發(fā)明領域
本發(fā)明涉及結腸直腸癌的預后，具體涉及用于這種癌癥預后的方法和試劑盒。
背景技術：
結腸直腸癌(CRC)，也被稱為結腸癌或大腸癌，在美國是第五最常見的癌癥形式，在中國是第四常見癌癥而在歐洲是引起癌癥相關死亡的第三主要原因。CRC的早期發(fā)現(xiàn)仍然是公共健康的主要挑戰(zhàn)。事實上，CRC通常是可治愈的，特別是在早期階段被診斷時。在不同國家已采取若干篩查策略。常規(guī)CRC篩查測試包括糞便隱血測試(FOBT)、乙狀結腸鏡檢、結腸鏡檢、氣鋇雙重造影或直腸指檢。它們都具有優(yōu)點和局限性，但依從性仍低于預期，主要是由于后勤(logistics)或患者的不適。
數(shù)年來，尋找用于早期檢測CRC的血液標記物成為焦點，特別是因為其便利性。同時，非常少量的研究支持了基于血液的測試的可行性，其表明血液中的基因生物標記物可區(qū)分CRC患者與對照。這些研究基于流式細胞術，其為計數(shù)并檢驗微觀顆粒例如細胞的技術(通過將它們懸浮于液體流并使其通過電子檢測裝置)。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要與免疫細胞活化和運輸相關。特別地，他們證明天然殺傷細胞(NK細胞)代表外周血樣品中重要的生物標記物。他們沒有使用經典的流式細胞技術，而是在全血中確定差異表達基因。通過在全血中分析轉錄本確定基因表達水平是不常見的，因為本領域技術人員普遍承認當稀釋于復雜的RNA混合物(總RNA)中時，在沒有特異性純化步驟的情況下獲取特定信息是困難的。本方法的優(yōu)點是其還避免了純化RNA的步驟。
因此，本發(fā)明涉及用于在來自患者的外周血樣品中確定結腸直腸癌預后的方法，所述方法包括：
a)獲得所述外周血樣品并從所述血液樣品提取總RNA，
b)使所述總RNA與至少一種對至少一種NK細胞基因特異的試劑和不多于25種對25種NK細胞基因特異的試劑接觸，
c)確定所述至少一種NK細胞基因和至多25種NK細胞基因的表達水平以獲得所述患者的表達譜，
d)用之前臨床分類為好的預后的患者的NK細胞基因表達譜和之前分類為差的預后的患者的NK細胞基因表達譜對所述患者的表達譜進行分析，其中
-如果所述患者的表達譜與來自之前臨床分類為差的預后的患者的表達譜聚類(cluster)，則確定所述患者具有差的預后，和
-如果所述患者的表達譜與來自之前臨床分類為好的預后的患者的表達譜聚類，則確定所述患者具有好的預后。
具體地，在上述步驟b)中，使總RNA與至少一種對至少一種NK細胞基因特異的試劑和不多于25種對25種NK細胞基因特異的試劑接觸，所述NK細胞基因包括SEQ ID NO:1-12所示的核酸序列，其中所述至少一種試劑對選自以下的至少一種NK細胞基因特異：
(i)KLRB1基因，其包含例如SEQ ID NO:1所示的全長序列，
(ii)KLRC2基因，其包含例如SEQ ID NO:2、3或4所示的全長序列，
(iii)KLRC3基因，其包含例如SEQ ID NO:5、6或7所示的全長序列，
(iv)KLRD1基因，其包含例如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示的全長序列，和
(v)KLRK1基因，其包含例如SEQ ID NO:13所示的全長序列，和
在步驟c)中確定所述至少一種NK細胞基因的表達水平以獲得患者的表達譜。
如在實驗數(shù)據(jù)中所詳述的，至少一種上述基因的表達水平對預測CRC風險是足夠的信息。
在一個實施方案中，在步驟b)中使所述總RNA與對至少5種NK細胞基因和不多于25種NK細胞基因的組合特異的試劑接觸，其中所述試劑至少包括對以下的NK細胞基因特異的試劑：
(i)KLRB1基因，其包含例如SEQ ID NO:1所示的全長序列，
(ii)KLRC2基因，其包含例如SEQ ID NO:2、3或4所示的全長序列，
(iii)KLRC3基因，其包含例如SEQ ID NO:5、6或7所示的全長序列，
(iv)KLRD1基因，其包含例如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示的全長序列，和
(v)KLRK1，其包含例如SEQ ID NO:13所示的全長序列，
在步驟c)中確定至少所述4種NK細胞基因的表達水平以獲得患者的表達譜。
另外，在步驟b)中，可使所述總RNA與至少一種對至少一種靶細胞基因特異的試劑和不多于5種對5種靶細胞基因特異的試劑接觸，所述靶細胞基因包括SEQ ID NO:12-24所示的核酸序列，其中所述至少一種試劑對至少一種選自以下的靶細胞基因特異：
(i)GZMB基因，其包含例如SEQ ID NO:14、15、16或17所示的全長序列，
(ii)CD247基因，其包含例如SEQ ID NO:18、19或20所示的全長序列，
(iii)RRAS2基因，其包含例如SEQ ID NO:21或22所示的全長序列，和
(iv)SH2D1B基因，其包含例如SEQ ID NO:23或24所示的全長序列，和
(v)LCK基因，其包含例如SEQ ID NO:25、26、27、28、29或30所示的全長序列，和
在步驟c)中確定所述至少一種靶細胞基因的表達水平以獲得患者的表達譜；而在一個實施方案中，使所述總RNA與對5種靶細胞基因的組合特異的試劑接觸，其中所述試劑對以下靶細胞基因特異：
(i)GZMB基因，其包含例如SEQ ID NO:14、15、16或17所示的全長序列，
(ii)CD247基因，其包含例如SEQ ID NO:18、19或20所示的全長序列，
(iii)RRAS2基因，其包含例如SEQ ID NO:21或22所示的全長序列，和
(iv)SH2D1B基因，其包含例如SEQ ID NO:23或24所示的全長序列，和
(v)LCK基因，其包含例如SEQ ID NO:25、26、27、28、29或30所示的全長序列，和
在步驟c)中確定所述至少5種細胞基因的表達水平以獲得患者的表達譜。
在另一個實施方案中，在步驟b)中，進一步使所述總RNA與至少一種對至少一種靶細胞基因特異的試劑和不多于100種對100種靶細胞基因特異的試劑接觸，所述靶細胞基因包括SEQ ID NO:25-59所示的核酸序列，其中所述至少一種試劑對選自以下的至少一種靶細胞基因特異：
(i)MRPS6基因，其包含例如SEQ ID NO:31、32或33所示的全長序列，
(ii)SPRY4基因，其包含例如SEQ ID NO:34所示的全長序列，
(iii)NEAT1基因，其包含例如SEQ ID NO:35所示的全長序列，
(iv)CYBB基因，其包含例如SEQ ID NO:36所示的全長序列，
(v)DUSP2基因，其包含例如SEQ ID NO:37所示的全長序列，
(vi)PDEAD基因，其包含例如SEQ ID NO:38或39所示的全長序列，
(vii)SH2D2A基因，其包含例如SEQ ID NO:40、41或42所示的全長序列，
(viii)INSR基因，其包含例如SEQ ID NO:43或44所示的全長序列，
(ix)ITGAM基因，其包含例如SEQ ID NO:45所示的全長序列，
(x)VCAN基因，其包含例如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的全長序列，
(xi)CD163基因，其包含例如SEQ ID NO:50或51所示的全長序列，
(xii)P2RY10基因，其包含例如SEQ ID NO:52或53所示的全長序列，
(xii)CD226基因，其包含例如SEQ ID NO:54所示的全長序列，
(xiii)MRPL10基因，其包含例如SEQ ID NO:55或56所示的全長序列，
(xiv)ITPRIPL2基因，其包含例如SEQ ID NO:57所示的全長序列，
(xv)CD2基因，其包含例如SEQ ID NO:58所示的全長序列，和
(xvi)NUDT16基因，其包含例如SEQ ID NO:59所示的全長序列，和
在步驟c)中確定所述至少一種靶細胞基因的表達水平以獲得患者的表達譜。
特別地，在步驟b)中使所述總RNA與對至少17種靶細胞基因和不多于100種靶細胞基因的組合特異的試劑接觸，其中所述試劑至少包括對以下的靶細胞基因特異的試劑：
(i)MRPS6基因，其包含例如SEQ ID NO:31、32或33所示的全長序列，
(ii)SPRY4基因，其包含例如SEQ ID NO:34所示的全長序列，
(iii)NEAT1基因，其包含例如SEQ ID NO:35所示的全長序列，
(iv)CYBB基因，其包含例如SEQ ID NO:36所示的全長序列，
(v)DUSP2基因，其包含例如SEQ ID NO:37所示的全長序列，
(vi)PDEAD基因，其包含例如SEQ ID NO:38或39所示的全長序列，
(vii)SH2D2A基因，其包含例如SEQ ID NO:40、41或42所示的全長序列，
(viii)INSR基因，其包含例如SEQ ID NO:43或44所示的全長序列，
(ix)ITGAM基因，其包含例如SEQ ID NO:45所示的全長序列，
(x)VCAN基因，其包含例如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的全長序列，
(xi)CD163基因，其包含例如SEQ ID NO:50或51所示的全長序列，
(xii)P2RY10基因，其包含例如SEQ ID NO:52或53所示的全長序列，
(xii)CD226基因，其包含例如SEQ ID NO:54所示的全長序列，
(xiii)MRPL10基因，其包含例如SEQ ID NO:55或56所示的全長序列，
(xiv)ITPRIPL2基因，其包含例如SEQ ID NO:57所示的全長序列，
(xv)CD2基因，其包含例如SEQ ID NO:58所示的全長序列，和
(xvi)NUDT16基因，其包含例如SEQ ID NO:59所示的全長序列，和
在步驟c)中確定所述至少17種靶細胞基因的表達水平以獲得患者的表達譜。
更確切地，上文描述的方法中，步驟b)中所述的至少一種特異性試劑包括至少一種雜交探針，具體地包括至少一種雜交探針和至少一種引物，而更具體地包括至少一種雜交探針和兩種引物。
總RNA包括轉運RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)(例如從靶基因轉錄和從任何其它基因轉錄的mRNA)和核糖體RNA。
意在說明，總RNA的提取可通過裂解存在于血液樣品中的細胞以釋放出患者細胞所包含的核酸的步驟實現(xiàn)。意在舉例，可使用如在專利申請WO00/05338(其關于混合磁性和機械裂解)、WO 99/53304(其關于電裂解)、WO99/15321(其關于機械裂解)中描述的裂解方法。本領域技術人員可使用其它公知的裂解方法，例如熱休克或滲透休克或使用離液劑例如胍鹽的化學裂解(美國專利號5,234,809)。還可能提供額外的步驟，用于從在裂解步驟中釋放的其它細胞成分分離核酸。這通常使?jié)饪s核酸成為可能。意在舉例，可使用任選地通過吸附或共價作用用寡核苷酸包被的磁性顆粒(在這方面， 見美國專利號4,672,040和美國專利號5,750,338)，并由此可通過洗滌步驟純化結合于這些磁性顆粒的核酸。如果需要隨后擴增所述核酸，此核酸純化步驟是特別有利的。在專利申請WO-A-97/45202和WO-A-99/35500中描述了這些磁性顆粒特別有利的實施方案。
術語“特異性試劑”是指這樣的試劑，當使其與如上述定義的生物學材料接觸時，可與對所述靶基因特異的材料相結合。意在說明，當特異性試劑和生物學材料是核來源時，使特異性試劑與生物學材料接觸可使特異性試劑與對所述靶基因特異的材料雜交。術語“雜交”是指這樣的過程，即在所述過程期間在適當?shù)臈l件下，兩個核苷酸片段以穩(wěn)定和特異的氫鍵結合從而形成雙鏈復合物。這些氫鍵在互補的腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))堿基之間(這被稱為A-T鍵)，或在互補的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)堿基之間(這被稱為G-C鍵)形成。兩個核苷酸片段的雜交可為完全的(稱作互補核苷酸片段或序列)，即在此雜交過程中所獲得的雙鏈復合物只包含A-T鍵和C-G鍵。此雜交可為部分的(稱作充分互補核苷酸片段或序列)，即所獲得的雙鏈復合物既包含使得可能形成雙鏈的A-T鍵和C-G鍵，也包含沒有與互補堿基結合的堿基。兩條核苷酸片段之間的雜交取決于所使用的工作條件，特別是嚴格性。嚴格性具體定義為兩個核苷酸片段的堿基組成的函數(shù)并且還由兩條核苷酸片段之間的錯配程度定義。嚴格性還取決于反應參數(shù)，例如存在于雜交溶液中的離子濃度和類型、變性劑的性質和濃度和/或雜交溫度。所有這些數(shù)據(jù)是公知的，并且可由本領域技術人員確定適當?shù)臈l件。一般來說，根據(jù)需要雜交的核苷酸片段的長度，雜交溫度為大約20℃至70℃，特別是35℃至65℃，在濃度大約0.5-1M的鹽溶液中。序列，或核苷酸片段，或寡核苷酸，或多核苷酸，是一系列通過磷酸酯鍵組裝在一起的核苷酸基序，特征為含信息的天然核酸序列，其能夠與核苷酸片段雜交，所述系列可能含有具有不同結構的單體，并可能從天然核酸分子和/或通過遺傳重組和/或通過化學合成獲得?；蚴菃误w的衍生物，所述單體可為核酸的天然核苷酸，其構成元件是糖、磷酸基團和含氮堿基；在DNA中，所述糖是脫氧-2-核糖，在RNA中，所述糖是核糖；根據(jù)是否涉及DNA和RNA，含氮堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；可選地，單體為三種構成元件中的至少一種被修飾的核苷酸；意在舉例，修飾可發(fā)生在堿基水平(具有修飾的堿基例如肌苷、甲基-5-脫氧胞苷、 脫氧尿苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷、二氨基-2,6-嘌呤、溴-5-脫氧尿苷或任何其它能夠雜交的修飾的堿基)，或發(fā)生在糖的水平(例如至少一個脫氧核糖替換為聚酰胺(P.E.Nielsen等人，Science，254，1497-1500(1991)[3]))，或另外發(fā)生在磷酸基團水平(例如替換為酯，具體選自二磷酸酯、烷基磷酸酯和?；姿狨ヒ约傲虼姿狨?。
根據(jù)本發(fā)明具體的實施方案，所述特異性試劑包括至少一種雜交探針，或至少一種雜交探針和至少一種對靶基因特異的引物，或至少一種雜交探針和兩種對靶基因特異的引物。
為了本發(fā)明的目的，術語“擴增引物”指核苷酸片段，其包含5-100個核苷酸，優(yōu)選15-30個核苷酸，其使得酶促聚合例如酶促擴增反應起始。術語“酶促擴增反應”是指通過至少一種酶的作用產生多拷貝核苷酸片段的過程。這樣的擴增反應是本領域技術人員公知的，并特別提到下述技術：PCR(聚合酶鏈式反應)(如在美國專利號4,683,195、美國專利號4,683,202和美國專利號4,800,159中描述)，LCR(連接酶鏈式反應)(例如在專利申請EP 0201 184中公開)，RCR(修復鏈式反應)(在專利申請WO 90/01069中描述)，3SR(自主序列復制)(專利申請WO 90/06995)，NASBA(基于核酸序列的擴增)(專利申請WO 91/02818)，TMA(轉錄介導擴增)(美國專利號5,399,491)和RT-PCR。
當酶促擴增為PCR時，特異性試劑包括至少兩種靶基因特異的擴增引物，其允許擴增靶基因特異的材料。對靶基因特異的材料則優(yōu)選包含通過反轉錄來自靶基因的信使RNA獲得的互補DNA(稱作靶基因特異的cDNA)或通過轉錄靶基因特異的cDNA獲得的互補RNA(稱作靶基因特異的cRNA)。當酶促擴增為反轉錄反應后完成的PCR，稱作RT-PCR。
術語“雜交探針”是指核苷酸片段，其包含至少5個核苷酸，例如5-100個核苷酸，特別是10-75個核苷酸，例如15-35個核苷酸和60-70個核苷酸，其在給定條件下具有雜交特異性從而與對靶基因特異的材料形成雜交復合物。在本發(fā)明中，對靶基因特異的材料可為包含在源自靶基因的信使RNA中的核苷酸序列(稱作靶基因特異的mRNA)、包含在通過反轉錄所述信使RNA獲得的互補DNA中的核苷酸序列(稱作靶基因特異的cDNA)、或另外為包含在通過轉錄如上文描述的所述cDNA獲得的互補RNA中的核苷酸序列(稱作靶基因特異的cRNA)。雜交探針可包含用于其檢測的標簽。術語“檢 測”是指直接檢測例如計數(shù)方法，或間接檢測，其通過使用標簽的檢測方法。存在許多用于檢測核酸的檢測方法(見，例如，Kricka等人，Clinical Chemistry，1999，no 45(4)，453-458頁，或Keller G.H.等人，DNA Probes，2nd Ed.，Stockton Press，1993，第5和第6部分，173-249頁)。術語“標簽”是指能夠產生可被檢測到的信號的示蹤劑。這些示蹤劑的非限制性的列表包括酶(其通過例如比色、熒光或發(fā)光產生可檢測到的信號)，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；發(fā)色團，例如熒光劑、發(fā)光劑或染料化合物；電子致密基團，其可通過電子顯微鏡檢測或可通過它們的電子特性例如電導率由安培法或伏安法或通過阻抗測量檢測；可通過光學方法如衍射、表面等離子體共振或接觸角變化，或通過物理學方法例如原子力光譜，隧道效應等檢測的基團；放射性分子，例如32P、35S或125I。
為了本發(fā)明的目的，雜交探針可為“檢測”探針。在這種情況下，用標簽對“檢測”探針進行標記。檢測探針可具體為如Tyagi和Kramer(Nature biotech，1996，14：303-308)所描述的“分子信標”檢測探針。這些“分子信標”在雜交期間變成熒光劑。它們具有莖-環(huán)型結構并包含熒光團和“猝滅”基團。特異的環(huán)序列與其互補靶核酸序列的結合導致莖展開并在適當?shù)牟ㄩL激發(fā)過程中發(fā)出熒光信號。檢測探針可具體為根據(jù)NanoStringTM的技術的包含“彩色編碼的條形碼(barecode)”的“報告探針”。
為了檢測雜交反應，可使用直接地(具體是通過將標簽摻入靶序列)或間接地(具體是使用如上述定義的檢測探針)標記的靶序列。特別地，在雜交步驟之前可能進行標記和/或切割靶序列的步驟，例如在酶促擴增反應過程中使用標記的脫氧核糖核苷三磷酸。所述切割具體可通過咪唑或氯化錳的作用完成。還可根據(jù)例如在文獻WO 91/19812中描述的夾心雜交技術通過與檢測探針雜交而在擴增步驟之后標記靶序列。在申請FR 2780059中描述了另一具體的標記核酸的優(yōu)選方法。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，檢測探針包含熒光團和猝滅劑。根據(jù)本發(fā)明甚至更優(yōu)選的實施方案，雜交探針在其5'端包含F(xiàn)AM(6-羧基熒光素)或ROX(6-羧基-X-羅丹明)熒光團并在其3'端包含猝滅劑(Dabsyl)。
雜交探針還可為“捕獲”探針。在這種情況下，通過任何適當?shù)姆椒?，即直接地或間接地，例如通過共價或吸附，“捕獲”探針被固定或可能被 固定在固體基材上。作為固體基材，可使用合成材料或天然材料(任選地為化學修飾的)，具體為多糖例如基于纖維素的材料例如紙，纖維素衍生物例如醋酸纖維素和硝酸纖維素或葡聚糖，聚合物，共聚物(特別是基于苯乙烯型單體的)，天然纖維例如棉花，和合成纖維例如尼龍；無機材料例如二氧化硅、石英、玻璃或陶瓷；乳膠；磁性顆粒；金屬衍生物、凝膠等。固體基材可為微量滴定板、膜(如在申請WO-A-94/12670中描述的)或顆粒的形式。還可能將若干不同的捕獲探針固定在基材上，每種捕獲探針對一種靶基因特異。具體地，可使用生物芯片作為基材，其上可固定大量探針。術語“生物芯片”是指小體積的固體基材，大量的捕獲探針可在預定的位置連接于其上。生物芯片(或DNA芯片)的概念可追溯到1990年代初期。它基于多學科技術，整合了微電子、核酸化學、圖像分析和信息技術。工作原理基于分子生物學的基礎：雜交現(xiàn)象，即兩條DNA和/或RNA序列通過堿基互補的配對。生物芯片方法基于連接在固體基材上的捕獲探針的使用，直接或間接地標記熒光染料的靶核苷酸片段樣品作用于所述捕獲探針。捕獲探針特異地定位于基材或芯片上，并且每個雜交給出與靶核苷酸片段有關的一條具體信息。所獲得的信息是累積性的，使例如定量一或多個靶基因的表達水平成為可能。然后為了分析靶基因的表達，可制備包含大量探針的基材，所述探針對應于轉錄成mRNA的靶基因的全部或部分。為了本發(fā)明的目的，術語“低密度基材”是指包含少于50種探針的基材。為了本發(fā)明的目的，術語“中密度基材”是指包含從50種探針至10000種探針的基材。為了本發(fā)明的目的，術語“高密度基材”是指包含多于10000種探針的基材。
隨后將特異于需要分析的靶基因的cDNA或cRNA與例如特異的捕獲探針雜交。雜交之后，洗滌基材或芯片，并通過與例如熒光染料型標簽結合的高親和性配體顯示標記的cDNA或cRNA/捕獲抗體復合物。用例如掃描儀讀取熒光并通過信息技術進行熒光分析。意在說明，可提到由Affymetrix公司開發(fā)的，用于分子診斷的DNA芯片(“Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays”，M.Chee等人，Science，1996，274，610-614?！癓ight-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis”，A.Caviani Pease等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，5022-5026)。在此技術中，捕獲探針一般較小，約25個核苷 酸。在出版物G.Ramsay，Nature Biotechnology，1998，No.16，40-44頁；F.Ginot，Human Mutation，1997，No.10，1-10頁；J.Cheng等人，Molecular diagnosis，1996，No.1(3)，183-200頁；T.Livache等人，Nucleic Acids Research，1994，No.22(15)，2915-2921頁；J.Cheng等人，Nature Biotechnology，1998，No.16，541-546頁或在美國專利號4,981,783、美國專利號5,700,637、美國專利號5,445,934、美國專利號5,744,305和美國專利號5,807,522中給出了生物芯片其它的實例。固體基材的主要特征應為保持捕獲探針對靶核苷酸片段的雜交特征，而同時產生對檢測方法最小的背景噪音。探針在基材上的固定可區(qū)分為三種主要類型。
首先，存在第一種技術，其在于沉積預先合成的探針。探針的連接通過直接轉移完成，其通過微量移液器(micropipette)或微點(microdot)或通過噴墨裝置。此技術允許連接大小范圍從幾個堿基(5-10)至相對大的60堿基(打印法)至數(shù)百堿基(微沉積法)的探針。
打印法是對噴墨打印機使用的方法的改變。其基于以可達到4000滴/秒的速率推進非常小的液球(體積<1nl)。打印法不涉及釋放液體的系統(tǒng)與液體沉積于其上的表面之間的任何接觸。
微沉積法特征在于將數(shù)十至數(shù)百堿基的長探針連接到玻璃載片的表面。這些探針通常提取自數(shù)據(jù)庫并為經擴增及經純化的產物形式。此技術使生產稱為微陣列的芯片成為可能，所述芯片在略小于4平方厘米的表面積(稱為識別區(qū)域)上攜帶大約一萬個DNA點。然而，不應忘記尼龍膜(稱為“巨陣列(macroarray)”)的用途，其以最大25點/平方厘米的密度攜帶直徑0.5mm至1mm的擴增(一般通過PCR)后的產物。許多實驗室都使用這種非常靈活的技術。在本發(fā)明中，生物芯片考慮包括后一種技術。然而，如專利申請WO-A-00/71750和FR 00/14896的情況下，可將一定體積的樣品沉積在微量滴定板每個孔的底部，或根據(jù)另一個專利申請FR 00/14691，可將一定數(shù)量彼此分離的液滴沉積于同一個無菌培養(yǎng)皿底部。
第二種用于將探針連接于基材或芯片的技術稱作原位合成。此技術導致在芯片表面直接地產生短探針。其基于原位寡核苷酸合成(具體見，專利申請WO 89/10977和WO 90/03382)并且基于寡核苷酸合成儀方法。其在于沿玻璃表面移動反應室，在所述反應室中發(fā)生核苷酸延伸反應。
最后，第三種技術稱為光蝕刻技術，其為Affymetrix開發(fā)的用于生物芯片的方法。其也是原位合成。光蝕刻技術源于微處理器技術。通過連接光不穩(wěn)定(可被光活化)化學基團來修飾芯片表面。一旦被光照，這些基團能夠與寡核苷酸的3'端反應。通過用限定形狀的避光罩保護此表面，就可能選擇性地光照并因此活化期望連接四種核苷酸之一或其它核苷酸的區(qū)域。連續(xù)使用不同的避光罩使得可能交替進行保護/反應循環(huán)并因此在大約數(shù)十平方微米(μm2)的點上生產寡核苷酸探針。此分辨率使得可能在數(shù)平方厘米(cm2)的表面積上產生多至數(shù)十萬個點。光蝕刻技術具有優(yōu)點：批量平行，它使得可能僅經4乘N個循環(huán)產生N聚體芯片。所有這些技術可用于本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，如上述定義的步驟b)的至少一種特異性試劑包括至少一種雜交探針，其優(yōu)選固定于基材上。此基材優(yōu)選為如上述定義的低、高或中密度基材。
為了提高靶遺傳材料的量，可在包含大量探針的基材上的這些雜交步驟之前進行如上述定義的酶促擴增反應步驟。
可通過本領域技術人員已知的任何方案完成步驟c)中靶基因表達水平的確定?？偟膩碚f，可通過檢測在給定時刻從靶基因轉錄的mRNA(信使RNA)來分析靶基因的表達。
本發(fā)明優(yōu)選涉及通過根據(jù)本領域技術人員公知的任何方案檢測源自靶基因的mRNA來確定靶基因的表達水平。根據(jù)本發(fā)明具體的實施方案，通過檢測若干不同的mRNA(每種mRNA源自一個靶基因)，可同時確定若干靶基因的表達水平。
當特異性試劑包括至少一種擴增引物時，可能以下述方式確定靶基因的表達水平：1)從全血提取總RNA(包含轉運RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)和信使RNA(mRNA))之后，進行反轉錄步驟以獲得所述mRNA的互補DNA(或cDNA)。意在說明，可使用能夠從RNA片段獲得互補DNA片段的反轉錄酶進行此反轉錄反應。具體可使用來自AMV(禽成髓細胞瘤病毒)或MMLV(莫羅尼鼠白血病病毒)的反轉錄酶。當更具體僅需要獲得mRNA的cDNA時，在僅包含胸腺嘧啶堿基的核苷酸片段(多聚T)存在的情況下進行此反轉錄步驟，所述多聚T通過與mRNA的多聚A序列互補而雜交從而形成多聚T-多聚A復合物，其然后作為通過反轉錄酶進行的反轉錄反應的起始位點。然后獲得與源自靶基因的mRNA互補的cDNA(靶基因特 異的cDNA)和與源自靶基因之外的基因的mRNA互補的cDNA(非靶基因特異的cDNA)。2)使靶基因特異的擴增引物與靶基因特異的cDNA和非靶基因特異的cDNA接觸。靶基因特異的擴增引物與靶基因特異的cDNA雜交并且特異性地擴增cDNA(其源自來自靶基因的mRNA)已知長度的預先確定的區(qū)域。非靶基因特異的cDNA不被擴增，從而獲得大量靶基因特異的cDNA。為了本發(fā)明的目的，可無差別地引用“靶基因特異的cDNA”或“源自來自靶基因的mRNA的cDNA”?？删唧w通過PCR型的擴增反應或通過如上述定義的任何其它擴增技術的方法進行此步驟。對PCR，還可能通過使用若干對不同的擴增引物(每一對引物對一個靶基因特異)同時擴增若干不同的cDNA(每一種cDNA對不同的靶基因特異)：稱作多重擴增。3)通過檢測并定量在上述步驟2)中獲得的靶基因特異的cDNA來確定靶基因的表達?？稍诎谢蛱禺惖腸DNA根據(jù)其大小電泳遷移后進行此檢測。用于遷移的凝膠和介質可包含溴化乙錠，從而在給定的遷移時間段后，當將凝膠放置在UV(紫外線)臺上時，通過發(fā)出的光信號直接檢測靶基因特異的cDNA。靶基因特異的cDNA的量越大，光信號就越強。這些電泳技術對本領域的技術人員是公知的。還可使用通過進行至飽和的擴增反應獲得的定量范圍來檢測并定量靶基因特異的cDNA。為了考慮在不同的步驟(反轉錄、PCR等)中可能觀察到的酶效率的差異，可通過同時確定“看家”基因(其表達在不同組患者中相似)的表達歸一化不同組患者的靶基因的表達。通過獲得靶基因表達與看家基因表達的比例，即通過獲得靶基因特異的cDNA的量與看家基因特異的cDNA的量的比例，校正不同實驗之間的任何變化。本領域技術人員可具體參考下述出版物：Bustin S A，J Mol Endocrinol，2002，29：23-39；Giulietti A Methods，2001，25：386-401。
當特異性試劑包含至少一種雜交探針時，可能以下述方式確定靶基因的表達：1)從全血提取總RNA后，如上文描述地完成反轉錄步驟，從而獲得與源自靶基因的mRNA互補的cDNA(靶基因特異的cDNA)和與源自靶基因之外的基因的mRNA互補的cDNA(非靶基因特異的cDNA)。2)使所有的cDNA與基材接觸，所述基材上固定有對需要分析其表達的靶基因特異的捕獲探針，從而進行靶基因特異的cDNA和捕獲探針之間的雜交反應，而非靶基因特異的cDNA不與捕獲探針雜交。雜交反應可在包括所有如上述指出的材料的固體基材上完成。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，雜交探針 固定于基材上。優(yōu)選地，基材為如上述定義的低、高或中密度基材。由如上述定義的靶基因特異的cDNA的酶促擴增組成的步驟可在雜交反應之前進行，從而獲得大量靶基因特異的cDNA并提高靶基因特異的cDNA與對靶基因特異的捕獲探針雜交的可能性。也可能在雜交反應之前進行標記和/或切割如上文描述的靶基因特異的cDNA的步驟，例如使用標記的脫氧核糖核苷三磷酸用于擴增反應。所述切割具體可通過咪唑和氯化錳的作用完成。還可在擴增步驟之后標記靶基因特異的cDNA，例如根據(jù)在文獻WO-A-91/19812中描述的夾心雜交技術通過與標記的探針雜交。在申請WO 99/65926、WO 01/44507、WO 01/44506、WO 02/090584、WO 02/090319中描述了其它優(yōu)選的標記和/或切割核酸的具體方法。3)隨后進行由檢測雜交反應組成的步驟。所述檢測可通過使基材(對靶基因特異的捕獲探針在其上與靶基因特異的cDNA雜交)與標記的“檢測”探針接觸，檢測由標簽發(fā)出的信號來進行。當靶基因特異的cDNA事先已用標簽標記時，直接檢測標簽發(fā)出的信號。
當在步驟b)中的至少一種特異性試劑包含至少一種雜交探針，也可以下述方式確定靶基因的表達：1)從全血提取總RNA后，如上文描述地完成反轉錄步驟，從而獲得生物學材料的mRNA的cDNA。隨后使用T7聚合酶進行cDNA的互補RNA的聚合，所述T7聚合酶在啟動子控制下發(fā)揮功能并使得可能從DNA模板獲得互補RNA。隨后獲得靶基因特異的mRNA的cDNA的cRNA和非靶基因特異的mRNA的cDNA的cRNA。2)使所有的cRNA與基材接觸，所述基材上固定有對需要分析其表達的靶基因特異的捕獲探針，從而進行靶基因特異的cRNA和捕獲探針之間的雜交反應，而非靶基因特異的cRNA不與捕獲探針雜交。當需要同時分析若干靶基因的表達時，可在基材上固定若干不同的捕獲探針，每一種探針對一個靶基因特異。也可能在雜交反應之前進行標記和/或切割如上文描述的靶基因特異的cRNA的步驟。3)隨后進行由檢測雜交反應組成的步驟。檢測可通過使基材(對靶基因特異的捕獲探針在其上與靶基因特異的cRNA雜交)與標記有標簽的“檢測”探針接觸，并檢測由標簽發(fā)出的信號來完成。當靶基因特異的cRNA事先已用標簽標記時，直接檢測標簽發(fā)出的信號。當使用其上雜交有大量探針的生物芯片類基材時，使用cRNA是特別有利的。
本發(fā)明還包括試劑盒，其用于在來自患者的外周血樣品中預后結腸直 腸癌，所述試劑盒包括至少一種對至少一種NK細胞基因特異的試劑和不多于25種對25種NK細胞基因特異的試劑，所述NK細胞基因至少包括SEQ ID NO:1-13所示的核酸序列，其中所述至少一種試劑對至少一種選自以下的NK細胞基因特異：
(i)KLRB1基因，其包含例如SEQ ID NO:1所示的全長序列，
(ii)KLRC2基因，其包含例如SEQ ID NO:2、3或4所示的全長序列，
(iii)KLRC3基因，其包含例如SEQ ID NO:5、6或7所示的全長序列，
(iv)KLRD1基因，其包含例如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示的全長序列，和
(v)KLRK1基因，其包含例如SEQ ID NO:13所示的全長序列。
在一個實施方案中，試劑盒包括對以下NK細胞基因特異的試劑的組合：
(i)KLRB1基因，其包含例如SEQ ID NO:1所示的全長序列，
(ii)KLRC2基因，其包含例如SEQ ID NO:2、3或4所示的全長序列，
(iii)KLRC3基因，其包含例如SEQ ID NO:5、6或7所示的全長序列，
(iv)KLRD1基因，其包含例如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示的全長序列，和
(v)KLRK1基因，其包含例如SEQ ID NO:13所示的全長序列。
在這樣的實施方案中，特異性試劑可靶向若干NK細胞基因但不多于25個NK基因的組合。
另外，試劑盒可包括對至少一種靶細胞基因和不多于5種靶細胞基因特異的至少一種試劑，所述至少一種靶細胞基因選自：
(i)GZMB基因，其包含例如SEQ ID NO:14、15、16或17所示的全長序列，
(ii)CD247基因，其包含例如SEQ ID NO:18、19或20所示的全長序列，
(iii)RRAS2基因，其包含例如SEQ ID NO:21或22所示的全長序列，和
(iv)SH2D1B基因，其包含例如SEQ ID NO:23或24所示的全長序列，和
(v)LCK基因，其包含例如SEQ ID NO:25、26、27、28、29或30所示的全長序列。
具體地，其包括對以下靶細胞基因特異的5種試劑：
(i)GZMB基因，其包含例如SEQ ID NO:14、15、16或17所示的全長序列，
(ii)CD247基因，其包含例如SEQ ID NO:18、19或20所示的全長序列，
(iii)RRAS2基因，其包含例如SEQ ID NO:21或22所示的全長序列，和
(iv)SH2D1B基因，其包含例如SEQ ID NO:23或24所示的全長序列，和
(v)LCK基因，其包含例如SEQ ID NO:25、26、27、28、29或30所示的全長序列。
在這樣的實施方案中，特異性試劑可靶向例如上文描述的若干靶細胞基因但不多于5種靶細胞基因的組合。
在另一個實施方案中，例如上述定義的試劑盒可包括至少一種對至少一種靶細胞基因特異的試劑和至多100種對100種靶細胞基因特異的試劑，所述至少一種靶細胞基因選自：
(i)MRPS6基因，其包含例如SEQ ID NO:31、32或33所示的全長序列，
(ii)SPRY4基因，其包含例如SEQ ID NO:34所示的全長序列，
(iii)NEAT1基因，其包含例如SEQ ID NO:35所示的全長序列，
(iv)CYBB基因，其包含例如SEQ ID NO:36所示的全長序列，
(v)DUSP2基因，其包含例如SEQ ID NO:37所示的全長序列，
(vi)PDEAD基因，其包含例如SEQ ID NO:38或39所示的全長序列，
(vii)SH2D2A基因，其包含例如SEQ ID NO:40、41或42所示的全長序列，
(viii)INSR基因，其包含例如SEQ ID NO:43或44所示的全長序列，
(ix)ITGAM基因，其包含例如SEQ ID NO:45所示的全長序列，
(x)VCAN基因，其包含例如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的全長序列，
(xi)CD163基因，其包含例如SEQ ID NO:50或51所示的全長序列，
(xii)P2RY10基因，其包含例如SEQ ID NO:52或53所示的全長序列，
(xii)CD226基因，其包含例如SEQ ID NO:54所示的全長序列，
(xiii)MRPL10基因，其包含例如SEQ ID NO:55或56所示的全長序列，
(xiv)ITPRIPL2基因，其包含例如SEQ ID NO:57所示的全長序列，
(xv)CD2基因，其包含例如SEQ ID NO:58所示的全長序列，和
(xvi)NUDT16基因，其包含例如SEQ ID NO:59所示的全長序列。
并且具體地，其包括對以下17種靶細胞基因特異的17種試劑：
(i)MRPS6基因，其包含例如SEQ ID NO:31、32或33所示的全長序列，
(ii)SPRY4基因，其包含例如SEQ ID NO:34所示的全長序列，
(iii)NEAT1基因，其包含例如SEQ ID NO:35所示的全長序列，
(iv)CYBB基因，其包含例如SEQ ID NO:36所示的全長序列，
(v)DUSP2基因，其包含例如SEQ ID NO:37所示的全長序列，
(vi)PDEAD基因，其包含例如SEQ ID NO:38或39所示的全長序列，
(vii)SH2D2A基因，其包含例如SEQ ID NO:40、41或42所示的全長序列，
(viii)INSR基因，其包含例如SEQ ID NO:43或44所示的全長序列，
(ix)ITGAM基因，其包含例如SEQ ID NO:45所示的全長序列，
(x)VCAN基因，其包含例如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的全長序列，
(xi)CD163基因，其包含例如SEQ ID NO:50或51所示的全長序列，
(xii)P2RY10基因，其包含例如SEQ ID NO:52或53所示的全長序列，
(xii)CD226基因，其包含例如SEQ ID NO:54所示的全長序列，
(xiii)MRPL10基因，其包含例如SEQ ID NO:55或56所示的全長序列，
(xiv)ITPRIPL2基因，其包含例如SEQ ID NO:57所示的全長序列，
(xv)CD2基因，其包含例如SEQ ID NO:58所示的全長序列，和
(xvi)NUDT16基因，其包含例如SEQ ID NO:59所示的全長序列。
在這樣的實施方案中，特異性試劑可靶向例如上文描述的若干靶細胞基因但不多于100種靶細胞基因的組合。
如上文所解釋，所述至少一種特異性的試劑包括至少一種雜交探針，具體包括至少一種雜交探針和至少一種引物，而更具體包括至少一種雜交探針和兩種引物。
最后，本發(fā)明涉及至少一種對至少一種NK細胞基因特異的試劑和不多于25種對25種NK細胞基因特異的試劑在制備組合物中的用途，所述組合物用于在來自患者的生物學樣品中預后結腸直腸癌，所述NK細胞基因包含SEQ ID NO:1-12所示的核酸序列，其中所述至少一種試劑對包含選自SEQ ID NO:1-12任一所示的核酸序列的至少一種NK細胞基因是特異的；
特別是對至少5種NK細胞基因和不多于25種NK細胞基因的組合特異的試劑在制備組合物中的用途，所述組合物用于在來自患者的生物學樣品中預后結腸直腸癌，其中所述試劑對包含分別選自SEQ ID NO:1、2-4、5-7和8-12所示的核酸序列的至少5種NK細胞基因是特異的；
特別是對10種靶細胞基因的組合特異的試劑在制備組合物中的用途，所述組合物用于在來自患者的生物學樣品中預后結腸直腸癌，其中所述試劑對包含分別選自SEQ ID NO:1、2-4、5-7、8-12、13、14-17、18-20、21-22、23-24和25-30所述的核酸序列的靶細胞基因是特異的；和
更特別的是對10種靶細胞基因和不多于100種靶基因的組合特異的試劑在制備組合物中的用途，所述組合物用于在來自患者的生物學樣品中預后結腸直腸癌，其中所述試劑對包含分別選自SEQ ID NO:1、2-4、5-7、8-12、13、14-17、18-20、21-22、23-24、25-30、31-33、34、35、36、37、38-39、4-42、43-44、45、46-49、50-51、52-53、54、55-56、57、58和59所示的核酸序列的靶細胞基因是特異的；
其中，所述至少一種特異性的試劑包括至少一種雜交探針、至少一種雜交探針和至少一種引物或至少一種雜交探針和兩種引物。
附圖概述
圖1是在結腸鏡檢陰性對照(CNC)和結腸直腸癌(CRC)患者的血液樣品中的NK細胞得分，以及CRC樣品根據(jù)癌癥階段的分布圖。圓形代表CNC；方框，正三角，倒三角和菱形分別代表I期、II期、III期和IV期CRC。
實施例
I)材料與方法
1.患者和樣品收集
本研究已獲當?shù)嘏R床研究倫理委員會批準。已獲得所有參與者的書面知情同意書。
對CRC組，于2006年7月和2008年3月間在中國復旦大學腫瘤醫(yī)院(FUCH)結腸直腸外科為本研究連續(xù)招募了119個結腸直腸癌患者。根據(jù)國際抗癌聯(lián)合會(UICC)推薦的腫瘤-淋巴結-轉移系統(tǒng)對腫瘤分期。沒有患者接受術前放療或化療。本研究排除了患有遺傳性結腸直腸癌或炎癥性腸道疾病(克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎)的患者。對每個患者，在結腸鏡檢至少一周后，手術前，將2.5ml外周血收集入PAXgeneTM血液RNA管(PreAnalytiX GmbH，Hombrechtikon，CH)中，并根據(jù)制造商說明書處理。對對照組，從上海地區(qū)的社區(qū)醫(yī)院登記101個已通過結腸鏡檢證實不攜帶任何息肉或結腸直腸癌癥狀的FOBT測試陽性參與者。在結腸鏡檢檢查之前一周將外周血樣品收集入PAXgene管中。本研究包括的所有參與者的詳細特征在表1中給出。
表1：患者特征
2.RNA提取和微陣列實驗
遵循制造商說明書用PAXgeneTM血液RNA系統(tǒng)(PreAnalytix)提取總RNA。通過分光光度計在260納米的光密度測量總RNA的量，在BioAnalyzer Agilent 2100(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，U.S.A.)上使用RNA 6000Nano試劑盒評估質量。只分析擁有7至10的RNA完整性數(shù)值的樣品。然后將50納克總RNA反轉錄并根據(jù)制造商標準方案 使用Ribo-SPIATM技術(NuGEN Technologies Inc.，San Carlos，CA，U.S.A.)的WT-OvationTM RNA擴增系統(tǒng)線性擴增為單鏈cDNA，并用QIAquickTMPCR純化試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)純化產物。隨后用RQ1無RNA酶的DNA酶(Promega Corp.，F(xiàn)itchburg，WI，U.S.A.)片段化2毫克擴增和純化后的cDNA，并用生物素化的脫氧核苷三磷酸通過末端轉移酶(Roche Diagnostics Corp.，Indianapoli，IN，U.S.A.)和DNA標記試劑(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA，U.S.A)標記。在雜交爐640(Agilent Technologies)中50℃18分鐘，每分鐘60轉將標記的cDNA雜交至HG U133Plus 2.0Array(Affymetrix)上。HG U133Plus 2.0Array包含54,675個探針集，其代表了大約39,000個最好地表征的人基因。雜交后，根據(jù)Affymetrix方案EukGE-WS2v4使用Fluidics Station 450(Affymetrix)洗滌微陣列并染色。用Scanner 3000(Affymetrix)掃描微陣列。
3.微陣列數(shù)據(jù)分析
根據(jù)標準的Affymetrix質量控制參數(shù)建議完成質量控制分析?；谠u估標準，我們所有的實驗都達到了最低質量要求。通過RMA(魯棒多芯片平均)用背景校正、分位數(shù)歸一化和中位數(shù)平滑歸納預處理Affymetrix表達微陣列[1]。將具有極端信號強度(低于50或高于2×1014)的探針集濾掉。為了減少批次效應的可能性，對過濾后的表達數(shù)據(jù)應用歸一化算法CamBat11。CamBat方法(http://statistics.byu.edu/johnson/ComBat/)應用參數(shù)或非參數(shù)經驗貝氏框架在給定數(shù)據(jù)集中調節(jié)批次效應。通過微陣列顯著性分析(SAM)在錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)等于0.05下確定差異表達基因(DEG)12。使用具有Bioconductor庫的R環(huán)境執(zhí)行預處理和統(tǒng)計學步驟。使用Ingenuity Pathway Analysis軟件8.5版本(Ingenuity Systems，Redwood City，CA，U.S.A)進行基因本體(Gene Ontology)和經典途徑(Canonical Pathway)分析。
II)結果
1.結腸直腸癌和對照患者群的特征
119個結腸直腸癌(CRC)患者和101個結腸鏡檢陰性對照(CNC)的臨床和人口學變量概述于表1。對CRC，由病理學家在結腸鏡檢后確認結腸直 腸癌的診斷。從在社區(qū)醫(yī)院登記的FOBT陽性患者中選擇對照，他們在復旦大學腫瘤醫(yī)院(FUCH)進行的結腸鏡檢最終為陰性。在CRC和CNC組之間很好地平衡了年齡和性別。
2.外周血中的表達在結腸直腸癌患者和結腸鏡檢陰性對照中不同的基因的鑒定
發(fā)明人在119個CRC和101個CNC中尋找在兩組之間具最高差異的差異表達基因(DEG)，將CRC組(I、II、III和IV期)作為整體考慮。在適當?shù)念A處理后，保留了20169個探針集進行DEG分析。在FDR等于0.05，倍數(shù)變化(FC)大于1.2，使用SAM鑒定了327個DEG。
在這327個DEG中，分別發(fā)現(xiàn)195個(59.6％)和132個(40.36％)在CRC樣品中以更高和更低水平表達。T檢驗的P值范圍從1.43×10-25到1.51×10-01，18個DEG具有小于6.27×10-15的T檢驗P值并且都對應著很好注釋的基因：MRPS6、SPRY4、NEAT1、CYBB、DUSP2、PDE4D、SH2D2A、G(1-2)NSR、ITGAM、VCAN、CD163、P2RY10、CD226、MRPL10、ITPRIPL2、CD2和NUDT16(表2)。最高的倍數(shù)變化(FC)值為1.83(CRC中具更高水平的NEAT1)和1.71(CRC中具更低水平的HBG2)，而327個DEG中的26個(8％)具有高于1.40的FC值。
例如，對SPRY4(CRC中更高表達水平排名第一，T檢驗P值4.04×10-23，F(xiàn)C 1.79)和MRPS6(CRC中更低表達水平排名第一，T檢驗P值1.43×10-25，F(xiàn)C 1.27)觀察到的結果。這樣的實例代表了在CRC和CNC患者之間顯著差異表達的基因。對SPRY4，101個CNC觀察到了非常類似的雜交信號值，而CRC的值更多樣但與CNC相比具有顯著(p值4.04×10-23)提高的平均值(FC 1.78)。對MRPS6，兩個群體都顯示了相似的分散性，CRC具顯著(p值1.43×10-25)降低的平均值(FC 1.27)。
在前18個DEG中，觀察到4個膜白細胞標記物，顯示與CNC相比在CRC患者的外周血中不同的表達水平：更低水平的CD2和CD226，其分別由T細胞和主要由NK細胞表達；更高水平的CD163和CD11B(ITGAM)，其分別主要由單核細胞和許多涉及先天性免疫系統(tǒng)的白細胞表達。同樣有趣的是在細胞毒性T淋巴細胞和天然殺傷(NK)細胞中由GZMB基因編碼的顆粒酶B，在CRC樣品中的更低表達。其它的基因像INSR、SPRY4、DUSP2、PDE4D和ITPRIPL2被報告為不同的信號通路的一部分，SH2D2A被報告為T細胞特異的。已報告VCAN在單核細胞中表達，并且其在CRC樣品中更高的表達水平和CD163和ITGAM一起會與這些患者與CNC相比在外周血中的循環(huán)單核細胞的某種活化相關。
已通過使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)對327個DEG進行分析，其返回321個定位的ID，其適合于解釋相關的生物學功能(Bio Fuctions)和經典途徑。對于生理學系統(tǒng)發(fā)育和功能(Physiological System Developmentand Function)，觀察到免疫細胞運輸(Immune Cell Trafficking)具高分(p值從1.44×10-12至1.57×10-02，包括50種分子)，其涵蓋了多種免疫細胞的活化、遷移、積累、內流、趨化性、細胞擴散、細胞運動、化學誘導(chemoattraction)、預激(priming)和粘附。對于經典途徑有趣的是，天然殺傷細胞信號轉導(Natural Killer Cell Signaling)是具有最低P值(2.55×10-05)的一項，其包括10個基因：CD247、KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRD1、KLRK1、LCK、PRKCH、RRAS2和SH2D1D。5個NK細胞特異的膜受體(KLRB1、KLRC2、KLRC3、KLRD1、KLRK1)的涉及非常強烈地表明在CRC患者的外周血中在基因表達水平的特定的NK細胞組分差異。在CRC中所有的NK細胞基因表達降低。結果概述于下述的表2和3中。
表2：在結腸直腸癌(CRC)和結腸鏡檢陰性的對照(CNC)患者樣品之間差異表達的前18個基因(DEG)；基因描述，T檢驗P值和倍數(shù)變化相關的信息
*來自NetAffxTM和來自Ingenuity Pathway8.5版的基因描述
表3：NK細胞得分：選擇的基因，T檢驗P值和倍數(shù)變化相關信息
*來自NetAffxTM和來自Ingenuity Pathway8.5版的基因描述
對這10個NK細胞相關的基因，觀察到在CRC組中更低表達水平，提示循環(huán)NK細胞數(shù)目降低，或這樣的細胞向其它器官/組織區(qū)室尤其是腫瘤位置外流。觀察到更低水平的GZMB表達也是值得注意的，代表在CRC患者中發(fā)生在細胞毒性水平的主要事件。
排名最前的經典途徑涉及T細胞受體信號傳導(T Cell Receptor Signaling)、先天性和適應性免疫細胞之間的聯(lián)系(Communication between Innate and Adaptive Immune Cells)和T輔助細胞中的iCOS-iCOSL信號傳導(iCOS-iCOSL Signaling in T Helper Cells)，其分別具有9.08×10-05、2.85×10-04和5.78×10-04的P值。
有趣的是，對119個CRC患者的樣品中的51個，觀察到低于前四分之一的低NK細胞得分，而在101個CNC患者樣品中僅4個。使用這樣直接的截斷值，這種判別的性能可表達為43％的靈敏度和96％的特異性。另外，當根據(jù)腫瘤TNM期(I期、II期、III期或IV期)區(qū)分CRC患者時，我們觀察到該NK細胞得分在CRC患者中從I期到IV期逐漸降低(圖1)。主要在CNC和II期、III期與IV期CRC之間，和在I期CRC與II-III和IV期CRC之間觀察到統(tǒng)計學顯著的差異。
這項研究顯示了轉錄組發(fā)現(xiàn)外周血中生物學標記物的潛力，并對結腸直腸癌中的免疫應答提供了新的了解。除了對現(xiàn)有篩選模式準備可能的替代/互補之外，這些結果還顯示了對例如與NK細胞相關的基因的表達分析使得可以區(qū)分患有結腸直腸癌的患者，從而開啟了個性化醫(yī)療的大門。
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