本發(fā)明涉及腫瘤治療藥物領(lǐng)域，尤其涉及slit2d2-嵌合抗原受體在預(yù)防和/或治療robo1高表達腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人體的t淋巴細胞是通過其表面的t細胞受體來識別靶細胞的，這一識別具有特異性，即某一個t淋巴細胞只識別具有特定抗原的靶細胞，而且這種特定的抗原是在細胞內(nèi)加工后，在特殊分子的作用下呈遞給t淋巴細胞的。這種起抗原呈遞作用的分子或者存在于抗原呈遞細胞表面或者存在于靶細胞表面。至少有兩方面的因素導(dǎo)致體內(nèi)的t淋巴細胞不能很好地識別癌細胞：(1)癌細胞下調(diào)抗原呈遞分子的表達，(2)被呈遞的抗原與t細胞受體親和力很弱。雖然癌癥患者體內(nèi)存在癌細胞高度特異性的t淋巴細胞，但是數(shù)量太少起不到治療癌癥的作用。基于這種情況，科學家提出了構(gòu)建嵌合t細胞受體(現(xiàn)在一般稱為嵌合抗原受體)的概念。嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，car)主要由兩部分構(gòu)成，一端位于細胞外能夠特異性識別癌細胞表面的某一抗原，另一端位于胞內(nèi)含有信號激活元件(如t細胞受體的zeta鏈)，起傳遞信號激活t細胞的作用。這樣表達car的t淋巴細胞(cart細胞)就能避免t細胞受體識別靶細胞的限制，從而起到靶向癌細胞的殺傷作用。

目前，cart治療的臨床試驗正在迅速增長，其中大部分是對b細胞惡性腫瘤治療的評估。大多數(shù)b細胞惡性腫瘤和正常b細胞表達cd19抗原，但是其他類型的細胞沒有cd19，因此cd19是一個很好的治療靶點。不同的臨床試驗所采用的cd19cart細胞在組成上有一定差別，臨床設(shè)計上也不一樣，不過都報道了顯著的效果，復(fù)發(fā)性或難治性淋巴細胞白血病的治療能達到60-90％的反應(yīng)率，一部分患者達到持續(xù)的緩解，最長的達到2年。雖然目前還不知道cd19cart治療能達到多長時間的持續(xù)緩解，但是可以肯定的是這種免疫治療已經(jīng)給一些患者帶來了以前所達不到的效果。

除了血液系統(tǒng)腫瘤外，研究者們一直在努力將cart治療擴展到實體瘤。臨床試驗顯示，gd2特異性的cart對神經(jīng)母細胞瘤有一定的療效，而afr特異性的cart細胞對卵巢癌，caix特異性的cart細胞對腎細胞癌和psma特異性的cart細胞對前列腺癌沒有顯示出治療效果。賓州大學的carlhjune等在2015年美國臨床腫瘤學年會上報告了用間皮素特異性的cart細胞治療難治的和轉(zhuǎn)移的胰腺導(dǎo)管腺癌的結(jié)果，結(jié)果顯示患者對cart細胞具有很好的耐受性，沒有出現(xiàn)細胞因子綜合征，周血中能短時期內(nèi)檢測到cart細胞，有2名患者病情得到穩(wěn)定。因此，cart治療實體瘤還處于早期階段，還有許多問題需要解決。

robo1是實體腫瘤治療潛在新靶點，robo是一次跨膜的受體蛋白，在哺乳動物中，已經(jīng)克隆到4個robo基因。從物種進化的角度看，robo1，2，3的胞外部分非常的保守，從果蠅到人類都是由5個ig樣功能區(qū)和3個fibronectiniii型重復(fù)序列組成。robos有很短的跨膜區(qū)域和一個較長的胞內(nèi)區(qū)；按照序列的保守性，胞內(nèi)區(qū)被劃分為4個更小的區(qū)域，分別命名為：cc0，cc1，cc2，cc3。robo4的結(jié)構(gòu)與其它三個家族成員有很大的不同，它的胞外只有2個ig樣功能區(qū)和3個fibronectiniii型重復(fù)序列；胞內(nèi)也只有cc0和cc2兩個區(qū)域。robos胞外的iggdomains被認為是與配體slit結(jié)合所必需的，較長的胞內(nèi)區(qū)域則和一些重要的信號分子相互作用，參與slit/robo下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而完成刺激信號由細胞外部到內(nèi)部骨架的傳遞。目前，已完成slit2與robo相互作用區(qū)域蛋白質(zhì)的機構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)slit2的第二個結(jié)構(gòu)域d2與robo1的ig1結(jié)合，進而啟動信號傳導(dǎo)。slit2/rono1相互作用三級結(jié)構(gòu)解析參見附圖1。

組織病理學檢測顯示robo1在多種癌癥中過表達，如肝細胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。ito等人的研究顯示robo1在肝癌中大量表達，而在正常組織中只有少量表達，且84.7％的肝癌組織樣本為陽性表達，因此robo1可以作為一種新的肝細胞腫瘤相關(guān)抗原，是一種潛在的治療和診斷靶標。等人的檢測結(jié)果顯示，80％的結(jié)腸癌患者的癌組織高度表達robo1mrna，45％的患者是正常組織4倍，15％的患者是正常組織的12倍，因此robo1可以為結(jié)腸癌的治療提供了一個潛在靶點。通過比較胰腺導(dǎo)管癌和其周圍良性組織，he等人發(fā)現(xiàn)robo1在癌組織中表達上調(diào)，而這種表達上調(diào)可能與胰腺癌細胞的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。huang等人的研究也表明robo1與結(jié)腸癌的遷移有關(guān)。從http://xenobase.crownbio.com/xenobase/index.aspx數(shù)據(jù)庫中分析顯示(參見附圖2)，大部分腫瘤細胞中高表達robo1蛋白分子。從http://www.genecards.org/cgi-bin/數(shù)據(jù)庫中分析(參見圖3)，在正常組織中低表達或不表達robo1分子，提示robo1是一個潛在的腫瘤治療的新靶點。

本發(fā)明將開發(fā)一種針對robo1抗原分子的嵌合抗原受體，將其表達于細胞中，可以用于robo1高表達腫瘤的治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種預(yù)防和/或治療robo1高表達腫瘤的嵌合抗原受體。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種預(yù)防和/或治療robo1高表達腫瘤的嵌合抗原受體表達細胞。

本發(fā)明的還一目的是提供一種預(yù)防和/或治療robo1高表達腫瘤的藥物。

因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括能夠結(jié)合抗原的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)免疫共刺激分子，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域包括slit2蛋白的d2結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明所述的slit2蛋白d2結(jié)構(gòu)域，簡稱slit2d2，具有：

1)如seqidno：1所示的氨基酸序列，或

2)將1)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。

優(yōu)選的，所述嵌合抗原受體依次由slit2蛋白的d2結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)免疫共刺激分子組成。

優(yōu)選的，所述跨膜結(jié)構(gòu)域包括cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos、cd154跨膜結(jié)構(gòu)域中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述跨膜結(jié)構(gòu)域為cd8跨膜結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明所述的cd8跨膜結(jié)構(gòu)域具有：

3)如seqidno：2所示的氨基酸序列，或

4)將3)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。

優(yōu)選的，所述胞內(nèi)免疫共刺激分子包括cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd66d、cd2、cd4、cd5、cd28、cd134、cd137、icos、cd154、4-1bb和ox40胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述胞內(nèi)免疫共刺激分子由4-1bb和cd3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。

本發(fā)明所述的4-1bb胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有：

5)如seqidno：3所示的氨基酸序列，或

6)將5)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列；

本發(fā)明所述的cd3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有：

7)如seqidno：4所示的氨基酸序列，或

8)將7)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述的嵌合抗原受體由slit2蛋白的d2結(jié)構(gòu)域、cd8跨膜結(jié)構(gòu)域、4-1bb胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和cd3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，簡稱slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，也稱為slit2d2-car。

本發(fā)明所述的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ具有：

9)如seqidno：5所示的氨基酸序列，或

10)將9)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的氨基酸序列。

優(yōu)選的，所述的嵌合抗原受體中，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

本發(fā)明所述的slit2蛋白d2結(jié)構(gòu)域通過c末端與cd8跨膜結(jié)構(gòu)域的n末端直接連接，或slit2蛋白d2結(jié)構(gòu)域通過其n末端與的cd8跨膜結(jié)構(gòu)域c末端直接連接，即slit2蛋白d2結(jié)構(gòu)域與cd8跨膜結(jié)構(gòu)域直接連接，中間沒有任何連接肽。

本發(fā)明還提供一種編碼本發(fā)明所述嵌合抗原受體的基因，所述嵌合抗原受體包括能夠結(jié)合抗原的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)免疫共刺激分子，其中所述胞外結(jié)構(gòu)域包括slit2蛋白的d2結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明所述的slit2蛋白d2結(jié)構(gòu)域，簡稱slit2d2，其基因序列如seqidno：6所示。

優(yōu)選的，所述的嵌合抗原受體由slit2蛋白的d2結(jié)構(gòu)域、cd8跨膜結(jié)構(gòu)域、4-1bb胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和cd3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，簡稱slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，其中，所述的slit2蛋白d2結(jié)構(gòu)域的基因序列如seqidno：6所示，所述的cd8跨膜結(jié)構(gòu)域的基因序列如seqidno：7所示，所述的4-1bb胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的基因序列如seqidno：8所示，所述的cd3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的基因序列如seqidno：9所示。

本發(fā)明所述的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因序列如seqidno：10所示；

或者，在嚴格條件下與seqidno：10所示的序列雜交且編碼具有預(yù)防和/或治療腫瘤的相關(guān)蛋白的dna分子；

或者，與seqidno：10所示的序列具有至少90％以上，優(yōu)選為95％以上，更優(yōu)選為98％以上同源性且編碼具有預(yù)防和/或治療腫瘤的相關(guān)蛋白的dna分子。

本發(fā)明還提供了一種與嵌合抗原受體相關(guān)的生物材料，包括含有本發(fā)明所述編碼嵌合抗原受體的基因的重組載體、表達盒、重組細胞、重組菌、重組病毒。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的重組載體為重組表達載體或重組克隆載體。

本發(fā)明所述的嵌合抗原受體(car)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。本發(fā)明合成編碼基因可通過常規(guī)方法，從指定car的氨基酸序列，容易地制備編碼car的堿基序列，由氨基酸序列的ncbirefseqid或genbenk檢索號得到編碼氨基酸序列的堿基序列，并且可使用標準分子生物學和/或化學程序制備本發(fā)明的核酸。例如，可根據(jù)堿基序列合成核酸，將得自cdna數(shù)據(jù)庫的dna片段通過聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)制備本發(fā)明的核酸。

本發(fā)明的第二方面是提供一種嵌合抗原受體表達細胞，所述嵌合抗原受體表達細胞為在細胞中引入了本發(fā)明所述的編碼嵌合抗原受體的基因。

本發(fā)明中，細胞可來自哺乳動物的細胞(例如人細胞、小鼠、大鼠、猴)的細胞，可使用采集、分離、純化或誘導(dǎo)自體液、組織或器官例如血(外周血、臍帶血等)或骨髓的細胞。優(yōu)選的，細胞是t細胞或含有t細胞的細胞群(例如pbmc)，更優(yōu)選的，t細胞來源于人外周血的t細胞。

優(yōu)選的，所述嵌合抗原受體為slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，記為slit2d2-car，其中，所述的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因序列如seqidno：10所示；

或者，在嚴格條件下與seqidno：10所示的序列雜交且編碼具有預(yù)防和/或治療腫瘤的相關(guān)蛋白的dna分子；

或者，與seqidno：10所示的序列具有至少90％以上，優(yōu)選為95％以上，更優(yōu)選為98％以上同源性且編碼具有預(yù)防和/或治療腫瘤的相關(guān)蛋白的dna分子。

優(yōu)選的，所述嵌合抗原受體表達細胞為在t細胞中引入編碼slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因，記為slit2d2-cart。

本發(fā)明還提供了一種制備嵌合抗原受體表達細胞的方法，包括將本發(fā)明所述的編碼嵌合抗原受體的基因引入細胞中的步驟。

本發(fā)明中，將編碼嵌合抗原受體的基因引入細胞中具體包括如下步驟：

合成和擴增嵌合抗原受體基因，將所述基因克隆至表達載體上；

利用包裝質(zhì)粒和表達載體轉(zhuǎn)染細胞；

使細胞表達嵌合抗原受體，其中，在細胞表面表達slit2d2分子。

本發(fā)明中，細胞可來自哺乳動物的細胞(例如人細胞、小鼠、大鼠、猴)的細胞，可使用采集、分離、純化或誘導(dǎo)自體液、組織或器官例如血(外周血、臍帶血等)或骨髓的細胞。優(yōu)選的，細胞是t細胞或含有t細胞的細胞群(例如pbmc)，更優(yōu)選的，t細胞來源于人外周血的t細胞。

本發(fā)明中，表達載體可使用缺乏復(fù)制能力、無法在轉(zhuǎn)染細胞中自我復(fù)制的病毒載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體和假型載體)、腺病毒載體、痘苗病毒載體或hsv載體等。本發(fā)明中可根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒選擇廣泛市售的多種類的可用于包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝質(zhì)粒，也可使用具有高轉(zhuǎn)染效率的293細胞或293t細胞制備逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。

優(yōu)選的，所述嵌合抗原受體為slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，記為slit2d2-car，其中，所述的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因序列如seqidno：10所示；

或者，在嚴格條件下與seqidno：10所示的序列雜交且編碼具有預(yù)防和/或治療腫瘤的相關(guān)蛋白的dna分子；

或者，與seqidno：10所示的序列具有至少90％以上，優(yōu)選為95％以上，更優(yōu)選為98％以上同源性且編碼具有預(yù)防和/或治療腫瘤的相關(guān)蛋白的dna分子。

優(yōu)選的，制備嵌合抗原受體表達細胞的方法包括將編碼slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因引入t細胞中的步驟。

在本發(fā)明一個具體的實施方式中，制備嵌合抗原受體表達細胞的方法具體包括如下步驟：

合成和擴增slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ基因，所述基因序列如seqidno：10所示，將所述基因克隆至慢病毒表達載體上；

利用慢病毒包裝質(zhì)粒和慢表達載體轉(zhuǎn)染293t細胞，包裝和制備慢病毒；

分離人外周血t細胞，培養(yǎng)擴增，利用慢病毒轉(zhuǎn)染t細胞，使t細胞表達slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ，其中，在t細胞表面表達slit2d2分子，胞內(nèi)由4-1bb-cd3ζ分子傳遞t細胞活化信號。

本發(fā)明的第三方面提供了一種藥物組合物，包括本發(fā)明所述的嵌合抗原受體或本發(fā)明所述的嵌合抗原受體表達細胞以及藥學上可接受的輔料。

本發(fā)明所述的藥物組合物可以為片劑(包括糖衣片劑，膜包衣片劑，舌下片劑，口腔崩解片，口腔片劑等等)，丸劑，粉劑，顆粒劑，膠囊劑(包括軟膠囊，微膠囊)，錠劑，糖漿劑，液體，乳劑，混懸劑，控制釋放制劑(例如，瞬時釋放制劑，緩釋制劑，緩釋微囊)，氣霧劑，膜劑(例如，口服崩解膜劑，口腔粘膜-粘附膜劑)，注射劑(例如，皮下注射，靜脈注射，肌內(nèi)注射，腹膜內(nèi)注射)，靜脈滴注劑，透皮吸收制劑，軟膏劑，洗劑，粘附制劑，栓劑(例如，直腸栓劑，陰道栓劑)，小藥丸，鼻制劑，肺制劑(吸入劑)，眼睛滴劑等等，口服或胃腸外制劑(例如，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，器官內(nèi)，鼻內(nèi)，皮內(nèi)，滴注，腦內(nèi)，直腸內(nèi)等給藥形式，給藥至腫瘤的附近和直接給藥至病變處)。優(yōu)選的，所述的藥物組合物為注射劑。

本發(fā)明所述的藥學上可接受的輔料優(yōu)選為藥學上可接受的注射劑輔料，例如等滲的無菌鹽溶液(磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等，或上述鹽的混合物)，或干燥的例如是冷凍干燥的組合物，其適當?shù)赝ㄟ^加入無菌水或生理鹽水形成可注射溶質(zhì)。

本發(fā)明第四方面提供一種本發(fā)明所述嵌合抗原受體或嵌合抗原受體表達細胞在預(yù)防和/或治療robo1高表達腫瘤中的應(yīng)用。

本發(fā)明第五方面提供一種本發(fā)明所述嵌合抗原受體或嵌合抗原受體表達細胞在預(yù)防和/或治療robo1高表達腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述robo1高表達腫瘤包括乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、直腸癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。

本發(fā)明采用slit2d2構(gòu)建嵌合抗原受體(slit2d2-car)，并用于修飾和改造細胞，尤其是將slit2d2-car用于修飾和改造t細胞從而構(gòu)建slit2d2-cart細胞，以robo1分子為靶抗原，利用slit2d2-cart細胞殺傷腫瘤細胞，并作為細胞藥物用于腫瘤類疾病的治療。采用本發(fā)明嵌合抗原受體，使改造后的細胞尤其是t細胞能夠特異性識別和殺傷腫瘤，且具備更高效的腫瘤殺傷活性。

附圖說明

圖1slit2/robo1相互作用三級結(jié)構(gòu)解析示意圖；

圖2robo1基因在腫瘤細胞中的表達分析；

圖3robo1基因在組織中的表達分析；

圖4為本發(fā)明prrslin-slit2d2慢病毒表達載體示意圖；

圖5為本發(fā)明高表達robo1的工程細胞株mcf7/robo1流式檢測結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明slit2d2car-t體外殺傷實驗結(jié)果；

圖7為本發(fā)明不同效靶比條件下slit2d2car-t細胞對mcf-7/robo1的體外殺傷效果圖；

圖8為本發(fā)明不同效靶比條件下slit2d2car-t細胞對smcc-7721腫瘤細胞的體外殺傷效果圖。

具體實施方式

本發(fā)明中術(shù)語“嵌合抗原受體(car)”是指包含能夠結(jié)合抗原的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)免疫共刺激分子的融合蛋白，“嵌合抗原受體(car)”也稱為“嵌合受體”、“t-body”或“嵌合免疫受體(cir)”，“能夠結(jié)合抗原的胞外結(jié)構(gòu)域”是指可結(jié)合特定抗原的任何寡肽或多肽?！翱缒そY(jié)構(gòu)域”是指衍生自自任何膜結(jié)合蛋白或跨膜蛋白的多肽或者主要包含疏水性殘基例如亮氨酸和纈氨酸的人工合成的多肽?！鞍麅?nèi)免疫共刺激分子”是指已知在細胞中作為傳輸信號以引起生物過程的活化或抑制的結(jié)構(gòu)域起作用的任何寡肽或多肽。

本發(fā)明中術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”是指是生物大分子中具有特異結(jié)構(gòu)和獨立功能的區(qū)域，例如slit2蛋白d2結(jié)構(gòu)域是指slit2蛋白中4個富含亮氨酸的重復(fù)序列中的第二結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明中術(shù)語“slit2蛋白”是指神經(jīng)遷移蛋白，是一種在進化上高度保守的分泌型細胞外基質(zhì)糖蛋白，分子量約為200kd，對軸突生長和神經(jīng)元遷移起導(dǎo)向作用，其結(jié)構(gòu)由n端的胞外分泌信號肽，4個富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-richrepeat，lrrs)，也被命名為d1-d4結(jié)構(gòu)域，多個表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，egf)樣的重復(fù)序列(在果蠅中是7個，在脊椎動物中是9個)，一個lamining樣結(jié)構(gòu)域和一個富含半胱氨酸的c端結(jié)構(gòu)域組成。

本發(fā)明中術(shù)語“robo1”是一種單通道的跨膜受體蛋白，為slit蛋白的受體，其胞外區(qū)包括5個免疫球蛋白保守區(qū)和3個纖連蛋白iii型重復(fù)序列，胞內(nèi)區(qū)包括cc0，cc1，cc2和cc3四個保守的區(qū)域。

本發(fā)明中術(shù)語“預(yù)防”或“治療”包括治療性或預(yù)防性處理或措施，目標是預(yù)防或減慢靶向的病理性狀況或病癥。如果根據(jù)本發(fā)明的方法接收治療量的本發(fā)明所述融合蛋白后，對象表現(xiàn)出可觀察和/或可測量的特定疾病一個或多個體征和癥狀的減少或消失，則該對象被成功“預(yù)防”或“治療”。

以下所提供的實施例，可以更詳細地解釋本發(fā)明內(nèi)容。但是，本發(fā)明的內(nèi)容并不限于以下實施例所闡述的內(nèi)容。

實施例1慢病毒表達載體制備

1.根據(jù)已知的slit2序列[genbank:eaw92793.1]分析設(shè)計構(gòu)建slit2的第二個結(jié)構(gòu)域slit2d2(hohenester2008)，從genbank數(shù)據(jù)庫中搜尋已知的人cd8^tm跨膜區(qū)基因序列、人4-1bb胞內(nèi)區(qū)基因序列和cd3ζ胞內(nèi)區(qū)基因序列，各基因序列表參見序列表seqidno:6-9。

2.將上述基因序列依次按人slit2d2基因、cd8^tm膜區(qū)基因、人4-1bb胞內(nèi)區(qū)基因和cd3ζ胞內(nèi)區(qū)基因進行連接，在各序列連接處引入不同的酶切位點，形成完整的slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ(簡稱slit2d2-car)基因序列信息，其序列參見序列表seqidno:10。

3.將slit2d2-cd8^tm-4-1bb-cd3ζ的基因序列通過酶切轉(zhuǎn)化連接到prrslin載體中，基因上游為ep-1α啟動子。將載體轉(zhuǎn)化到stbl3大腸桿菌菌株后，轉(zhuǎn)種到含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基中進行繁殖，篩選，獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定克隆，通過測序確認載體構(gòu)建成功，獲得prrslin-slit2d2慢病毒表達載體，慢病毒表達載體構(gòu)建示意圖參見附圖3。

實施例2慢病毒制備

1.轉(zhuǎn)染前24小時，以每皿約8×10⁶將293t細胞接種至15cm培養(yǎng)皿中。確保轉(zhuǎn)染時細胞在80％左右的匯合度且均勻分布于培養(yǎng)皿中。

2.準備溶液a和溶液b

溶液a：6.25ml2×hepesbuffer緩沖液(采用5個大皿一起包裝的量，效果最好)。

溶液b：分別加入以下質(zhì)粒的混合物：112.5μgprrlsin-ef-pd1(targetplasmid)；39.5μgpmd2.g(vsv-genvelop)；73μgpcmvr8.74(gag，pol，tat，rev)；625μl2m鈣離子溶液。溶液a總體積：6.25ml。

3.充分混勻溶液b，輕輕渦旋溶液a的同時，逐滴加入溶液a，靜置5-15分鐘。輕輕渦旋上述a和b的混合溶液，逐滴加入含293t細胞的培養(yǎng)皿中，輕輕前后晃動培養(yǎng)皿使dna與鈣離子的混合物均勻分布。(不要旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時。

更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在48小時和72小時后收集含病毒的上清液。采用熒光顯微鏡觀察，95％以上的細胞顯示綠色熒光。

在轉(zhuǎn)速500g，溫度25℃下離心10min，使用pes膜(0.45μm)過濾；以70％乙醇消毒離心管(貝克曼庫爾特ultra-clearsw28centrifugetubes)，并置于紫外燈下消毒30min；將已過濾的含慢病毒的上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，在離心管底部小心鋪上一層20％蔗糖(每8ml上清液加1ml蔗糖)，以pbs平衡離心管，在轉(zhuǎn)速25,000rpm(82,700g)，溫度4℃下離心2h；小心取出離心管，倒掉上清液，倒置離心管去掉殘余液體；加入100μlpbs，密封離心管，在4℃放置2h，每20min輕輕渦旋一次，500g離心1min(25℃)，收集病毒上清；冰上冷卻后，置于-80℃保存。

實施例3slit2d2-cart細胞制備

1.取0.5ml血進行快速的病原微生物檢測，排除hbv、hcv、hdv和hev、hiv-1/2、梅毒螺旋體及寄生蟲等微生物感染；無菌條件下，用肝素瓶采血50ml(肝素抗凝)，立即(4℃，24小時內(nèi))送至細胞制備實驗室，保證此過程無病原微生物污染。得到患者血液后，在gmp制備室，用酒精棉球擦拭肝素瓶表面進行消毒后放入生物安全柜。

2.預(yù)先打開2個50ml離心管，將血液轉(zhuǎn)入兩個50ml離心管中，旋緊；將上述裝好血液的兩個50ml離心管放入離心機離心，400g(2000rpm)離心10min，室溫離心后收集上層血漿，留下沉淀層；收集的自體血漿經(jīng)56℃，30min滅活，4℃放置15min后，900g，離心30min(4℃)，取上清備用。

3.將上述富集的血細胞用生理鹽水稀釋至30ml/管，打開2個新的50ml離心管，每個離心管分別加入15ml人淋巴細胞分離液，用移液管把稀釋后的血細胞液緩緩加入到盛有人淋巴分離液的離心管中，旋緊。注意血液要加到淋巴分離液的上層，勿打破人淋巴分離液的界面。將加好的血細胞液放入離心機，調(diào)至最小的升降速率，400g(2000rpm)離心20min(常溫)。收集兩管的中層白細胞層于一支15ml無菌離心管中，加入5ml生理鹽水，洗兩次(400g，離心10min)，得外周血單核細胞(pbmc)。

4.配置完全生長培養(yǎng)基，v-vivo15添加自體ab(fbs)濃度為5％，白細胞介素-2(il-2)濃度為40ng/ml，將分離得到的pbmc用培養(yǎng)基稀釋成2×10⁶/ml，取50μl流式檢測pbmc中t細胞的純度。

5.day0，配置緩沖液(在pbs緩沖液中添加1％的胎牛血清(fbs))，選用微珠作為細胞培養(yǎng)載體，將微珠振蕩30s或手動上下?lián)u勻5min，按照微珠與t細胞的用量比為3：1取cd3/cd28微珠置于1.5mlep管中，添加1ml緩沖液清洗微珠，之后使用磁鐵從ep管向外吸微珠1min，棄洗液，重復(fù)兩次，再使用培養(yǎng)基將微珠重懸到原體積，將細胞和微珠混合后按2×10⁶pbmc/ml加到合適的培養(yǎng)瓶中。

6.day2將細胞密度調(diào)整至3-5×10⁶/ml，按病毒載體與細胞的比例為1:5添加實施例1制備得到的prrslin-slit2d2慢病毒表達載體，同時添加聚凝胺(polybrene)4μg/ml和40ng/mlil-2。4h之后，補加新鮮的完全培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整至1×10⁶/ml繼續(xù)培養(yǎng)。將所有的細胞離心，加入新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

7.每隔2-3天進行半量換液，維持細胞密度在0.5-1×10⁶/ml。

8.day10-12，細胞數(shù)量達到10⁹級別，在400g下離心5min得到免疫細胞，再用預(yù)冷的pbs洗滌兩遍(400g，5min)。

9.用血球計數(shù)板計數(shù)，流式細胞儀檢測細胞類群，cart細胞比例。每天觀察培養(yǎng)基的顏色變化、細胞密度、細胞形態(tài)并作相應(yīng)記錄。逐步擴大培養(yǎng)過程中，加入總體積所需的白細胞介素-2。

實施例4：工程細胞株的構(gòu)建及檢測

1.用于構(gòu)建高表達robo1工程細胞株的慢病毒的制備(具體制備方法見實施例2中的方法)。

2.人乳腺癌(mcf7)細胞的侵染：侵染前一天，接種5×10⁵個mcf7細胞于6孔板中，待第二天細胞長到80％時，加入包裝好的500μl的pd-l1病毒于6孔板中，同時設(shè)置對照細胞(不添加病毒)，12-16小時后換液，侵染3天后，流式分選robo1的陽性細胞。

3.工程細胞株的檢測：取分選的robo1的陽性細胞2×10⁵個，在轉(zhuǎn)速400g下離心5min，再用預(yù)冷的pbs洗滌兩遍，加入2.5μl的robo1的抗體(biolegend)避光孵育20min，離心，再用預(yù)冷的pbs洗滌1遍，100μlpbs重懸細胞，流式檢測robo1的表達，檢測結(jié)果參見附圖5，實驗結(jié)果證明工程細胞株構(gòu)建成功，可作為靶細胞用于后續(xù)殺傷實驗。

實施例5slit2d2-cart細胞體外活性檢測

采用ldh釋放法檢測slit2d2-cart細胞對工程細胞株mcf-1/robo1和高表達robo1的肝癌細胞系smcc7721細胞的殺傷效應(yīng)，通過elisa方法檢測ldh釋放。

1.用含5％小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)液將靶細胞調(diào)整到5×10⁴/ml。

2.在96孔細胞培養(yǎng)板中加入靶細胞，每孔加100μl。取3個孔作為效應(yīng)細胞(slit2d2-cart細胞)自然釋放對照孔，不加靶細胞，僅加100μl培養(yǎng)液。

3.向各孔加100μl效應(yīng)細胞，效應(yīng)細胞與靶細胞的比例50:1；25:1；10:1；5:1；1:1。自然釋放孔不加效應(yīng)細胞只加100μl培養(yǎng)液，效應(yīng)細胞與靶細胞共孵育6小時，每個實驗置三個復(fù)孔。

4.最大釋放孔中(陽性對照)加10μllysissolution(10×)，孵育45min-60min，每個實驗置三個復(fù)孔。

5.取上述3和4中待測樣品和對照樣品各50μl，加入新鮮的96孔酶標板中，再加入反應(yīng)液和底物，避光30min。

6.加入50μl終止液。

7.在酶聯(lián)檢測儀上測定各孔的光密度(od值)，檢測波長490nm或492nm，在1小時內(nèi)測完。

8.特異性殺傷效率計算

殺傷率＝實驗組ldh(od)/最大ldh釋放組(od)。

計算公式：殺傷效率＝(實驗組-效應(yīng)自然釋放-靶自然釋放)/(靶最大釋放-靶自然釋放)×100％

slit2d2car-t體外殺傷實驗結(jié)果參見附圖6，不同效靶比條件下slit2d2car-t細胞對mcf-7/robo1和smcc-7721腫瘤細胞的體外殺傷效果圖參見附圖7。由實驗結(jié)果顯示，制備的slit2d2car-t細胞能夠顯著殺傷高表達robo1的靶細胞株mcf-7/robo1和smcc7721，不同比例的效應(yīng)細胞slit2d2car-t與靶細胞共孵育4小時后，elisa實驗結(jié)果顯示，隨著效應(yīng)細胞:靶細胞比例的增加，細胞殺傷效率也逐漸增加(參見附圖7-8)，顯微成像顯示腫瘤細胞發(fā)生明顯死亡(參見附圖6)。