本發(fā)明涉及涉及腫瘤分子檢測領(lǐng)域。更具體地涉及pde3a在判斷阿那格雷治療腫瘤的效果中的應用。
背景技術(shù)：
：腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多基因，多環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，腫瘤患者遺傳背景的多樣性決定了腫瘤治療的復雜性，也同時表明該疾病需進行個體化治療。應用靶向技術(shù)向腫瘤病灶區(qū)精確遞送藥物的“靶向治療”和利用腫瘤特異的基因突變和基因功能的“靶點治療”是目前腫瘤藥物研究的熱點。分子靶點治療是針對不同腫瘤細胞中特異的促進腫瘤生長和存活的關(guān)鍵分子，實現(xiàn)抑制腫瘤細胞生長或促進凋亡的抗腫瘤作用。代表性的靶點藥物如靶向受體酪氨酸激酶的抑制劑吉非替尼(gefitinib)，拉帕替尼(lapatinib)，克唑替尼(crizotinib)等和抗體藥物阿瓦斯汀(avastin)，西妥昔單抗(cetuximab)等。此外，還有靶向其它激酶的抑制劑、泛素－蛋白酶體抑制劑、以及組蛋白去乙?；?hdac)抑制劑等。與傳統(tǒng)細胞毒化療藥物不同，腫瘤分子靶點藥物具有特異性或選擇性抗腫瘤作用和減低藥物毒性作用，大大提高了腫瘤治療的精準性，延長了患者生存期和生活質(zhì)量。但目前的抗腫瘤藥物靶點和靶點藥物還遠遠不夠。阿那格雷作為磷酸二酯酶抑制劑，用于治療抗血小板增多癥。有研究表明阿那格雷或其藥學上可接受的制劑在抑制腫瘤方面具有新用途，但是阿那格雷并非對所有類型的腫瘤都有比較好的效果，目前仍缺乏明確的診斷方法以指導阿那格雷的用藥。本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)能夠判斷阿那格雷治療腫瘤效果的生物標記物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供判斷阿那格雷治療腫瘤的效果的標記物pde3a，以及pde3a在判斷阿那格雷治療腫瘤的效果中的應用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種pde3a基因序列、pde3a核酸檢測試劑、pde3a蛋白、和/或pde3a蛋白檢測試劑的用途，用于制備診斷試劑或診斷試劑盒，所述診斷試劑或試劑盒用于：(a)判斷阿那格雷(anagrelide)治療腫瘤的效果，和/或(b)判斷腫瘤患者是否適合用阿那格雷進行治療，和/或(c)判斷腫瘤細胞對阿那格雷的敏感性。在另一優(yōu)選例中，所述的診斷試劑包括蛋白芯片、核酸芯片、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的診斷試劑用于pcr、免疫印跡和免疫組化。在另一優(yōu)選例中，所述的判斷包括輔助判斷和/或預先(治療前)判斷。在另一優(yōu)選例中，所述的敏感性是指所述腫瘤細胞在以下濃度的阿那格雷存在下的敏感性：0.001-0.25μm，較佳地為0.01-0.1μm，更佳地為0.02-0.08μm。在另一優(yōu)選例中，所述的敏感性是指所述腫瘤細胞在以下濃度的阿那格雷存在下的敏感性：0.25-10μm，較佳地為0.5-5μm，更佳地為0.8-3μm。在另一優(yōu)選例中，所述的敏感性包括腫瘤細胞在體外培養(yǎng)條件下的敏感性，和/或腫瘤細胞在體內(nèi)的敏感性。在另一優(yōu)選例中，所述的阿那格雷治療腫瘤的用量為每天1mg-500mg，較佳地為10mg-250mg，更佳地為30-100mg。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a基因序列包括pde3a的編碼序列和/或非編碼序列。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a基因序列包括基因組dna、cdna和/或mrna序列。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a核酸檢測試劑偶聯(lián)有或帶有可檢測的標記物。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a蛋白檢測試劑包括抗pde3a蛋白的特異性抗體、蛋白芯片。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a蛋白檢測試劑偶聯(lián)有或帶有可檢測的標記物。在另一優(yōu)選例中，所述可檢測的標記物選自下組：生色團、化學發(fā)光基團、熒光團、同位素或酶。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a蛋白包括全長pde3a蛋白、或其分泌性蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a基因序列和/或pde3a蛋白被作為所述試劑盒中的標準品或?qū)φ铡Ｔ诹硪粌?yōu)選例中，所述的pde3a核酸檢測試劑包括引物、探針、或核酸芯片。在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤患者包括非血液腫瘤患者或?qū)嶓w瘤患者。在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤選自下組：肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、腸癌、鼻咽癌、乳腺癌、淋巴癌、腎癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宮癌、骨癌、膽囊癌、唇癌、黑色素瘤、舌癌、喉癌、白血病、前列腺癌、腦癌、鱗癌、皮膚癌、血管瘤、脂肪瘤、甲狀腺癌肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述診斷試劑是單克隆和多克隆抗體或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的診斷試劑或診斷試劑盒用于檢測選自下組的樣本：手術(shù)切除組織樣本、活檢穿刺組織樣本、腫瘤組織裂解液、血液樣本、細胞樣本、體液樣本、尿液樣本、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述診斷試劑盒用于檢測組織樣本制成的切片。在另一優(yōu)選例中，所述切片包括石蠟切片、或冷凍切片。在另一優(yōu)選例中，所述的血液樣本的檢測是檢測外周血中循環(huán)腫瘤細胞中pde3a的表達量。在另一優(yōu)選例中，所述診斷試劑盒包括免疫印跡分析試劑盒和/或pcr檢測試劑盒。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測阿那格雷治療腫瘤的效果的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有：(a)第一容器，所述第一容器中含有用于檢測pde3a表達和/或pde3a蛋白的檢測試劑；(b)標簽或說明書；和(c)任選的標準品或?qū)φ掌?，其中，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于(a)判斷阿那格雷治療腫瘤的效果，和/或(b)判斷腫瘤患者是否適合用阿那格雷進行治療。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測試劑包括：引物、探針、抗體、核酸芯片、 蛋白芯片或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的第一容器包括一個或多個第一容器。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a蛋白或其特異性抗體偶聯(lián)有或帶有可檢測的標記物。在另一優(yōu)選例中，所述標準品或?qū)φ掌钒╬de3a核酸序列、pde3a蛋白、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述診斷試劑盒還含有第二容器，所述第二容器中含有對腫瘤組織進行處理的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述診斷試劑盒還含有用于進行免疫印跡檢測的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的標簽或說明書中注明以下內(nèi)容：(i)腫瘤組織中pde3a表達為陽性，預測提示阿那格雷治療腫瘤的效果好，和/或所述腫瘤患者適合用阿那格雷進行治療；和(ii)腫瘤組織中pde3a表達為陰性，預測提示阿那格雷治療腫瘤的效果差，和/或所述腫瘤患者不適合用阿那格雷進行治療。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a表達為陽性是指腫瘤細胞表達pde3a和/或具有pde3a蛋白活性。在另一優(yōu)選例中，所述的pde3a表達為陰性是指腫瘤細胞低表達或不表達pde3a和/或不具有pde3a蛋白活性在另一優(yōu)選例中，提供了一種用于檢測pde3a基因序列或蛋白的檢測試劑的用途，用于制備一試劑盒，所述試劑盒用于(a)判斷阿那格雷治療腫瘤的效果，和/或(b)判斷腫瘤患者是否適合用阿那格雷進行治療的標志物。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種體外判斷腫瘤細胞對阿那格雷敏感性的方法，包括步驟：(i)提供一待測腫瘤細胞；(ii)在體外檢測待測腫瘤細胞中pde3a的表達和/或活性，其中，如果所述待測腫瘤細胞表達pde3a和/或具有pde3a蛋白活性，則表示所述待測腫瘤細胞對阿那格雷敏感；如果所述待測腫瘤細胞低表達或不表達pde3a和/或不具有pde3a蛋白活性，則表示所述待測腫瘤細胞對阿那格雷不敏感。在另一優(yōu)選例中，所述的低表達或不表達pde3a指所述腫瘤細胞中pde3a的mrna水平m1與β－肌動蛋白的mrna水平m2之比r1≤0.2，較佳地≤0.1。在另一優(yōu)選例中，所述的低表達或不表達pde3a指所述腫瘤細胞中pde3a蛋白水平p1與bel7404中pde3a蛋白水平p2之比r2≤0.5，較佳地≤0.2。在另一優(yōu)選例中，“不具有pde3a蛋白活性”指所述腫瘤細胞中pde3a的活性a1與bel7404中pde3a蛋白活性a2之比r3≤0.5，較佳地≤0.2。在另一優(yōu)選例中，所述的表達pde3a指所述腫瘤細胞中pde3a的mrna水平m1與β－肌動蛋白的mrna水平m2之比r1≥0.3，較佳地≥0.5。在另一優(yōu)選例中，所述的表達pde3a指所述腫瘤細胞中pde3a蛋白水平p1與bel7404中pde3a蛋白水平p2之比r2≥0.6，較佳地≥0.8。在另一優(yōu)選例中，“具有pde3a蛋白活性”指所述腫瘤細胞中pde3a的活性a1與bel7404中pde3a蛋白活性a2之比r3≥0.6，較佳地≥0.8。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：檢測待測腫瘤細胞的pde3a是否有突變。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：(iii)在阿那格雷存在下，在體外培養(yǎng)上一步驟中確定為對阿那格雷敏感的待測腫瘤細胞，并觀察所述腫瘤細胞的生長情況，從而驗證所述腫瘤細胞對阿那格雷的敏感性。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii)中，所述的阿那格雷的濃度為0.001-0.25μm，較佳地為0.01-0.1μm，更佳地為0.02-0.08μm。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii)中，所述的阿那格雷的濃度為0.25-10μm，較佳地為0.5-5μm，更佳地為0.8-3μm。在另一優(yōu)選例中，在步驟(iii)中，觀察所述腫瘤細胞的生長情況，包括觀察腫瘤細胞的凋亡情況和/或遷移情況。在另一優(yōu)選例中，所述方法是非診斷性和非治療性的。應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了pde3a蛋白在不同來源細胞株中的表達情況。其中，以α-tubulin、gapdh為內(nèi)參蛋白。s:阿那格雷敏感細胞；m：阿那格雷中度敏感細胞；未標明的均為阿那格雷不敏感細胞r。圖2顯示阿那格雷選擇性抑制不同組織來源腫瘤細胞生長。其中，用阿那格雷(1μm)處理72小時，mtt法檢測細胞存活率的結(jié)果，以檢測結(jié)果對細胞進行了分類：敏感(存活率<40％)，中度敏感(存活率40-75％)，抵抗(存活率>75％)，圖中細胞名稱前用圓形、三角分別標明了敏感組和中度敏感組。圖3顯示了pde3amrna在不同細胞中的表達。其中，利用rt-pcr對九株細胞的pde3amrna水平進行檢測；縱坐標:相對β-actin的定量結(jié)果。圖4顯示了pde3a蛋白在腫瘤細胞生長中起到的作用。圖4a顯示了pde3asirna1/2轉(zhuǎn)染48小時后，免疫印跡法檢測pde3a蛋白在hela細胞中的表達情況。圖4b顯示了rtca法監(jiān)測hela細胞在轉(zhuǎn)染pde3asirna前后的生長狀況。其中，nc:陰性對照；kd1和kd2:pde3a敲減組。圖5顯示了pde3a蛋白的表達與阿那格雷對細胞毒性的關(guān)系。圖5a顯示了sirna轉(zhuǎn)染hela48小時，rtca法記錄不同阿那格雷處理前后的細胞生長曲線。其中，nc：對照組，kd：pde3a敲減組。圖5b顯示了阿那格雷或者dmso處理轉(zhuǎn)染前后的hela細胞36小時，pi染色20分鐘，熒光顯微鏡拍照結(jié)果。圖5c顯示了利用cellprofiler軟件對pi陽性細胞進行計數(shù)的結(jié)果。圖5d顯示了阿那格雷處理細胞48小時，mtt法檢測細胞生存率的結(jié)果。圖6顯示了對阿那格雷不敏感細胞株的其他pde的mrna表達情況，以中度敏感細胞bel7404的pde3a表達為基準，得到相對表達量。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，首次發(fā)現(xiàn)一種能夠指導阿那格雷(anagrelide)治療腫瘤效果的生物標記物(pde3a)。實驗表明，如果腫瘤組織及外周血循環(huán)腫瘤細胞陽性表達pde3a，則提示阿那格雷治療腫瘤的效果好，和/或腫瘤患者適合用阿那格雷進行治療。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明根據(jù)pde3a在腫瘤細胞中的表達建立了一種安全有效的診斷和分型方法、能簡單、快速、經(jīng)濟的指導阿那格雷在臨床上對腫瘤患者進行個體化治療。目前市場上有pde3a的elisa檢測試劑盒，但還沒有運用pde3a作為腫瘤標記物對腫瘤進行診斷和治療的方法。本發(fā)明的免疫印跡法和pcr法等方法檢測pde3a在腫瘤樣本中的表達并運用于指導阿那格雷在治療腫瘤中的應用在技術(shù)上和應用上皆屬于首創(chuàng)。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞株中約30％為pde3a蛋白或mrna的表達陽性，pde3a陽性的腫瘤細胞中約對阿那格雷(anagrelide)表現(xiàn)出不同程度的敏感性，而阿那格雷對pde3a陰性的腫瘤細胞無任何抑制作用。動物實驗表明阿那格雷(anagrelide)在抑制腫瘤細胞生長的劑量(10mg-200mg/kg,較佳地10-20mg/kg)時具有安全性，因此pde3a作為該藥的生物標記物指導阿那格雷進行腫瘤治療具有理論依據(jù)和應用價值。pde3a蛋白和基因序列如本文所用，術(shù)語“pde3a”即磷酸二酯酶3a，是絲蘇氨酸激酶家族的一員，通過水解生物體內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷(camp)和環(huán)磷酸鳥苷(cgmp)，終止這些第二信使所傳遞的生物信號，調(diào)控生命活動。pde3a主要分布在心臟、血小板、血管平滑肌和卵細胞；對camp水解效率是cgmp的10倍。在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明蛋白”、“pde3a蛋白”、“pde3a多肽”可互換使用，都指具有人pde3a蛋白的氨基酸序列(uniprotkb/swiss-prot:q14432)的蛋白或多肽。包括含有或不含起始甲硫氨酸的pde3a蛋白。此外，該術(shù)語還包括全長的pde3a及其片段，尤其是分泌性片段(或分泌性蛋白)。本發(fā)明所指的pde3a蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突變體以及其功能上活性的片段。此外，本發(fā)明的pde3a蛋白包括糖基化和非糖基化的蛋白。在本發(fā)明中，術(shù)語“pde3a基因(id：5139)”、“pde3a多核苷酸”可互換使用，都指具有人pde3a核苷酸序列(nc_000012.12)的核酸序列。需理解的是，當編碼相同的氨基酸時，密碼子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而產(chǎn)生保守的氨基酸取代時，核苷酸的變換也是可被接受的。在得到了pde3a的氨基酸片段的情況下，可根據(jù)其構(gòu)建出編碼它的核酸序列，并且根據(jù)核苷酸序列來設(shè)計特異性探針。核苷酸全長序列或其片段通常可 以用pcr擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于pcr擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的pde3a核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cdna庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次pcr擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，衍生物)的dna序列。然后可將該dna序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的dna分子(如載體)和細胞中。通過常規(guī)的重組dna技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的pde3a多肽。特異性抗體在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明抗體”和“抗pde3a的特異性抗體”可互換使用。本發(fā)明還包括對人pde3a多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人pde3a基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人pde3a基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人pde3a蛋白的分子，也包括那些并不影響人pde3a蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人pde3a基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如fab’或(fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈fv分子(ladner等人，美國專利no.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人pde3a基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人pde3a蛋白或其具有抗原性的片段的細 胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人pde3a蛋白功能的抗體以及不影響人pde3a蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人pde3a基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人pde3a基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如e.coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得?？谷藀de3a蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測標本(尤其是腫瘤組織)中的人pde3a蛋白。阿那格雷及其用途如本文所用，術(shù)語“阿那格雷”、“anagrelide”、“安歸寧”、“ana”可互換使用，均指具有如下式所示結(jié)構(gòu)的化合物，或其藥學上可接受的鹽或前藥或衍生物，或其制劑形式：阿那格雷是一種磷酸二酯酶抑制劑，用于治療抗血小板增多癥。有研究表明阿那格雷或其藥學上可接受的制劑在抑制腫瘤方面具有新用途。實驗表明，阿那格雷體外抑制血小板的ic50為0.27-1μm，而阿那格雷在體外對敏感性腫瘤細胞的ic50均小于0.03μm。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，所述的阿那格雷為6,7-二氯-1,5-二氫咪唑并[2,1-b]喹唑啉-2(3h)酮。目前，在臨床上阿那格雷作為磷酸二酯酶抑制劑，用于治療抗血小板增多癥。有研究表明阿那格雷或其藥學上可接受的制劑在抑制腫瘤方面具有新用途，具體地包括(a)作為抗腫瘤藥物，用于腫瘤或癌癥的治療或抑制；(b)在體外或體內(nèi)選擇性地用于抑制腫瘤細胞增殖，或者誘導細胞凋亡；(c)在體外或體內(nèi)選擇性地調(diào)控腫瘤細胞的周期，誘導細胞產(chǎn)生g1周期阻滯 和g2周期阻滯。(d)在體外或體內(nèi)選擇性地用于抑制腫瘤細胞遷移。所述的阿那格雷或其藥物組合物可以在較低濃度下作用，較佳地，所述阿那格雷可以在≤1μm的濃度下作用于對象細胞，并產(chǎn)生所需的作用。優(yōu)選地，阿那格雷的衍生物具有如下式i所示結(jié)構(gòu)：其中，r1～r8各自獨立地選自下組：氫原子、鹵素原子、氨基、羥基、氰基、醛基、硝基、羧基(-cooh)、取代或未取代的c1～c10烷基、取代或未取代的c3～c10環(huán)烷基、取代或未取代的c2～c10烯基、取代或未取代的c2～c10炔基、取代或未取代的c6～c10芳基、取代或未取代的c1～c10雜芳基(如取代或未取代的5元或6元雜環(huán)、8元至10元雜芳二環(huán)環(huán)系)、取代或未取代的c1～c10烷氧基、取代或未取代的c6～c10芳基-氧基、取代或未取代的c1～c10雜芳基-氧基、取代或未取代的?；?優(yōu)選為-co-c1～c10烷基)、取代或未取代的酯基(優(yōu)選為c1～c10烷基-coo-)、取代或未取代的c1～c10磺?；?-so2-c1～c10烷基)；或r1和r2、r3和r4共同構(gòu)成選自下組的基團：取代或未取代的c3～c20環(huán)烷基(優(yōu)選為c3～c10環(huán)烷基)、取代或未取代的c1～c20雜環(huán)烷基(優(yōu)選為取代或未取代的5元或6元雜環(huán)、8元至12元雜芳二環(huán)環(huán)系)、羰基(＝o)；r9選自下組：氫原子、氧原子、取代或未取代的c1～c10烷基、取代或未取代的c3～c10環(huán)烷基、取代或未取代的c6～c10芳基、取代或未取代的c1～c10雜芳基、取代或未取代的c1～c10烷氧基、取代或未取代的c6～c10芳基-氧基、取代或未取代的?；?優(yōu)選為-co-c1～c10烷基)、取代或未取代的c1～c10磺?；?；其中，取代指基團上的一個或多個氫原子被選自下組的取代基取代：c1～c10烷基、c3～c10環(huán)烷基、c1～c10烷氧基、鹵素、羥基、羧基(-cooh)、 c1～c10醛基、c2～c10?；?、c2～c10酯基、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3個取代基的取代苯基，所述取代基選自：鹵素、c1-c10烷基、氰基、oh、硝基、c3～c10環(huán)烷基、c1～c10烷氧基、氨基。在另一優(yōu)選例中，所述r1～r8各自獨立地選自下組：氫原子、鹵素原子、氨基、羥基、氰基、硝基、氨基、醛基、羧基、取代或未取代的c1～c5烷基、取代或未取代的c3～c6環(huán)烷基、取代或未取代的c2～c5烯基、取代或未取代的c2～c5炔基、取代或未取代的c6～c10芳基、取代或未取代的c1～c6雜芳基、取代或未取代的c1～c5烷氧基、取代或未取代的c6～c10芳基-氧基、取代或未取代的c1～c6雜芳基-氧基、取代或未取代的-co-c1～c5烷基、取代或未取代的c1～c5烷基-coo-、取代或未取代的c1～c5磺?；换騬1和r2、r3和r4共同構(gòu)成選自下組的基團：取代或未取代的c3～c10環(huán)烷基、取代或未取代的c1～c10雜環(huán)烷基、羰基；r9選自下組：氫原子、氧原子、取代或未取代的c1～c5烷基、取代或未取代的c3～c6環(huán)烷基、取代或未取代的c6～c10芳基、取代或未取代的c1～c10雜芳基、取代或未取代的c1～c5烷氧基、取代或未取代的c6～c10芳基-氧基、取代或未取代的-co-c1～c5烷基、取代或未取代的c1～c5磺?；?；其中，取代的定義如上所述。在另一優(yōu)選例中，r1～r8各自獨立地選自下組：氫原子、鹵素原子、氰基、取代或未取代的c1～c5烷基、取代或未取代的c3～c6環(huán)烷基；或r1和r2、r3和r4共同構(gòu)成選自下組的基團：取代或未取代的c1～c5環(huán)烷基、取代或未取代的c1～c5雜環(huán)烷基、羰基；r9選自下組：氫原子、取代或未取代的c1～c5烷基、取代或未取代的c3～c6環(huán)烷基；其中，取代的定義如上所述。在另一優(yōu)選例中，所述的r1～r9中的1～8個為氫原子，較佳地2～7個為氫原子。在另一優(yōu)選例中，所述的r1～r8中的1～8個為鹵素原子。在另一優(yōu)選例中，所述的r1～r8中的1～8個為鹵素原子，且其他的r1～r8 均為氫原子。在另一優(yōu)選例中，所述的式i化合物具有如式ii所示的結(jié)構(gòu)：在另一優(yōu)選例中，所述的藥學上可接受的鹽為選自下組的鹽：鹽酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽，或其組合。檢測方案方案(1)通過活檢或手術(shù)取少量腫瘤患者的腫瘤組織，即可進行免疫印跡法(westernblot)檢測。如果該患者的pde3a的蛋白表達為陽性(pde3a+)，即可考慮選用阿那格雷(anagrelide)進行治療，有效率接近70％；若是pde3a陰性(pde3a-)，就不選用該藥，排除準確率100％。方案(2)通過活檢或手術(shù)取少量腫瘤患者的腫瘤組織，提取mrna，進行rt-pcr反應，即可檢測pde3a的mrna的表達。pde3a的mrna表達為陽性(pde3a+)，即可考慮選用阿那格雷(anagrelide)進行治療，有效率接近70％；若是pde3a的mrna為陰性(pde3a-)，就不選用該藥，排除準確率100％。對肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌患者，可以優(yōu)先考慮使用該方法對這pde3a蛋白進行檢測。檢測試劑盒本發(fā)明還提供了一種阿那格雷治療腫瘤效果的檢測試劑盒，所述的試劑盒含有一容器a，所述容器a中含有pde3a基因序列、蛋白或其特異性抗體；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于(a)判斷阿那格雷治療腫瘤的效果，和/或(b)判斷腫瘤患者是否適合用阿那格雷進行治療。較佳地，含有抗pde3a的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：(a)提供了預測阿那格雷治療腫瘤效果的標志物，有助于患者治療方案的選擇。(b)提前分析患者對阿那格雷的敏感性，避免無效治療。(c)檢測方便、快捷、經(jīng)濟，可以降低患者醫(yī)治成本。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。通用材料1.藥品和試劑實施例中涉及的藥品和試劑如下表所示：2.細胞與細胞培養(yǎng)基實施例中涉及的細胞與細胞培養(yǎng)基如下表所示：以上細胞株皆置于37℃含5％co2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期時進行實驗。通用方法1.組織蛋白樣品的準備手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液＝1：10的比例，加入相應體積的裂解液進行勻漿，離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當?shù)纳蠘觔uffer中，混勻后靜置3小時使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集)加入laemmli樣品緩沖液(視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合)強力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準備就緒(樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持數(shù)月。)2.組織rna的提取組織(<100mg)加trizol1ml至1.5ml無rnaase的ep管中，置于冰上5分鐘，加200μl氯仿，劇烈振搖15s后置于冰上3分鐘；低溫高速離心機12000g，4℃離心15分鐘，將上層移至新的ep管中；向ep管中加500μl異丙醇，混勻后置于冰上10分鐘；低溫高速離心機12000g，4℃，離心10分鐘，見白色固體沉于ep管底部，棄上清。向ep管中加入1ml75％乙醇(depc水配置)，振蕩混勻；低 溫高速離心機7500g，4℃離心5分鐘，棄上清，盡量吸干乙醇；將ep管中的rna置于空氣中，干燥至透明，用depc水30-50μl溶解rna，-80℃保存。3.藥物對細胞的半數(shù)中毒劑量的測定(mtt法)用細胞維持液將藥液連續(xù)做幾何級稀釋為1∶10，1∶100，1∶1,000，1∶10,000，設(shè)正常細胞對照組，將不同濃度的各藥分別加入已長成單層96孔板中，每個稀釋度接種3個復孔，每孔加入100μl，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，加入5mg/mlmtt25μl，繼續(xù)培養(yǎng)3.5h，取出棄上清，每孔加溶解液dmso150μl，振蕩5～10min，待結(jié)晶完全溶解，酶標儀測570nm的od值。計算各藥物稀釋度的細胞存活率：細胞存活率％＝(實驗孔od測定值均值/對照孔od測定值均值)x100％，采用概率單位回歸法，計算50％細胞中毒時的藥物濃度(ic50)。4.免疫印跡法(westernblot)分析8％-10％sds-聚丙烯酰胺(sda-page)分離膠，5％濃縮膠。濃縮膠電壓為80v，分離膠電壓為120v，溴酚藍指示劑跑至底部停止；采用半干法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電壓為10-15v，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白分子的大小進行調(diào)整；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用麗春紅預染硝酸纖維膜，剪膜；用含有5％脫脂牛奶的tbst置于脫色搖床封閉1小時后，tbst沖洗一遍，加入一抗結(jié)合，一抗1:2000-1:5000稀釋于含有5％bsa的tbst中，室溫置于脫色搖床結(jié)合1小時后，4℃過夜。次日在室溫下平衡1小時后，tbst洗三次，每次10分鐘。加入二抗結(jié)合，二抗1:3000-1:5000稀釋于含有5％bsa的tbst中，室溫置于脫色搖床結(jié)合1小時，tbst洗三次，每次10分鐘。與ecl試劑盒底物作用2-3分鐘后，曝光于化學發(fā)光儀。5.rt-pcr反應1)trizol提取細胞總rna單層細胞加trizol1ml/10cm直徑小皿；trizol均勻覆蓋于小皿，置于冰上5分鐘，收集細胞并轉(zhuǎn)移至1.5mlrnaasefreeep管中；向ep管中加200μl氯仿，劇烈振搖15s后置于冰上3分鐘；低溫高速離心機12000g，4℃離心15分鐘，將上層移至新的ep管中；向ep管中加500μl異丙醇，混勻后置于冰上10分鐘；低溫高速離心機12000g，4℃，離心10分鐘，見白色固體沉于ep管底部，棄上 清。向ep管中加入1ml75％乙醇(depc水配置)，振蕩混勻；低溫高速離心機7500g，4℃離心5分鐘，棄上清，盡量吸干乙醇；將ep管中的rna置于空氣中，干燥至透明，用depc水30-50μl溶解rna，-80℃保存。2)反轉(zhuǎn)錄反應(20μl反應體系，冰上操作)，反應體系如下：3)實時定量pcr(real-timepcr)steponeplustmreal-timepcrsystem反應體系如下：real-timepcr引物序列如下：根據(jù)steponeplustmreal-timepcrsystem(appliedbiosystem)系統(tǒng)自帶分析軟件，以β-actin為參比，根據(jù)2△△ct法求得pde3a相對表達量。6.rnai干擾lipofectaminetm2000的用量及實驗操作參照其說明書。對數(shù)期生長的hela細胞約6000/孔接種于96孔板或者rtca板，過夜貼壁長滿約70-80％，細胞狀態(tài)良好；取一定量的無血清無抗生素的培養(yǎng)基分別加入兩個ep管中，向一管加入適量sirna混勻，另一管加入適量lipofectaminetm2000混勻，室溫放置5-10min；將加有l(wèi)ipofectaminetm試劑的培養(yǎng)基加入含sirna的ep管中混勻，室溫放置15min；放置期間，用無血清無雙抗的培養(yǎng)基洗細胞一次，再加入75μl該培養(yǎng)基備用。15分鐘到，將混勻后的培養(yǎng)基加入細胞培養(yǎng)皿，25μl/孔，輕輕振蕩混勻；37℃，5％co2培養(yǎng)6小時后，換成含10％fbs的新鮮培養(yǎng)基；24-72h后免疫印跡法(westernblot)檢測rnai干擾蛋白表達情況。7.細胞實時監(jiān)控儀(rtca)監(jiān)測細胞生長將處于對數(shù)生長期的細胞以每孔3-7×104/ml接種于細胞實時監(jiān)控儀配套的16或者96孔板中，37℃孵育過夜后，加藥或者轉(zhuǎn)染處理。實時監(jiān)控儀自動監(jiān)測細胞生長4天以上，根據(jù)細胞鋪展后形成電阻的大小反應細胞數(shù)量。cellindex值越大，細胞生長的越快，細胞數(shù)越多。8.pi檢測凋亡細胞在96孔板中，不同化合物對細胞進行處理24-36小時，2μl的pi染液(25ug/ml)加到96孔板中，孵育細胞20min,熒光顯微鏡下拍照，觀察紅色熒光的細胞數(shù)目。實施例1腫瘤細胞株中pde3a蛋白表達情況的檢測為了研究pde3a蛋白在腫瘤細胞中的表達情況，用免疫印跡法對通用材料中列舉的細胞株進行pde3a蛋白表達水平的檢測。結(jié)果如圖1所示，pde3a蛋白在smmc7721、fhcc98、h4、hela、bel7404、a498、sw1116等細胞株中為陽性表達，在其他20種細胞株中為陰性表達。進一步地，利用rt-pcr對部分細胞株的pde3amrna水平進行檢測；rq:相對β－actin的定量結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，smmc7721、fhcc98、h4、hela、bel7404、a498和sw1116中均有pde3amrna表達，h522和skov3中幾乎無pde3amrna表達，與免疫印跡的檢測結(jié)果一致。實施例2藥物的抗腫瘤活性實驗利用濃度為1μm的阿那格雷(anagrelide)對實施例1中的細胞株進行活性實驗，根據(jù)細胞存活率，將細胞株分成三類：敏感(s)、中度敏感(m)、不敏感(r)，并進一步測定阿那格雷抑制各細胞株的ic50值。結(jié)果如圖2所示，測試細胞株中共有7株敏感細胞和20株不敏感細胞(圖2)。表1顯示了阿那格雷抑制敏感細胞株的ic50值，其中，陽性表達pde3a的細胞株smmc7721，fhcc98，h4，hela為阿那格雷的敏感細胞，阿那格雷對其有極好的抑制效果，其ic50值均小于30nm；陽性表達pde3a的細胞株bel7404，a498和sw1116為阿那格雷的中度敏感細胞，阿那格雷對其有持久的抑制效果，其ic50值為0.4μμ-16μm。20株陰性表達pde3a的細胞株對阿那格雷均不敏感，表現(xiàn)出對阿那格雷的耐受，ic50值均＞50μm，即阿那格雷不能抑制其生長。表17株敏感細胞的ic50值細胞株helah4fhcc98smmc7721bel7404a498sw1116ic50(μm)0.0220.0230.0080.0150.42815.90014.510綜上，pde3a陽性細胞中，在阿那格雷處理后出現(xiàn)不同程度的生長抑制。此外，所有pde3a陰性細胞均對阿那格雷不敏感。實施例3pde3a蛋白敲除對敏感細胞生長的影響實施例1和實施例2從化合物抑制蛋白活性的角度來說明pde3a蛋白與生長抑制的關(guān)系，但是化合物由于結(jié)構(gòu)不同、與靶點作用方式不一樣，會造成細胞選擇性的差異。于是，在獲得pde3a蛋白細胞表達譜數(shù)據(jù)之后，利用sirna干擾技術(shù)，考察敲除pde3a蛋白對細胞生長影響。用兩個pde3asirna(效率不同)分別進行試驗，在sirna轉(zhuǎn)染細胞48小時后，將細胞鋪在rtca板上，進行長時間的生長監(jiān)控。結(jié)果如圖4所示：pde3a蛋白的表達量(圖4a)與細胞生長的快慢(圖4b)成正相關(guān)，表明pde3a蛋白在阿那格雷敏感的腫瘤細胞生長中起到重要的作用。實施例4pde3a蛋白參與調(diào)控阿那格雷引起的凋亡為研究pde3a蛋白本身是否參與調(diào)控阿那格雷引起的凋亡，先用sirna干擾技術(shù)，將pde3asirna轉(zhuǎn)染到敏感細胞hela進行敲除，再用阿那格雷處理細胞，考察pde3a蛋白與細胞對阿那格雷敏感性之間的關(guān)系。其中，kd組為轉(zhuǎn)染了pde3asirna的hela細胞，1和2分別代表兩個sirnanc組為轉(zhuǎn)染了無敲除效應的sirna的hela細胞，空白對照。結(jié)果表明，未加入阿那格雷情況下，pde3a的蛋白水平與hela細胞的生長成正相關(guān)，而阿那格雷加入之后，pde3a蛋白水平低的kd2存活率最高，而nc組的最低(圖5a)。pde3a敲除48小時后，阿那格雷處理hela細胞36小時，kd組的細胞也比對照組有較少的pi陽性細胞數(shù)(圖5b和圖5c)；同步進行mtt的檢測，也說明hela細胞的pde3a蛋白水平越低，越有利于對阿那格雷產(chǎn)生抵抗(圖5d)。上述結(jié)果表明，pde3a蛋白確實參與了阿那格雷對細胞凋亡的調(diào)控，pde3a蛋白表達水平可以作為阿那格雷治療治療效果的標志物。實施例5判斷阿那格雷治療腫瘤效果的診斷試劑盒的制備制備檢測阿那格雷治療腫瘤效果的試劑盒，所述試劑盒包括:(a)容器，以及位于容器內(nèi)的特異性針對pde3a的抗體：兔抗pde3a抗體；和(b)以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測阿那 格雷治療腫瘤的效果。實施例6免疫印跡法檢測細胞株sw480和mcf-7中，ped家族的其他成員，包括pde1a、pde3a、pde3b、pde4a、pde7a、pde11a的蛋白表達水平。結(jié)果如圖6所示，sw480和mcf-7中的pde3b表達水平相對比較高，而pde3a以及檢測的ped家族的其他成員的表達水平均比較低。討論阿那格雷作為一線治療血小板增多癥的藥物已有二十多年的歷史，而在實體腫瘤的治療史上始終是空白；先前實驗室的研究第一次證明阿那格雷可以作為一個選擇性極佳的抗腫瘤藥物用于臨床。深入其機制研究后，發(fā)現(xiàn)pde3a蛋白可以作為第一生物標記物輔助阿那格雷在臨床腫瘤患者的診斷和治療，這是該化合物研究至今，第一次有明確的靶標輔助個體化腫瘤治療。這一發(fā)現(xiàn)在一系列分子、細胞水平的試驗中得以證實——利用sirna干擾技術(shù)敲除敏感細胞中的pde3a蛋白，同時用同類抑制劑做競爭性結(jié)合實驗，最終證明阿那格雷與靶蛋白pde3a結(jié)合是該藥物誘導腫瘤細胞凋亡必需的。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)大約三分之一的腫瘤患者是pde3a高表達的，pde3a陽性表達的腫瘤細胞均對阿那格雷表現(xiàn)出不同程度的敏感性，而pde3a陰性的腫瘤對阿那格雷不敏感。總結(jié)如下：研究發(fā)現(xiàn)阿那格雷對多種腫瘤細胞(肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌)的生長顯示出較強的抑制作用，而至今仍未揭示其作用機制。經(jīng)過本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)阿那格雷造成細胞周期阻滯、細胞凋亡的原因，并找到了生物標記物pde3a蛋白指導臨床診斷、分型。進行腫瘤患者的個體化靶向治療。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當前第1頁12