一、穩(wěn)定、純凈的特征，所以接種病毒后可以使各批次收獲的病毒液均一、穩(wěn)定，進(jìn)而保證了生產(chǎn)出的疫苗質(zhì)量安全、穩(wěn)定、均一、有效。

另外，與原代細(xì)胞相比較而言，傳代細(xì)胞還具有傳代過程簡單、耗時(shí)短、傳代分種比例高(一般可按1:3-1:5進(jìn)行分種)、細(xì)胞生長速度快(在細(xì)胞接種密度適宜的情況下2-4天可以長滿單層進(jìn)行傳代)、可規(guī)?；a(chǎn)的特征，所以接種病毒后可使病毒均一、批間差異小、生產(chǎn)病毒的周期縮短，從而簡化了疫苗的生產(chǎn)工藝、縮短了生產(chǎn)周期。而羊睪丸原代細(xì)胞存在采集羊睪丸受季節(jié)影響(夏冬季不能采集)、攜帶其他病原體的風(fēng)險(xiǎn)、制備原代細(xì)胞過程繁瑣、耗時(shí)長、傳代分種比例低(只能1:2進(jìn)行分種)、細(xì)胞生長速度慢(在細(xì)胞接種密度適宜的情況下5天到一周可以長滿單層進(jìn)行傳代)等不足，因此本發(fā)明用傳代細(xì)胞進(jìn)行病毒的繁殖用于疫苗生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)成本、勞動(dòng)強(qiáng)度，同時(shí)還能保證制備得到的羊口瘡疫苗質(zhì)量穩(wěn)定。