本發(fā)明涉及乳液制備領(lǐng)域。具體涉及煙草花葉病毒的表面改性，溫敏聚合物的合成，蛋白-聚合物生物綴合的構(gòu)建，乳液的制備技術(shù)。更具體地，涉及一種煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物pickering乳液的制備方法。

背景技術(shù)：

pickering乳液是一種由固體粒子代替?zhèn)鹘y(tǒng)表面活性劑制得的穩(wěn)定分散體系。與傳統(tǒng)乳液相比,pickering乳液具有界面穩(wěn)定性強(qiáng)、環(huán)保、低毒、低成本等優(yōu)勢(shì),在化妝品、制藥、食品和原油開采等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，pickering乳液還為人工合成囊泡提供了一種有力的工具，而這種囊泡可以作為基因以及藥物輸送的優(yōu)良載體，由此也成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。

到目前為止，越來越多的材料被用來制備pickering乳液，這其中包括硅、碳納米管、黏土、聚苯乙烯、氧化鐵、蛋白質(zhì)以及病毒粒子等。但是，隨著材料多功能化的發(fā)展趨勢(shì)，單一組分的材料制備的乳液很難再能滿足要求，于是人們把目光轉(zhuǎn)向了多組分的雜合材料，比如高分子-無機(jī)雜合材料，高分子-高分子雜合材料，無機(jī)-無機(jī)雜合材料，蛋白質(zhì)-聚合物雜合材料，蛋白質(zhì)-無機(jī)雜合材料，病毒粒子-高分子雜合材料等。

與傳統(tǒng)的無機(jī)或高分子材料相比，蛋白質(zhì)與病毒粒子的優(yōu)勢(shì)在于具有明確的結(jié)構(gòu)和生物功能以及其分子量的絕對(duì)單分散性。然而由蛋白生物毒性引起的基體免疫反應(yīng)以及蛋白化學(xué)生物降解的特性限制了其作為生物材料的進(jìn)一步應(yīng)用。合成高分子的引入不但可以有效降低蛋白與病毒粒子的生物毒性，避免引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，還可以提高蛋白與病毒粒子的物理化學(xué)穩(wěn)定性。因此，基于蛋白質(zhì)/病毒粒子-高分子的雜合嵌段共聚物可以很好的結(jié)合天然大分子和合成高分子的優(yōu)勢(shì)。

聚(n-異丙基丙烯酰胺)是目前研究得最多的一類具有溫度敏感性的聚合物,其在水溶液中的最低臨界溶解溫度(lcst)約為32℃,當(dāng)溫度高于lcst 時(shí)，聚(n-異丙基丙烯酰胺)會(huì)從親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷?，如果它與親水的蛋白或病毒粒子綴合,可提高其相轉(zhuǎn)變溫度，而且可以賦予這種蛋白質(zhì)/病毒粒子-高分子的雜合嵌段共聚物溫敏的特性。已經(jīng)有很多研究開始利用蛋白質(zhì)-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物制備溫度響應(yīng)型的乳液(例如alexanderadv.funct.mater.2011,21,2470–2476；xinhuang,naturecommunications,2013,doi:10.1038/ncomms3239)。

相比于蛋白質(zhì)-高分子的雜合嵌段共聚物研究的火熱，很少有對(duì)病毒粒子-高分子的雜合嵌段共聚物的研究報(bào)道。煙草花葉病毒是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的一種植物病毒。目前，人們對(duì)煙草花葉病毒蛋白組裝體的形貌、晶體結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)等都已經(jīng)有了較為充分的了解。它具有獨(dú)特的內(nèi)部中空的棒狀結(jié)構(gòu)，其外直徑為18nm，內(nèi)部空腔直徑4nm。由衣殼蛋白組裝得到的煙草花葉病毒由于在納米尺度上的單分散特性，與化學(xué)合成的納米顆粒相比，不僅擁有優(yōu)異的生物降解性，還具有空間結(jié)構(gòu)高度有序、單分散性好、易被化學(xué)和基因修飾等特點(diǎn)，在生物成像，藥物載體等方面得到廣泛的應(yīng)用。

目前已經(jīng)有研究表明煙草花葉病毒在較高蛋白濃度且在一定濃度的緩沖溶液的輔助下可以形成pickering乳液(alexanderlangmuir2009,25(9),4979–4987)，然而其穩(wěn)定乳液的能力有限，需要改進(jìn)制備方法提高其穩(wěn)定乳液的能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種一種煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物pickering乳液的制備方法該制備方法操作步驟簡單，制備周期短，采用特殊工藝制備的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物作為固體顆粒穩(wěn)定劑，能夠達(dá)到提高病毒粒子乳液乳化能力，增強(qiáng)乳化穩(wěn)定性的目的。

本發(fā)明提供的一種基于煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的乳液為水包油型乳液。該乳液中乳滴的結(jié)構(gòu)是以包含熒光分子的油相為內(nèi)核，煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物在水油兩相之間組裝成膜。

本發(fā)明所制備的基于煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的乳液中聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為3000-16000。

為達(dá)到上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物pickering乳液的制備方法，包括如下制備步驟：

1)聚(n-異丙基丙烯酰胺)的合成

將n-異丙基丙烯酰胺、鏈轉(zhuǎn)移劑、引發(fā)劑以及無水二氧六環(huán)加入反應(yīng)器得到反應(yīng)體系a，在惰性氣體保護(hù)下攪拌30-60分鐘，密封后在油浴條件下反應(yīng)1-3小時(shí)，反應(yīng)后產(chǎn)物冷卻，用四氫呋喃溶解后在乙醚中沉淀數(shù)次，獲得白色產(chǎn)物；

2)煙草花葉病毒外表面的炔基化修飾

將對(duì)甲苯磺酸鈉溶液加入反應(yīng)器中，在冰浴的條件下先后加入3-乙炔基苯胺與亞硝酸鈉得到反應(yīng)體系b，冰浴攪拌40-90分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到煙草花葉病毒溶液中得到反應(yīng)體系c，繼續(xù)冰浴攪拌30-60分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行透析；

3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

向含有外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒的磷酸鹽緩沖溶液中加入步驟2)合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，再先后加入氨基胍碳酸氫鹽、抗壞血酸鈉和硫酸銅得到反應(yīng)體系d，冰浴攪拌30-50分鐘之后，加入乙二胺四乙酸二鈉得到反應(yīng)體系e，繼續(xù)攪拌4-12小時(shí)之后，用磷酸鹽緩沖溶液透析，得到煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物；

4)水包油pickering乳液的制備

向容器中加入一定比例的油相和煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液，混合，即可形成水包油型的pickering乳液。

優(yōu)選地，步驟1)中，所述n-異丙基丙烯酰胺在使用之前需用正己烷重結(jié)晶數(shù)次以除去阻礙聚合的穩(wěn)定劑，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，所述鏈轉(zhuǎn)移劑為端基為疊氮基團(tuán)的三硫碳酸酯鏈轉(zhuǎn)移劑，以使聚合獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)帶有疊氮官能團(tuán)從而可以進(jìn)行下一步反應(yīng)。

優(yōu)選地，步驟1)中，n-異丙基丙烯酰胺、鏈轉(zhuǎn)移劑、引發(fā)劑的物質(zhì)的量投料比是40-200:1:0.2，n-異丙基丙烯酰胺在反應(yīng)體系a中的濃度為1-5mol/l更優(yōu)選的，為5mol/l，在此濃度下n-異丙基丙烯酰胺的聚合速度較快，而且分子量分布較窄。

優(yōu)選地，步驟1)中，裝有反應(yīng)體系a的反應(yīng)器通入惰性氣體后抽排三次，抽排三次的目的是為了排除反應(yīng)體系中的氧氣，消除氧氣對(duì)聚合的不良影響。

優(yōu)選地，步驟2)中，對(duì)甲苯磺酸鈉在反應(yīng)體系b中的濃度為0.08-0.35mol/l，更優(yōu)選地，為0.24mol/l，此濃度下反應(yīng)效率較高，且無沉淀產(chǎn)生。

優(yōu)選地，步驟2)中，3-乙炔基苯胺在反應(yīng)體系b中的濃度為0.03-0.2mol/l，更優(yōu)選地，為0.1mol/l，此濃度下反應(yīng)效率較高，且無沉淀產(chǎn)生。

優(yōu)選地，步驟2)中，亞硝酸鈉在反應(yīng)體系b中的濃度為0.05-0.25mol/l，更優(yōu)選地，為0.15mol/l，此濃度下反應(yīng)效率較高，且無沉淀產(chǎn)生。

優(yōu)選地，步驟2)中，所述煙草花葉病毒在反應(yīng)體系c中的濃度為1-3mg/ml，更優(yōu)選地，為2mg/ml，濃度過高易造成煙草花葉病毒蛋白變性；所述磷酸鹽緩沖溶液的ph＝7.4±0.2,濃度為0.01-0.1mol/l。

優(yōu)選地，步驟3)中，所述含有外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒的磷酸鹽緩沖溶液的ph＝7.4±0.2，濃度為0.01-0.1mol/l，所述煙草花葉病毒的衣殼蛋白與聚(n-異丙基丙烯酰胺)的物質(zhì)量之比為1:20-60。

優(yōu)選地，步驟3)中，所述氨基胍碳酸氫鹽和抗壞血酸鈉在反應(yīng)體系d中的濃度都是0.001-0.003mol/l，更優(yōu)選地，為0.002mol/l，硫酸銅在反應(yīng)體系d中的濃度是0.001-0.002mol/l，更優(yōu)選地，為0.001mol/l，銅離子對(duì)蛋白的活性影響較大，如果硫酸銅在反應(yīng)體系d中的濃度過高容易造成煙草花葉病毒蛋白變性，此濃度下，蛋白不會(huì)變性而且保持較高反應(yīng)效率。

優(yōu)選地，步驟3)中，所述乙二胺四乙酸二鈉在反應(yīng)體系e中的濃度為0.25-0.8mol/l，更優(yōu)選地，為0.5mol/l，在此濃度下能夠有效的消除銅離子對(duì)煙草花葉病毒蛋白的毒性作用；所述磷酸鹽緩沖溶液的ph＝7.4±0.2,濃度為0.01-0.1mol/l。

優(yōu)選地，步驟4)中，所述油相為三氟甲苯或全氟萘烷等有機(jī)溶劑，所述油相與煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液的體積比為1:9-15，水相的含量如果過少，會(huì)導(dǎo)致水包油乳液不穩(wěn)定。

優(yōu)選地，步驟4)中，所述油相中含有0.001-0.05mmol/l的熒光分子，更優(yōu)選地，為0.01mmol/l的熒光分子，此濃度下在共聚焦熒光顯微鏡下效果最佳；所述熒光分子為香豆素、氨基熒光素或者尼羅紅；所述煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液的濃度為0.1-10mg/ml，濃度如果太低，會(huì)導(dǎo)致水包油乳液不穩(wěn)定。

現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于利用煙草花葉病毒制備pickering乳液，存在乳液穩(wěn)定性差、缺少外界刺激響應(yīng)性的缺點(diǎn)和不足。本發(fā)明針對(duì)上述缺點(diǎn)和不足，有針對(duì)性地進(jìn)行了如下的改進(jìn)：

將煙草花葉病毒與相對(duì)疏水的聚合物生物綴合改變了其親水性，提高了其降低水油兩相表面張力的能力。

與煙草花葉病毒生物綴合的聚合物為溫敏性聚合物聚(n-異丙基丙烯酰胺)，使得獲得的生物雜合嵌段共聚物同樣具有溫敏特性。

從而達(dá)到了提高煙草花葉病毒pickering乳液的穩(wěn)定性以及外界刺激響應(yīng)性的有益效果。

本發(fā)明的制備方法，首先是用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成溫敏聚合物聚(n-異丙基丙烯酰胺),再將其與外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒生物綴合,成功構(gòu)建了煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物，它可以在水油兩相界面形成水包油型的pickering乳液，而且具有溫敏特性，溫度改變，乳液的粒徑也會(huì)隨之變化。

另外注意的是，如果沒有特別說明，本發(fā)明所記載的任何范圍包括端值以及端值之間的任何數(shù)值以及以端值或者端值之間的任意數(shù)值所構(gòu)成的任意子范圍。

本發(fā)明的有益效果如下：

將煙草花葉病毒跟聚(n-異丙基丙烯酰胺)生物綴合，使得其降低水油兩相界面張力的能力提高。

將煙草花葉病毒跟聚(n-異丙基丙烯酰胺)生物綴合，與純煙草花葉病毒相比，煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物形成的乳液更加穩(wěn)定，而且可以在低濃度在無磷酸鹽緩沖溶液的輔助下形成穩(wěn)定乳液。

將煙草花葉病毒跟聚(n-異丙基丙烯酰胺)生物綴合，賦予了雜合嵌段共聚物溫度響應(yīng)性的特性，溫度升高，雜合嵌段共聚物降低水油兩相界面張力的能力提高，而且形成的乳液的粒徑會(huì)減小。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1示出本發(fā)明實(shí)施例所制備的一種基于煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的乳液制備方法的流程示意圖。

圖2示出本發(fā)明實(shí)施例1所制備的一種基于煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的乳液中的雜合嵌段共聚物的透射電鏡圖。

圖3示出本發(fā)明實(shí)施例1所制備的一種基于煙草花葉病毒-聚(n-異丙基 丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的乳液在顯微鏡下觀察的圖片。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

本發(fā)明的一種煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物pickering乳液的制備方法，其流程示意圖如附圖1所示。圖中1代表煙草花葉病毒，2代表3-乙炔基苯胺重氮鹽，3代表外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒，4代表端基為疊氮基團(tuán)的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，5代表煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物，6代表煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物pickering乳液。具體的制備過程及工藝參數(shù)的控制如下：

(1)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成聚(n-異丙基丙烯酰胺)

在瓶中加入1.36gn-異丙基丙烯酰胺、92.1mg鏈轉(zhuǎn)移劑、9.9mg偶氮二異丁腈，加入2.4ml無水二氧六環(huán)溶解，通氬氣攪拌30分鐘，抽排三次，將瓶子密封好放在油浴中加熱一個(gè)小時(shí)，待結(jié)束后用冰水冷卻，用四氫呋喃溶解聚合物，在乙醚中沉淀三次，最終獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為3000；

(2)煙草花葉病毒外表面炔基化修飾

在反應(yīng)瓶中加入800μl0.3mol/l對(duì)甲苯磺酸鈉水溶液，冰浴，先后加入150μl0.68mol/l3-乙炔基苯胺乙腈溶液與50μl3mol/l亞硝酸鈉水溶液，冰浴攪拌一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到4.8ml的含有15mg煙草花葉病毒的0.1mol/lph＝9的硼酸緩沖液溶液中，冰浴攪拌40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

取500μl0.01mol/lph＝7.4的2mg/ml的外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒磷酸鹽緩沖溶液，加入10mg合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，先后再加入5μl0.2mol/l的氨基胍碳酸氫鹽水溶液，5μl0.2mol/l的抗壞血酸鈉水溶液和5μl0.1mol/l的硫酸銅水溶液，冰浴攪拌30分鐘之后，加入10 μl0.1mol/l乙二胺四乙酸二鈉水溶液，攪拌12個(gè)小時(shí)后，用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

圖2示出本發(fā)明實(shí)施例1所制備的一種基于煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的乳液中的雜合嵌段共聚物的透射電鏡圖。如附圖2所示，煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合物呈棒狀；

(4)水包油乳液制備

在5ml小瓶中加入體積比為1:9的含0.01mol/l香豆素的三氟甲苯跟0.1mg/ml的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液，迅速搖勻，水包油乳液形成；

滴一滴制備的乳液在玻璃片上，在室溫下放在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顯綠色熒光的油相被一層膜包裹，呈球狀，如附圖3所示。

實(shí)施例2

(1)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成聚(n-異丙基丙烯酰胺)

在瓶中加入1gn-異丙基丙烯酰胺、30.7mg鏈轉(zhuǎn)移劑、3.3mg偶氮二異丁腈，加入9ml無水二氧六環(huán)溶解，通氬氣攪拌60分鐘，抽排三次，將瓶子密封好放在油浴中加熱三個(gè)小時(shí)，待結(jié)束后用冰水冷卻，用四氫呋喃溶解聚合物，在乙醚中沉淀三次，最終獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為6500；

(2)煙草花葉病毒外表面炔基化修飾

在反應(yīng)瓶中加入800μl0.1mol/l對(duì)甲苯磺酸鈉水溶液，冰浴，先后加入150μl0.23mol/l3-乙炔基苯胺乙腈溶液與50μl1mol/l亞硝酸鈉水溶液，冰浴攪拌40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到4.8ml的含有7.5mg煙草花葉病毒的0.1mol/lph＝9的硼酸緩沖液溶液中，冰浴攪拌30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用0.1mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

取500μl0.1mol/lph＝7.4的2mg/ml的外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒磷酸鹽緩沖溶液，加入8.7mg合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，先后再加入5μl0.1mol/l的氨基胍碳酸氫鹽水溶液，5μl0.1mol/l的抗壞血酸鈉水溶液和5μl0.1mol/l的硫酸銅水溶液，冰浴攪拌30分鐘之后，加入10μl0.05mol/l乙二胺四乙酸二鈉水溶液，攪拌4個(gè)小時(shí)后，用0.1mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(4)水包油乳液制備

在5ml小瓶中加入體積比為1:9的含0.001mol/l香豆素的三氟甲苯跟0.1mg/ml的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液，迅速搖勻，水包油乳液形成；

滴一滴制備的乳液在玻璃片上，在室溫下放在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顯綠色熒光的油相被一層膜包裹，呈球狀。

實(shí)施例3

(1)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成聚(n-異丙基丙烯酰胺)

在瓶中加入2.26gn-異丙基丙烯酰胺、30.7mg鏈轉(zhuǎn)移劑、3.3mg偶氮二異丁腈，加入6.1ml無水二氧六環(huán)溶解，通氬氣攪拌40分鐘，抽排三次，將瓶子密封好放在油浴中加熱一個(gè)半小時(shí)，待結(jié)束后用冰水冷卻，用四氫呋喃溶解聚合物，在乙醚中沉淀三次，最終獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為16000；

(2)煙草花葉病毒外表面炔基化修飾

在反應(yīng)瓶中加入800μl0.44mol/l對(duì)甲苯磺酸鈉水溶液，冰浴，先后加入150μl1.61mol/l3-乙炔基苯胺乙腈溶液與50μl5mol/l亞硝酸鈉水溶液，冰浴攪拌90分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到4.8ml的含有22.5mg煙草花葉病毒的0.05mol/lph＝9的硼酸緩沖液溶液中，冰浴攪拌60分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用0.05mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

取500μl0.05mol/lph＝7.4的2mg/ml的外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒磷酸鹽緩沖溶液，加入64mg合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，先后再加入5μl0.3mol/l的氨基胍碳酸氫鹽水溶液，5μl0.3mol/l的抗壞血酸鈉水溶液和5μl0.2mol/l的硫酸銅水溶液，冰浴攪拌50分鐘之后，加入10μl0.16mol/l乙二胺四乙酸二鈉水溶液，攪拌12個(gè)小時(shí)后，用0.05mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(4)水包油乳液制備

在5ml小瓶中加入體積比為1:15的含0.05mol/l香豆素的三氟甲苯跟10mg/ml的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液，迅速搖勻，水包油乳液形成；

滴一滴制備的乳液在玻璃片上，在室溫下放在共聚焦熒光顯微鏡下觀察， 發(fā)現(xiàn)顯綠色熒光的油相被一層膜包裹，呈球狀。

實(shí)施例4

(1)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成聚(n-異丙基丙烯酰胺)

在瓶中加入1.58gn-異丙基丙烯酰胺、30.7mg鏈轉(zhuǎn)移劑、3.3mg偶氮二異丁腈，加入2.85ml無水二氧六環(huán)溶解，通氬氣攪拌50分鐘，抽排四次，將瓶子密封好放在油浴中加熱一個(gè)小時(shí)，待結(jié)束后用冰水冷卻，用四氫呋喃溶解聚合物，在乙醚中沉淀四次，最終獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為10000；

(2)煙草花葉病毒外表面炔基化修飾

在反應(yīng)瓶中加入800μl0.3mol/l對(duì)甲苯磺酸鈉水溶液，冰浴，先后加入150μl0.68mol/l3-乙炔基苯胺乙腈溶液與50μl3mol/l亞硝酸鈉水溶液，冰浴攪拌一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到4.8ml的含有15mg煙草花葉病毒的0.1mol/lph＝9的硼酸緩沖液溶液中，冰浴攪拌50分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

取500μl0.01mol/lph＝7.4的2mg/ml的外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒磷酸鹽緩沖溶液，加入20mg合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，先后再加入5μl0.2mol/l的氨基胍碳酸氫鹽水溶液，5μl0.2mol/l的抗壞血酸鈉水溶液和5μl0.15mol/l的硫酸銅水溶液，冰浴攪拌40分鐘之后，加入10μl0.1mol/l乙二胺四乙酸二鈉水溶液，攪拌7個(gè)小時(shí)后，用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(4)水包油乳液制備

在5ml小瓶中加入體積比為1:11的含0.01mol/l氨基熒光素的三氟甲苯跟1mg/ml的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液，迅速搖勻，水包油乳液形成；

滴一滴制備的乳液在玻璃片上，在室溫下放在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顯綠色熒光的油相被一層膜包裹，呈球狀。

實(shí)施例5

(1)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成聚(n-異丙基丙烯酰胺)

在瓶中加入1.36gn-異丙基丙烯酰胺、92.1mg鏈轉(zhuǎn)移劑、9.9mg偶氮二 異丁腈，加入2.4ml無水二氧六環(huán)溶解，通氬氣攪拌30分鐘，抽排三次，將瓶子密封好放在油浴中加熱一個(gè)小時(shí)，待結(jié)束后用冰水冷卻，用四氫呋喃溶解聚合物，在乙醚中沉淀三次，最終獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為3000；

(2)煙草花葉病毒外表面炔基化修飾

在反應(yīng)瓶中加入800μl0.3mol/l對(duì)甲苯磺酸鈉水溶液，冰浴，先后加入150μl0.68mol/l3-乙炔基苯胺乙腈溶液與50μl3mol/l亞硝酸鈉水溶液，冰浴攪拌一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到4.8ml的含有15mg煙草花葉病毒的0.1mol/lph＝9的硼酸緩沖液溶液中，冰浴攪拌40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

取500μl0.01mol/lph＝7.4的2mg/ml的外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒磷酸鹽緩沖溶液，加入10mg合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，先后再加入5μl0.2mol/l的氨基胍碳酸氫鹽水溶液，5μl0.2mol/l的抗壞血酸鈉水溶液和5μl0.1mol/l的硫酸銅水溶液，冰浴攪拌30分鐘之后，加入10μl0.1mol/l乙二胺四乙酸二鈉水溶液，攪拌10個(gè)小時(shí)后，用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(4)水包油乳液制備

在5ml小瓶中加入體積比為1:9的含0.01mol/l尼羅紅的三氟甲苯跟1mg/ml的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液，迅速搖勻，水包油乳液形成；

滴一滴制備的乳液在玻璃片上，在室溫下放在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顯紅色熒光的油相被一層膜包裹，呈球狀。

實(shí)施例6

(1)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成聚(n-異丙基丙烯酰胺)

在瓶中加入1.36gn-異丙基丙烯酰胺、92.1mg鏈轉(zhuǎn)移劑、9.9mg偶氮二異丁腈，加入2.4ml無水二氧六環(huán)溶解，通氬氣攪拌30分鐘，抽排三次，將瓶子密封好放在油浴中加熱一個(gè)小時(shí)，待結(jié)束后用冰水冷卻，用四氫呋喃溶解聚合物，在乙醚中沉淀三次，最終獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為3000；

(2)煙草花葉病毒外表面炔基化修飾

在反應(yīng)瓶中加入800μl0.3mol/l對(duì)甲苯磺酸鈉水溶液，冰浴，先后加入150μl0.68mol/l3-乙炔基苯胺乙腈溶液與50μl3mol/l亞硝酸鈉水溶液，冰浴攪拌一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到4.8ml的含有15mg煙草花葉病毒的0.1mol/lph＝9的硼酸緩沖液溶液中，冰浴攪拌40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

取500μl0.01mol/lph＝7.4的2mg/ml的外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒磷酸鹽緩沖溶液，加入10mg合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，先后再加入5μl0.2mol/l的氨基胍碳酸氫鹽水溶液，5μl0.2mol/l的抗壞血酸鈉水溶液和5μl0.1mol/l的硫酸銅水溶液，冰浴攪拌30分鐘之后，加入10μl0.1mol/l乙二胺四乙酸二鈉水溶液，攪拌10個(gè)小時(shí)后，用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(4)水包油乳液制備

在5ml小瓶中加入體積比為1:9的含0.01mol/l尼羅紅的全氟萘烷跟0.1mg/ml的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液，迅速搖勻，水包油乳液形成；

滴一滴制備的乳液在玻璃片上，在室溫下放在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顯紅色熒光的油相被一層膜包裹，呈球狀。

實(shí)施例7

(1)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成聚(n-異丙基丙烯酰胺)

在瓶中加入1.36gn-異丙基丙烯酰胺、92.1mg鏈轉(zhuǎn)移劑、9.9mg偶氮二異丁腈，加入2.4ml無水二氧六環(huán)溶解，通氬氣攪拌30分鐘，抽排三次，將瓶子密封好放在油浴中加熱一個(gè)小時(shí)，待結(jié)束后用冰水冷卻，用四氫呋喃溶解聚合物，在乙醚中沉淀三次，最終獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為3000；

(2)煙草花葉病毒外表面炔基化修飾

在反應(yīng)瓶中加入800μl0.15mol/l對(duì)甲苯磺酸鈉水溶液，冰浴，先后加入150μl0.56mol/l3-乙炔基苯胺乙腈溶液與50μl1.5mol/l亞硝酸鈉水溶液，冰浴攪拌一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到4.8ml的含有15mg煙草花葉病毒的0.1mol/lph＝9的硼酸緩沖液溶液中，冰浴攪拌40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

取500μl0.01mol/lph＝7.4的2mg/ml的外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒磷酸鹽緩沖溶液，加入10mg合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，先后再加入5μl0.2mol/l的氨基胍碳酸氫鹽水溶液，5μl0.2mol/l的抗壞血酸鈉水溶液和5μl0.1mol/l的硫酸銅水溶液，冰浴攪拌30分鐘之后，加入10μl0.1mol/l乙二胺四乙酸二鈉水溶液，攪拌10個(gè)小時(shí)后，用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(4)水包油乳液制備

在5ml小瓶中加入體積比為1:12的含0.01mol/l氨基熒光素的全氟萘烷跟0.1mg/ml的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液，迅速搖勻，水包油乳液形成；

滴一滴制備的乳液在玻璃片上，在室溫下放在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顯綠色熒光的油相被一層膜包裹，呈球狀。

實(shí)施例8

(1)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成聚(n-異丙基丙烯酰胺)

在瓶中加入1.58gn-異丙基丙烯酰胺、30.7mg鏈轉(zhuǎn)移劑、3.3mg偶氮二異丁腈，加入2.85ml無水二氧六環(huán)溶解，通氬氣攪拌50分鐘，抽排四次，將瓶子密封好放在油浴中加熱一個(gè)小時(shí)，待結(jié)束后用冰水冷卻，用四氫呋喃溶解聚合物，在乙醚中沉淀四次，最終獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為10000；

(2)煙草花葉病毒外表面炔基化修飾

在反應(yīng)瓶中加入800μl0.1mol/l對(duì)甲苯磺酸鈉水溶液，冰浴，先后加入150μl0.23mol/l3-乙炔基苯胺乙腈溶液與50μl1mol/l亞硝酸鈉水溶液，冰浴攪拌40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到4.8ml的含有7.5mg煙草花葉病毒的0.1mol/lph＝9的硼酸緩沖液溶液中，冰浴攪拌30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用0.1mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

取500μl0.01mol/lph＝7.4的2mg/ml的外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒磷酸鹽緩沖溶液，加入20mg合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，先后再加入5μl0.2mol/l的氨基胍碳酸氫鹽水溶液，5μl0.2mol/l的抗壞血酸鈉水溶液和5μl0.15mol/l的硫酸銅水溶液，冰浴攪拌40分鐘之后，加入10 μl0.1mol/l乙二胺四乙酸二鈉水溶液，攪拌12個(gè)小時(shí)后，用0.01mol/lph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(4)水包油乳液制備

在5ml小瓶中加入體積比為1:15的含0.01mol/l氨基熒光素的全氟萘烷跟1mg/ml的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶液，迅速搖勻，水包油乳液形成；

滴一滴制備的乳液在玻璃片上，在室溫下放在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)顯綠色熒光的油相被一層膜包裹，呈球狀。

實(shí)施例9

(1)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合的方法合成聚(n-異丙基丙烯酰胺)

在瓶中加入1.58gn-異丙基丙烯酰胺、30.7mg鏈轉(zhuǎn)移劑、3.3mg偶氮二異丁腈，加入2.85ml無水二氧六環(huán)溶解，通氬氣攪拌30分鐘，抽排三次，將瓶子密封好放在油浴中加熱一個(gè)小時(shí)，待結(jié)束后用冰水冷卻，用四氫呋喃溶解聚合物，在乙醚中沉淀三次，最終獲得的聚(n-異丙基丙烯酰胺)的分子量為10000；

(2)煙草花葉病毒外表面炔基化修飾

在反應(yīng)瓶中加入800μl0.3m對(duì)甲苯磺酸鈉水溶液，冰浴，先后加入150μl0.68m3-乙炔基苯胺乙腈溶液與50μl3m亞硝酸鈉水溶液，冰浴攪拌一個(gè)小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液加入到4.8ml的含有15mg煙草花葉病毒的0.1mph＝9的硼酸緩沖液溶液中，冰浴攪拌40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后用0.01mph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(3)煙草花葉病毒和聚(n-異丙基丙烯酰胺)的生物綴合

取500μl0.01mph＝7.4的2mg/ml的外表面炔基化修飾的煙草花葉病毒磷酸鹽緩沖溶液，加入35mg合成的聚(n-異丙基丙烯酰胺)，冰浴，先后再加入5μl0.2m的氨基胍碳酸氫鹽水溶液，5μl0.2m的抗壞血酸鈉水溶液和5μl0.1m的硫酸銅水溶液，冰浴攪拌30分鐘之后，加入10μl0.1m乙二胺四乙酸二鈉水溶液，攪拌10個(gè)小時(shí)后，用0.01mph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析；

(4)水包油乳液制備

在5ml小瓶中加入體積比為1:9的含0.01mol/l氨基熒光素的三氟甲苯跟1mg/ml的煙草花葉病毒-聚(n-異丙基丙烯酰胺)雜合嵌段共聚物的水溶 液，迅速搖勻，水包油乳液形成；

滴一滴制備的乳液在玻璃皿上，在25℃放在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，選擇特定的幾個(gè)小球，拍照，然后升溫到37℃，保溫10分鐘之后，再次對(duì)之前選定的小球拍照，對(duì)比兩溫度下的乳液小球的粒徑變化，發(fā)現(xiàn)升溫到37℃之后的粒徑要25℃時(shí)要小10μm左右。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。