背景技術(shù)：
：X盒-結(jié)合蛋白1（Xbox-bindingprotein1,XBP1）mRNA為轉(zhuǎn)錄因子ATF6的誘導(dǎo)產(chǎn)物，XBP1mRNA編碼具有堿性亮氨酸拉鏈（basicleucinezipper，Bzip）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。XBPl作為未折疊蛋白反應(yīng)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，具有兩種類型：剪接型的XBPls和非剪接型的XBPlt。磷酸化激活肌醇依賴酶1（inositolrequiringenzyme1,IRE1）的核酸內(nèi)切酶活性，可以與底物XBP1t前體mRNA分子結(jié)合，并剪切其26個(gè)堿基的內(nèi)含子，產(chǎn)生新的mRNA轉(zhuǎn)錄本，翻譯生成有活性的轉(zhuǎn)錄因子X(jué)盒-結(jié)合蛋白1s（Xboxbindingprotein1splicing，XBP1s）。XBP1s進(jìn)入細(xì)胞核后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件的基因啟動(dòng)子結(jié)合，誘導(dǎo)CHOP、GRP78等分子伴侶和折疊酶基因的表達(dá)，上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解，加快蛋白折疊和錯(cuò)誤蛋白降解。XBPls參與細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)XBPls在肝細(xì)胞癌中高度表達(dá)，其通過(guò)與Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合物(HLA)基因啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控其表達(dá)。XBP1s是細(xì)胞分化的一個(gè)調(diào)控因子，可促進(jìn)細(xì)胞分化，Reimold等發(fā)現(xiàn)XBPl是調(diào)控肝細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，同位素示蹤技術(shù)證實(shí)XBPl基因敲除小鼠的肝組織中肝細(xì)胞生長(zhǎng)率降低、凋亡細(xì)胞增多。另有研究發(fā)現(xiàn)XBP1s可能通過(guò)激活JNK信號(hào)通路介導(dǎo)了IL-1β誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。XBPls與各種細(xì)胞的存活與凋亡密切相關(guān)。Gomez等研究發(fā)現(xiàn)，XBPls的過(guò)度表達(dá)能降低乳腺癌細(xì)胞中雌激素受體的依賴性，改變了許多與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期有關(guān)的基因表達(dá)，通過(guò)影響線粒體凋亡通路的活性促進(jìn)MCF-7和T47D細(xì)胞的存活。在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷過(guò)程中，XBPls具有重要的保護(hù)作用，過(guò)度表達(dá)XBPls能夠恢復(fù)XBPl缺失細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶的表達(dá)，起到保護(hù)細(xì)胞不受損傷的作用。對(duì)糖尿病腎臟損害的研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激細(xì)胞XBP1s的表達(dá)降低，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與壞死增加?？梢?jiàn)XBP1s與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程相關(guān)，通過(guò)對(duì)不同疾病模型中XBP1s表達(dá)水平的研究可為許多疾病的研究提供了新的思路，為進(jìn)一步闡明疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的方法。對(duì)XBP1s表達(dá)水平的研究除采用免疫組化、ELISA和Western免疫印跡等方法從蛋白水平進(jìn)行研究外，也可從mRNA水平研究XBP1s的表達(dá)水平,包括半定量反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR方法等。以蛋白為檢測(cè)目標(biāo)的方法通常操作比較繁瑣，耗時(shí)。半定量反轉(zhuǎn)錄PCR需要電泳檢測(cè)，準(zhǔn)確度不夠高。熒光定量PCR方法是一種高靈敏度、簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單,可應(yīng)用SYBRgreen染料法檢測(cè)，無(wú)需使用熒光探針，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，采用熒光定量PCR相對(duì)定量方法通過(guò)與表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定的管家基因比較來(lái)反映目的基因的表達(dá)水平，能很好的輔助XBP1s表達(dá)水平的研究，整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程只需1.2小時(shí)即可完成。細(xì)胞管家基因需選擇維持細(xì)胞最低限度功能所不可少的、在所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類基因，且表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小。有研究表明比較常用的actin管家基因受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響，表達(dá)量會(huì)減少，不適宜用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的參考基因。核糖體蛋白基因產(chǎn)物是維持細(xì)胞生命活動(dòng)所必須的，表達(dá)于所有細(xì)胞中，其表達(dá)只受啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制調(diào)節(jié),可用作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的參考基因。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)人源性XBP1s基因的特異性引物和核糖體蛋白R(shí)PL19基因的特異性引物，將其用于XBP1s基因表達(dá)水平的檢測(cè)。本發(fā)明的工作原理是應(yīng)用熒光定量PCRSYBRgreen熒光染料的方法根據(jù)相對(duì)定量原理，即2-△△CT法確定基因表達(dá)水平。本發(fā)明包含兩套引物系統(tǒng)，一套引物是針對(duì)人源性XBP1s基因的特異性引物；另一套引物是針對(duì)人的核糖體蛋白R(shí)PL19基因設(shè)計(jì)的特異性引物。根據(jù)NCBI公布的humanXBP1smRNA序列（序列號(hào)：NM_001079539.1）設(shè)計(jì)XBP1s引物序列見(jiàn)表1：表1.XBP1s引物設(shè)計(jì)引物名稱序列F-XBP1sCTGAGTCCGCAGCAGGTGR-XBP1sTGTCCAGAATGCCCAACAGG根據(jù)NCBI公布的humanRPL19的mRNA序列（序列號(hào)：NM_000981.3）設(shè)計(jì)引物序列見(jiàn)表2：表2.RPL19引物設(shè)計(jì)引物名稱序列F-rplCGAGCGAGCTCTTTCCTTTR-rplAGACCTTCTTCTTGCCACAGC技術(shù)效果本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩套引物可特異性檢測(cè)XBP1s和RPL19基因的mRNA表達(dá)水平，無(wú)非特異性擴(kuò)增，所選擇的管家基因表達(dá)水平不受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響，可對(duì)XBP1s基因的表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量。本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)采用SYBRgreen熒光染料方法，無(wú)需使用探針，試劑使用方便，只需加入相關(guān)檢測(cè)模板即可，不需要繁瑣的操作步驟，檢測(cè)只需1.2h即可完成。附圖與說(shuō)明附圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中XBP1s和RPL19基因擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線，其中A圖為XBP1s基因擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線；B圖為RPL19基因擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線。附圖2.為本發(fā)明實(shí)施例2中Manf蛋白對(duì)PD細(xì)胞模型XBP1s基因表達(dá)水平的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實(shí)施例中采用諾唯贊的AcetaqSYBRsupermix，采用25微升反應(yīng)體系，熒光定量PCR儀采用ABI7500。利用本發(fā)明的特異性引物組合和方法檢測(cè)人源性XBP1s基因表達(dá)水平時(shí)，基本操作為：步驟1.細(xì)胞RNA提取采用商品化試劑盒提取細(xì)胞RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，并控制提取質(zhì)量OD260/280～2.0。本發(fā)明實(shí)施例采用天根總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行；步驟2.cDNA反轉(zhuǎn)錄取大約500ngRNA采用商品化試劑盒進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。本實(shí)施例采用Takara的商品化試劑盒PrimeScriptTMRTMasterMix（PerfectRealTime）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行；步驟3.熒光定量PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中每種模板分別加入兩種熒光定量PCR反應(yīng)體系中分別進(jìn)行XBP1s和RPL19基因檢測(cè)，一種反應(yīng)體系包含組分如下：1×AcetaqSYBRsupermix上游引物（F-XBP1s）　　各0.1～0.5μM下游引物（R-XBP1s）各0.1～0.5μM模板（1:5稀釋的cDNA)5μl總體積25μl另一種為：1×AcetaqSYBRsupermix上游引物（F-rpl）　　各0.1～0.5μM下游引物（R-rpl）各0.1～0.5μM模板（1:5稀釋的cDNA)5μl總體積25μl熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃5min，然后再運(yùn)行40個(gè)循環(huán)（具體95℃10s，60℃34s），退火時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后可進(jìn)行融解曲線分析引物擴(kuò)增反應(yīng)的特異性；步驟4.檢測(cè)結(jié)果分析根據(jù)系統(tǒng)自動(dòng)基線和對(duì)數(shù)期閾值設(shè)置獲得各個(gè)反應(yīng)的CT值，計(jì)算2-△△CT值，即實(shí)驗(yàn)組XBP1s基因mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較的倍數(shù)，△△CT=（CTXBP1s（實(shí)驗(yàn)組）-CTrpl19（實(shí)驗(yàn)組））-（CTXBP1s（對(duì)照組）-CTrpl19（對(duì)照組））。實(shí)施例一慢病毒感染細(xì)胞中XBP1s基因表達(dá)水平分析將含有GRP78基因干擾序列的包裝慢病毒體外感染293T細(xì)胞。24孔板中接種293T細(xì)胞，接種密度3*105/ml。培養(yǎng)24h后細(xì)胞密度約為50%-60%，按MOI2:1進(jìn)行慢病毒感染，并設(shè)不加病毒陰性對(duì)照。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，更換新鮮的含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，吸去上清，PBS清洗三遍，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA。分別取500ngRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用熒光定量PCR法檢測(cè)XBP1s基因的表達(dá)水平，以RPL19作為內(nèi)參，并與未加病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行比較。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3：表3.慢病毒感染細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞XBP1s表達(dá)水平的比較表3結(jié)果表明，慢病毒感染細(xì)胞XBP1s基因表達(dá)水平較對(duì)照組細(xì)胞明顯升高，是對(duì)照組細(xì)胞的2.33倍，說(shuō)明慢病毒感染可使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，誘導(dǎo)XBP1s基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。XBP1s和RPL19引物擴(kuò)增的溶解曲線均只出現(xiàn)單一的融解峰（見(jiàn)圖1），說(shuō)明引物特異性較好，無(wú)非特異性擴(kuò)增。實(shí)施例二通過(guò)檢測(cè)XBP1s的表達(dá)水平研究帕金森病細(xì)胞模型中Manf蛋白的保護(hù)作用采用6-羥基多巴胺(6-OHDA)制作SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森病細(xì)胞模型檢測(cè)Manf蛋白的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（DMEM）組、6-OHDA（50μmol/L）組以及6-OHDA（50μmol/L）+Manf（4μg/ml）組。預(yù)先給予Manf蛋白4h后加入6-OHDA作用1h、2h和6h后分別收集細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用熒光定量PCR測(cè)定XBP1s基因的表達(dá)水平。通過(guò)與對(duì)照組比較，計(jì)算出各組XBP1s的相對(duì)表達(dá)水平（見(jiàn)圖2），結(jié)果表明在Manf蛋白存在情況下，經(jīng)過(guò)1小時(shí)后，6-OHDA即可誘導(dǎo)細(xì)胞XBP1s基因表達(dá)，較對(duì)照組明顯升高，2h和6h后，XBP1s基因表達(dá)水平持續(xù)升高；而6-OHDA組XBP1s水平在6h后才檢測(cè)到升高，說(shuō)明Manf蛋白的存在有助于應(yīng)激條件下XBP1s的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提示MANF蛋白可能通過(guò)提高XBP1s的表達(dá)發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用。通過(guò)上述的實(shí)施例可以知道，本發(fā)明的特異性引物組合及相應(yīng)的方法，可以特異性檢測(cè)人源性XBP1s基因的表達(dá)水平，避免同源性基因的干擾，并以不受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響的RPL19作為內(nèi)參，提高了人源性XBP1s基因表達(dá)水平的檢測(cè)準(zhǔn)確性，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單、高效。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院<120>一種用于檢測(cè)人源性X盒結(jié)合蛋白1s基因表達(dá)水平的引物組合及其應(yīng)用<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>PCR擴(kuò)增引物<400>1ctgagtccgcagcaggtg18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>PCR擴(kuò)增引物<400>2tgtccagaatgcccaacagg20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>PCR擴(kuò)增引物<400>3cgagcgagctctttccttt19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>PCR擴(kuò)增引物<400>4agaccttcttcttgccacagc21當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3