本發(fā)明屬于生物技術領域，具體而言，本發(fā)明涉及用于轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分檢測的寡核苷酸引物和熒光標記探針，包含所述引物探針的試劑盒，用于測定轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的數字pcr檢測方法以及樣品中轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物和探針在檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分中的應用。

背景技術：

隨著轉基因產品的大量研究及其在日常生活中的廣泛應用，轉基因產品對人類健康以及生存環(huán)境所帶來的安全性問題已經引起世人的廣泛關注及爭論。因此，世界各國在積極研究轉基因技術的同時，也對各種轉基因食品的檢測分析方法進行了大量研究。但由于轉基因種類多，數量大，尤其是很多轉基因食品經過深加工和各種條件處理保存后，轉基因成分大量降解，檢測難度加大。因此，需要根據科學技術的發(fā)展不斷更新和發(fā)展各種轉基因食品的檢測技術，以加強轉基因食品監(jiān)督、監(jiān)測和管理，減少其商品化可能帶來的風險，同時保護公眾健康、保護廣大消費者知情權和選擇權。

目前，世界各國出于經濟、衛(wèi)生、環(huán)保等各種目的紛紛對轉基因生物及其產品加強管理和檢測。包括中國在內的50個左右國家和地區(qū)相繼頒布并實行了“轉基因標識制度”，對轉基因生物及其加工產品進行標識和管理。近年來，隨著各國有關gmo（geneticallymodifiedorganism）標簽法的建立和不斷完善，對食品中的gmo含量下限已有所規(guī)定。很多國家不但要求對轉基因食品進行定性檢測，還需要對食品中的gmo含量進行定量檢測，以便標識,其標識的閾值一般在0.9%–5%之間。而建立轉基因產品的檢測技術標準尤其是精準定量檢測技術是實施轉基因產品標識的技術前提。因此，轉基因成分的精準定量技術將隨著全世界標識制度的完善和發(fā)展日趨重要。

數字pcr(digitalpolymerasechainreaction，dpcr)作為更精確和更靈敏的dna定量檢測新技術，實現了單分子dna的絕對定量。dpcr是在普通數字pcr基礎上建立起來的dna絕對定量方法，解決了普通數字pcr所用的標準曲線對測量結果產生影響等問題，并可減少其帶來的基體效應。dpcr具有測量獨立性與無需任何校準物的特點。

我國轉基因水稻研究處于國際領先水平，dpcr技術的出現為大米轉基因成分定量檢測開辟了新的途徑，使得食品中大米轉基因成分的定量分析與溯源成為可能。利用dpcr技術提升定量檢測方法的準確性與實用價值將成為轉基因精準定量檢測技術發(fā)展的一個重要方向。

技術實現要素：

本發(fā)明的一個目的在于，提供精準定量檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物和熒光標記探針。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供精準定量測定轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的數字pcr檢測試劑盒。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供精準定量測定轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的數字pcr檢測方法。

本發(fā)明的還一個目的在于，提供轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物和探針在精準定量檢測食品中轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分中的應用。

針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

本發(fā)明的發(fā)明人根據轉基因大米科豐6號外源插入位點與大米基因組交界處設計了能特異性鑒別轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的寡核苷酸引物對和探針，能從樣品dna中高效特異擴增出一段較短的轉基因大米特異性基因片段。根據本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明提供用于數字pcr方法檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對和熒光標記探針，所述引物對和探針是根據轉基因大米科豐6號品系特異性基因與其他品系轉基因作物具有差異性的特點而設計的。所述引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物為kf6-lfcacgacccggccagttaag（seqidno.1），所述下游引物為kf6-lrcattaagaacgtccgcaatgtgt（seqidno.2）；所述探針為kf6-lpcccgaattaattcgggggatctgga（seqidno.3），在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團bhq1，5’端連接有一個熒光報告基團fam。在一個實施方案中，本發(fā)明提供的轉基因大米特異性檢測組合物，所述組合物包含特異性寡核苷酸引物對和探針。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于數字pcr方法定量檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的組合物，所述組合物包含轉基因大米特異性寡核苷酸引物對和探針，其中所述轉基因大米特異性引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為seqidno.1，所述下游引物的堿基序列為seqidno.2；所述探針的堿基序列為seqidno.3，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團bhq1，5’端連接有一個熒光報告基團fam。

根據本發(fā)明的另一個實施方案，本發(fā)明提供轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的數字pcr定量檢測方法，所述方法包括使用針對轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對和探針，所述引物對和探針是根據轉基因大米科豐6號品系特異性基因的唯一性而設計。在一個實施方案中，本發(fā)明的轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的數字pcr定量檢測方法中，所使用的轉基因大米特異性寡核苷酸引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為seqidno.1，所述下游引物的堿基序列為seqidno.2；所述探針的堿基序列為seqidno.3，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團bhq1，5’端連接有一個熒光報告基團fam。在一個實施方案中，所述的pcr擴增條件為95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50個循環(huán)；98℃10min（1℃/s）。

在一個實施方案中，本發(fā)明的轉基因大米數字pcr定量檢測方法還進一步包括確定特異性寡核苷酸引物和探針組合的定量檢測限的步驟。在一個實施方案中，所述數字pcr檢測方法定量檢測出轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的檢測靈敏度為1copy/μl。

根據本發(fā)明的另一個實施方案，本發(fā)明提供用于精準定量檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明用于數字pcr方法檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對以及探針和使用說明書。在本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分定量檢測特異性寡核苷酸引物對是根據該品系特異性基因與其他任何一種轉基因作物的序列均具有差異性的特點而設計的。在一個實施方案中，所述試劑盒的轉基因大米特異性寡核苷酸引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為seqidno.1，所述下游引物的堿基序列為seqidno.2；所述試劑盒中探針的堿基序列為seqidno.3，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團bhq1，5’端連接有一個熒光報告基團fam。根據本發(fā)明的另一個實施方案，本發(fā)明提供用于精準定量檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的用于數字pcr方法鑒別轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對和探針以及使用說明書。在試劑盒的一個優(yōu)選實施方案中，所述試劑盒中包含轉基因大米特異性寡核苷酸引物對seqidno.1、seqidno.2和轉基因大米特異性探針seqidno.3，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團bhq1，5’端連接有一個熒光報告基團fam。在優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒的使用說明書中包括對用于快速檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的數字pcr擴增條件的描述。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒的說明書中給出的pcr擴增條件是95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50個循環(huán)；98℃10min（1℃/s）。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明用于轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分定量檢測的試劑盒還包括對照品。優(yōu)選地，對照品包括陰性對照品和陽性對照品。在一個實施方案中，陰性對照為無菌雙蒸水。

根據本發(fā)明的再一個實施方案，本發(fā)明提供本發(fā)明的用于數字pcr方法檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物和探針在檢測食品中轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分中的應用。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供果汁中轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對seqidno.1、seqidno.2和轉基因大米特異性探針seqidno.3，在轉基因大米its基因探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團bhq1，5’端連接有一個熒光報告基團fam。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的試劑盒在定量檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的應用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上述應用中，所述試劑盒包括本發(fā)明的轉基因大米特異性寡核苷酸引物對和探針。更優(yōu)選的，在本發(fā)明的上述應用中，所述試劑盒包括本發(fā)明的轉基因大米特異性寡核苷酸引物對和探針在檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分中的應用。

本發(fā)明以轉基因大米品系科豐6號的基因組為參考模板，根據該品系特異性基因序列與其他轉基因作物基因具有差異性的特點設計引物，利用數字pcr法定量檢測樣品中的轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分。

數字pcr技術(digitalpolymerasechainreaction，dpcr)是通過將微量樣品分級作大倍數稀釋和細分，直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不會超過1個后，再將所有細分試樣同時在相同條件下進行pcr放大，按照泊松分布原理逐個進行計數的一種技術，是一種絕對定量測量方法。

本發(fā)明的數字pcr檢測方法不依賴于擴增曲線的循環(huán)閾值，也不需要看家基因和標準曲線，是dna絕對定量方法，具有結果可靠和準確靈敏等優(yōu)點。本發(fā)明的按照引物序列制成的試劑盒，用于此類產品的精準定量和低含量靈敏定性檢測，具有定量結果準確、檢測靈敏度高、特異性強、結果穩(wěn)定可靠且避免交叉污染造成假陽性的優(yōu)點。使用本發(fā)明的數字pcr檢測方法和pcr檢測試劑盒，可對轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分進行精準定量檢測，其定量檢測限能達到單拷貝/μl，適合用于國內外市場上米制品中轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的實際定量檢測需求。

附圖說明

圖1顯示的是通過實時熒光pcr擴增轉基因大米科豐6號品系特異性基因序列的結果，其中基線上方為轉基因大米科豐6號品系樣品及陽性對照的擴增曲線，基線下方為轉基因大米m12、克螟稻、轉基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、轉基因玉米nk603、mon88017及非轉基因大米、大豆、玉米、空白對照（無菌雙蒸水）。

圖2顯示的是數字pcr精準定量檢測轉基因大米科豐6號及其他轉基因作物的結果圖，其中從左到右依次為轉基因大米科豐6號、轉基因大米m12、克螟稻、轉基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、轉基因玉米nk603、mon88017及非轉基因大米、大豆、玉米、空白對照（無菌雙蒸水）。

表1是對數字pcr精準定量檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的準確性和靈敏度進行評價，將轉基因大米樣品基因組dna原液分別稀釋5倍、25倍、250倍，每個梯度重復3次實驗，進行數字pcr擴增。與理論值相比計算定量結果的偏差，并根據3次重復實驗結果計算其sd和rsd值。

圖3是利用本發(fā)明建立的數字pcr技術對理論含量為1copy/μl的科豐6號低含量模擬樣品進行精準定量的數字pcr微滴分布圖。從左到右，分別為4個平行，每個平行均進行了2次重復實驗。

具體實施方式

通過實施例的方式對本發(fā)明作進一步的說明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實施例。

實施例1

本發(fā)明的發(fā)明人首次通過實時熒光pcr（探針法）擴增轉基因大米科豐6號品系特異性基因。所使用的轉基因大米科豐6號品系特異性基因引物探針序列為上游引物kf6-lfcacgacccggccagttaag（seqidno.1），下游引物為kf6-lrcattaagaacgtccgcaatgtgt（seqidno.2）；探針為kf6-lpcccgaattaattcgggggatctgga（seqidno.3）。

1.所使用的檢測主要儀器：

微量移液器（eppendorf）、熒光定量pcr儀（ab7500）、高速臺式離心機(12000r/min)、電泳儀(dyy22c型)等。

2.檢測主要試劑：

2×taqmanuniversalpcrmastermix(abi)，引物探針（thermofisher）等。

3.檢測主要步驟：

實時熒光pcr反應體系：

2×mastermix12.5μl

上游引物（10mm）1.0μl

下游引物（10mm）1.0μl

探針（10mm）0.5μl

模板dna50ng

加無菌雙蒸水至總體積為25μl

注：每次pcr檢測均設立相應的空白對照（用配制反應體系的超純水代替dna模板，檢測試劑是否受到污染）；

4實時熒光pcr反應參數：

95℃10min

95℃15s

60℃1min

注：不同儀器應將pcr各試劑及反應參數做適當調整。

如圖1所示，利用實時熒光pcr檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因時，科豐6號品系樣品可出現擴增曲線，其他品系轉基因大米m12、克螟稻、轉基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、轉基因玉米nk603、mon88017及非轉基因大米、大豆、玉米、空白對照均未出現熒光曲線，表明該引物探針對轉基因大米科豐6號品系具有特異性。

實施例2

本實施例為通過使用轉基因大米科豐6號品系特異性引物探針序列經數字pcr定量檢測轉基因大米基因的拷貝數。所使用的轉基因大米科豐6號品系特異性引物探針序列為上游引物為kf6-lfcacgacccggccagttaag（seqidno.1），下游引物為kf6-lrcattaagaacgtccgcaatgtgt（seqidno.2）；探針為kf6-lpcccgaattaattcgggggatctgga（seqidno.3）（seqidno.3）。

1.所使用的檢測主要儀器：

微量移液器（eppendorf）、微滴式數字pcr儀（bio-rad,qx200）、高速臺式離心機(12000r/min)等。

2.檢測主要試劑：

2×taqmanmastermix(bio-rad)，引物探針（thermofisher）等。

3.檢測主要步驟：

數字pcr反應體系：

2×mastermix10μl

上游引物（10mm）1.0μl

下游引物（10mm）1.0μl

探針（10mm）0.5μl

模板dna5.0μl

無菌雙蒸水2.5μl

注：每次pcr檢測均設立相應的空白對照（用配制反應體系的超純水代替dna模板，檢測試劑是否受到污染）；

4.數字pcr反應參數：

95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50個循環(huán)；98℃10min（1℃/s）

注：不同儀器應將pcr各試劑及反應參數做適當調整。

如圖2所示，利用數字pcr精準定量檢測同樣dna濃度的轉基因大米及其他樣品時，成功檢測出轉基因大米的量為861copies/μl，而其他品系轉基因大米m12、克螟稻、轉基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、轉基因玉米nk603、mon88017及非轉基因大米、大豆、玉米、空白對照均無擴增，表明該方法可準確特異的檢測出樣品中的轉基因大米科豐6號成分。

實施例3

與實施例2所述的方法相同，只是將轉基因大米樣品基因組dna先稀釋5倍后再進行3個梯度的10倍稀釋后作為模板，每個稀釋梯度重復3次，采用轉基因大米科豐6號擴增引物探針序列與實施例2中的相同，進行數字pcr定量檢測，以測定方法靈敏度。

如表1所示，將轉基因大米樣品基因組dna原液稀釋5倍、25倍、250倍后的含量分別為168copies/μl、34.5copies/μl、3.65copies/μl，與理論值的偏差分別為-2.44、0.15、1.74，基本符合其理論拷貝數值，各稀釋梯度的3次重復的rsd值分別為3.61%、4.28%、13.8%（表1），表明該精準定量檢測方法檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分時準確性和靈敏度較好，可對不同含量的該品系特異性基因成分進行精準定量。

實施例4

本實施例中提供精準定量檢測轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的試劑盒。所述試劑盒包括本發(fā)明的用于數字pcr方法鑒別轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對和探針以及使用說明書。所述試劑盒包括引物對seqidno.1、seqidno.2和轉基因大米特異性探針seqidno.3，在轉基因大米tt51-1品系特異性基因探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團bhq1，5’端連接有一個熒光報告基團fam，所述使用說明書中給出了pcr擴增條件，該條件為95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50個循環(huán)；98℃10min（1℃/s）。對于不同儀器，反應參數做適當調整。與實施例3所述的方法相同，對理論含量為1.00copies/μl的科豐6號低含量模擬樣品進行dpcr擴增，每個樣品重復2次，共設置4個平行。

如圖3所示，科豐6號理論濃度為單拷貝/μl時，8份平行樣品定量結果分別為1.2copies/μl、1.23copies/μl、1.5copies/μl、1.86copies/μl、1.35copies/μl、1.19copies/μl、1.71copies/μl、1.31copies/μl、copies/μl、copies/μl，與理論含量值的平均偏差在8.72%，8份樣品的平均rsd為19.74%，結果顯示，表明該方法對于精準定量檢測低含量的轉基因大米科豐6號品系特異性基因成分時方法精密度和重現性均較好。

由于目前的數字pcr平臺分為微滴式和芯片式兩種，本發(fā)明通過在不同平臺進行實施例分析，驗證了本發(fā)明所建立的方法對于這兩個平臺同時適用。雖然已經對本發(fā)明的具體實施方案進行了描述，但是本領域技術人員應認識到，在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的前提下可以對本發(fā)明進行多種改變與修飾，。因而，本發(fā)明意欲涵蓋落在附屬權利要求書及其同等物范圍內的所有這些改變與修飾。

表1