本發(fā)明屬于水稻基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及水稻內(nèi)源雙向表達(dá)啟動(dòng)子的分離克隆及功能分析。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，作為轉(zhuǎn)錄水平上的重要調(diào)控元件，它能夠有效調(diào)控下游基因在特定時(shí)期、空間和信號(hào)刺激下的轉(zhuǎn)錄過程。隨著作物遺傳改良的進(jìn)程和功能基因組研究的發(fā)展，越來(lái)越多的作物性狀受到關(guān)注，同時(shí)越來(lái)越多可用于性狀改良的候選基因得到鑒定，候選基因的高效應(yīng)用必須依靠它們?cè)谔囟ú课?、生育期或者信?hào)刺激下的高效表達(dá)。因此，啟動(dòng)子的多樣性在基因工程中受到迫切的需求。

迄今為止，越來(lái)越多的單向啟動(dòng)子被克隆和鑒定，根據(jù)它們表達(dá)模式可分為組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(McElroy D,Zhang W,Cao J,Wu R.Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation.The Plant Cell,1990,2:163-171；Cai M,Wei J,Li X,Xu C,Wang S.A rice promoter containing both novel positive and negative cis-elements for regulation of green tissue-specific gene expression in transgenic plants.Plant Biotechnol J,2007,5:664-674；Vijayan J,Devanna BN,Singh NK,Sharma TR.Cloning and functional validation of early inducible Magnaporthe oryzae responsive CYP76M7promoter from rice.Front Plant Sci,2015,6:371)。雙向啟動(dòng)子泛指相鄰且轉(zhuǎn)錄方向相反呈“頭對(duì)頭結(jié)構(gòu)”的基因?qū)χg的序列，在基因工程中表現(xiàn)出更好的應(yīng)用潛力(Trinklein ND et al.An abundance of bidirectional promoters in the human genome.Genome Res,2004,14:62-66；Yang S,Sleight SC,Sauro HM.Rationally designed bidirectional promoter improves the evolutionary stability of synthetic genetic circuits.Nucleic Acids Res,2013,41:e33-e33)。這一優(yōu)勢(shì)主要得益于雙向啟動(dòng)子可以同時(shí)驅(qū)動(dòng)兩個(gè)靶基因表達(dá)，在載體構(gòu)建和基因聚合過程中更加方便省時(shí)(Kumar S et al.A combinatorial bidirectional and bicistronic approach for coordinated multi-gene expression in corn.Plant Mol Biol,2015,87:341-353)。而且，在導(dǎo)入多個(gè)外源基因的同時(shí)，往往需要使它們維持相同或相似的表達(dá)模式以達(dá)到對(duì)特定性狀進(jìn)行改良的目的(Ha SH et al.Application of two bicistronic systems involving 2A and IRES sequences to the biosynthesis of carotenoids in rice endosperm.Plant Biotechnol J,2010,8:928-938；Ogo Y,Ozawa K,Ishimaru T,Murayama T,Takaiwa F.Transgenic rice seed synthesizing diverse flavonoids at high levels:a new platform for flavonoid production with associated health benefits.Plant Biotechnol J,2013,11:734-746)。然而，具有相同或相似表達(dá)模式的單向啟動(dòng)子數(shù)量有限，重復(fù)使用可能造成生物體內(nèi)基因表達(dá)的沉默，同時(shí)也在載體構(gòu)建過程中造成時(shí)間和成本的更大消耗(Peremarti A et al.Promoter diversity in multigene transformation.Plant Mol Biol,2010,73:363-378)。由于很多雙向基因?qū)Υ嬖诠脖磉_(dá)的現(xiàn)象，雙向啟動(dòng)子5’和3’的表達(dá)模式在很多報(bào)道中是相似的(Huang Y,Xiao B,Xiong L.Characterization of a stress responsive proteinase inhibitor gene with positive effect in improving drought resistance in rice.Planta,2007,226:73-85；Chen W,Meaux JD,Lercher MJ.Co-expression of neighbouring genes in Arabidopsis:separating chromatin effects from direct interactions.BMC Genomics,2010,11:178；Didych D et al.Human PSENEN and U2AF1L4genes are concertedly regulated by a genuine bidirectional promoter.Gene,2013,515:34-41)。因此，雙向啟動(dòng)子還能夠克服相同表達(dá)模式單向啟動(dòng)子的缺乏問題。

由于啟動(dòng)子并不像基因編碼區(qū)有產(chǎn)物可以限制其在進(jìn)化過程中的變異，因此，除了保守的順式調(diào)控元件之外，啟動(dòng)子的序列存在高度變異(Müller F,Demény MA,Tora L.New problems in RNA polymerase II transcription initiation:matching the diversity of core promoters with a variety of promoter recognition factors.J Biol Chem,2007,282:14685-14689)。所以，研究啟動(dòng)子的保守性可以通過其調(diào)控的下游基因入手。早在2002年，Adachi等人就發(fā)現(xiàn)人類基因組中“頭對(duì)頭結(jié)構(gòu)”的基因?qū)ζ毡榇嬖?Adachi N,Lieber MR.Bidirectional gene organization:a common architectural feature of the human genome.Cell,2002,109:807-809)。其后，Li等人通過系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)“頭對(duì)頭結(jié)構(gòu)”的基因?qū)υ诓煌锓N中存在較高的保守性(Li Y et al.Systematic analysis of head-to-head gene organization:evolutionary conservation and potential biological relevance.PLoS Comput Biol,2006,2:e74)。2012年，Xu等人通過“頭對(duì)頭結(jié)構(gòu)”的基因?qū)υ诓煌锓N間的結(jié)構(gòu)保守性來(lái)研究雙向啟動(dòng)子的保守問題(Xu C,Chen J,Shen B.The preservation of bidirectional promoter architecture in eukaryotes:what is the driving force？BMC Syst Biol,2012,6:S21)。

根據(jù)已有報(bào)道，雙向啟動(dòng)子的鑒定方法可分為兩種，一種是利用生物信息學(xué)手段的鑒定方法，與之相對(duì)的則是利用實(shí)驗(yàn)手段的鑒定方法。生物信息學(xué)鑒定方法不盡相同，本質(zhì)上都是通過開發(fā)不同的語(yǔ)言模型預(yù)測(cè)啟動(dòng)子中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域、MOTIF的結(jié)合位點(diǎn)或者核小體缺失區(qū)域，篩選符合條件的雙向啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)相關(guān)性和功能相關(guān)性分析(Wang Q et al.Searching for bidirectional promoters in Arabidopsis thaliana.BMC Bioinformatics,2009,10:S29；Claeys M,Storms V,Sun H,Michoel T,Marchal K.MotifSuite:workflow for probabilistic motif detection and assessment.Bioinformatics,2012,28:1931-1932；Zhang W et al.High-resolution mapping of open chromatin in the rice genome.Genome Res,2012,22:151-162)。而實(shí)驗(yàn)鑒定方法則落腳于檢測(cè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)模式這一常規(guī)的啟動(dòng)子分析方法上面。一些研究是通過啟動(dòng)子正反驅(qū)動(dòng)同一個(gè)報(bào)告基因進(jìn)行鑒定(Huang Y,Xiao B,Xiong L.Characterization of a stress responsive proteinase inhibitor gene with positive effect in improving drought resistance in rice.Planta,2007,226:73-85)， 而一些研究是通過啟動(dòng)子同時(shí)驅(qū)動(dòng)兩個(gè)報(bào)告基因進(jìn)行鑒定(Léjard V,Rebours E,Meersseman C,Rocha D.Construction and validation of a novel dual reporter vector for studying mammalian bidirectional promoters.Plasmid,2014,74:1-8)，也有結(jié)合以上兩種方法同時(shí)鑒定的報(bào)道(Mishra RC,Grover A.Intergenic sequence between Arabidopsis caseinolytic protease B-cytoplasmic/heat shock protein100and choline kinase genes functions as a heat-inducible bidirectional promoter.Plant Physiol,2014,166:1646-1658)。通過實(shí)驗(yàn)手段克隆的雙向啟動(dòng)子，絕大多數(shù)都依附于其調(diào)控基因的研究。迄今為止，鮮有將生物信息學(xué)手段和實(shí)驗(yàn)手段相結(jié)合，根據(jù)雙向啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)模式進(jìn)行規(guī)?；Y選和鑒定的報(bào)道。

水稻是我國(guó)主要的糧食作物。因此，水稻遺傳改良的重要性和必要性不言而喻。多基因的導(dǎo)入是其中很關(guān)鍵的一步。前文已詳細(xì)介紹雙向啟動(dòng)子在多基因?qū)胫械膬?yōu)勢(shì)，所以水稻雙向啟動(dòng)子的挖掘?qū)τ谒具z傳改良是必不可少的。同時(shí)，水稻中完備的基因組信息(Goff SA et al.A draft sequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.japonica).Science,2002,296:92-100；Yu J et al.A draft sequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.indica).Science,2002,296:79-92；Pan Y et al.Comparative BAC-based physical mapping of Oryza sativa ssp.indica var.93-11and evaluation of the two rice reference sequence assemblies.Plant J,2014,77:795-805)及較為清楚的基因表達(dá)信息(Wang L et al.A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.Plant J,2010,61:752-766)也為雙向啟動(dòng)子的篩選和鑒定提供了極大的便利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，建立一個(gè)雙向啟動(dòng)子的篩選、克隆及功能分析的完整方法，并為基因工程和分子育種提供高效的雙向啟動(dòng)子資源。本發(fā)明結(jié)合MSU和RAP數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA-seq數(shù)據(jù)以及CREP數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)在水稻基因組中選取了候選雙向啟動(dòng)子BIP1，并利用它同時(shí)驅(qū)動(dòng)兩個(gè)報(bào)告基因綠色熒光蛋白基因(以下簡(jiǎn)稱GFP基因)和β-葡糖醛酸酶基因(以下簡(jiǎn)稱GUS基因)在水稻中表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的GUS和GFP分析結(jié)果顯示，BIP1啟動(dòng)子具有雙向表達(dá)活性。然后我們對(duì)其進(jìn)行5’和3’缺失分析，鑒定出其雙向表達(dá)調(diào)控區(qū)段以及控制其5’和3’方向基本表達(dá)活性的區(qū)段。隨后，利用生物信息學(xué)手段分析了BIP1在禾本科植物中的保守性。本發(fā)明為水稻雙向啟動(dòng)子的分離克隆及功能分析提供了一個(gè)成功的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

首先以MSU和RAP數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA-seq數(shù)據(jù)以及CREP數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，根據(jù)雙向啟動(dòng)子調(diào)控基因的位置信息和表達(dá)信息，選取了一個(gè)候選雙向啟動(dòng)子BIP1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。通過設(shè)計(jì)特異引物，從水稻明恢63的基因組中擴(kuò)增BIP1，并構(gòu)建表達(dá)載體BIP1-DX2181。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的GUS和GFP分析試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子BIP1在兩個(gè)方向均呈現(xiàn)出組成型高效表達(dá)。然后對(duì)其進(jìn)行5’和3’缺失分析，鑒定出其雙向表達(dá)調(diào)控區(qū)段R1以及控制其3’方向基本表達(dá)活性的區(qū)段R2和5’方向基本表達(dá)活性的區(qū)段R3。隨后，利用生物信息學(xué)手段分析了BIP1在禾本 科植物中的保守性。

本發(fā)明公開了雙向啟動(dòng)子的篩選及分離克隆方法、轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建過程、水稻遺傳轉(zhuǎn)化過程和轉(zhuǎn)化植物的GUS組織化學(xué)染色、GUS蛋白活性檢測(cè)、GFP組織學(xué)分析、GFP定量分析和雙向啟動(dòng)子的保守性分析等方法。

本發(fā)明的具體步驟是：

首先以MSU和RAP數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA-seq數(shù)據(jù)以及CREP數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，根據(jù)雙向啟動(dòng)子調(diào)控基因的位置信息和表達(dá)信息，選取了一個(gè)候選雙向啟動(dòng)子BIP1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。利用PCR法，以明恢63基因組DNA為模板，通過特異引物(表1)擴(kuò)增BIP1。PCR擴(kuò)增得到的BIP1經(jīng)過TA克隆(購(gòu)自Promega公司)后利用SP6和T7引物測(cè)序。經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證的克隆通過Pst I單酶切將BIP1導(dǎo)入載體DX2181(載體構(gòu)建圖及多克隆位點(diǎn)等信息見圖2)，得到重組的表達(dá)載體BIP1-DX2181(見圖3)。將重組的表達(dá)載體BIP1-DX2181通過電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105。

將水稻品種中花11(來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)的成熟種子消毒后誘導(dǎo)胚性愈傷組織。將含有表達(dá)載體BIP1-DX2181的農(nóng)桿菌菌株EHA105與胚性愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)后，在含有50mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性愈傷組織的篩選，經(jīng)過兩次篩選之后，挑取抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，當(dāng)分化的小苗長(zhǎng)到2-3cm時(shí)，切掉原生根，放到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根，當(dāng)新根生長(zhǎng)到2cm左右時(shí)，煉苗后移栽到溫室。這些再生小苗即為T₀代轉(zhuǎn)基因苗。

獲得轉(zhuǎn)基因植株后，通過GUS組織化學(xué)染色、GUS蛋白活性檢測(cè)、GFP組織學(xué)分析及GFP定量分析，考察BIP1在水稻中的表達(dá)模式和表達(dá)強(qiáng)度(見圖4、5)。檢測(cè)結(jié)果表明：?jiǎn)?dòng)子BIP1在水稻中呈現(xiàn)出雙向表達(dá)模式，且兩個(gè)方向均為組成型高效表達(dá)。

設(shè)計(jì)特異引物(表1)，用PCR法獲得在BIP1的5’端和3’端缺失的不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子(圖6)，并分別構(gòu)建到載體DX2181(來(lái)源：澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室)上。以同樣的方法轉(zhuǎn)化水稻品種中花11。獲得轉(zhuǎn)基因植株后，通過GUS組織化學(xué)染色、GUS蛋白活性檢測(cè)、GFP組織學(xué)分析及GFP定量分析(圖7、8)，鑒定出其雙向表達(dá)調(diào)控區(qū)段R1以及控制其3’方向基本表達(dá)活性的區(qū)段R2和5’方向基本表達(dá)活性的區(qū)段R3。

隨后，利用生物信息學(xué)手段分析發(fā)現(xiàn)：BIP1在六個(gè)禾本科植物(水稻、高粱、小米、二穗短柄草、玉米和小麥)中的水稻、高粱、二穗短柄草和玉米中均呈現(xiàn)出保守性。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明結(jié)合生物信息學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)手段，根據(jù)雙向啟動(dòng)子調(diào)控基因的位置信息和表達(dá)信息，建立了一個(gè)雙向啟動(dòng)子的篩選、克隆及功能分析的完整方法。

(2)本發(fā)明獲得了一個(gè)在水稻中組成型高強(qiáng)度表達(dá)的雙向啟動(dòng)子BIP1，為基因工程和分子育種提供了高效的雙向啟動(dòng)子資源。

附圖說明

序列表SEQ ID NO：1是本發(fā)明中雙向啟動(dòng)子BIP1的核苷酸序列；序列長(zhǎng)度為2237bp。

序列表SEQ ID NO：2是本發(fā)明中BIP1截短后的啟動(dòng)子BIP1-1F2R的核苷酸序列；序列長(zhǎng)度為1240bp。 序列表SEQ ID NO：3是本發(fā)明中BIP1截短后的啟動(dòng)子BIP1-1F3R的核苷酸序列；序列長(zhǎng)度為1099bp。序列表SEQ ID NO：4是本發(fā)明中BIP1截短后的啟動(dòng)子BIP1-2F1R的核苷酸序列；序列長(zhǎng)度為1540bp。序列表SEQ ID NO：5是本發(fā)明中BIP1截短后的啟動(dòng)子BIP1-2F2R的核苷酸序列；序列長(zhǎng)度為543bp。

圖1：本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖。

圖2：是DX2181載體結(jié)構(gòu)示意圖，本發(fā)明利用其骨架構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體。

圖3：是本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體BIP1-DX2181結(jié)構(gòu)示意圖。該載體是在DX2181的基礎(chǔ)上改造而來(lái)，將啟動(dòng)子BIP1插入質(zhì)粒DX2181的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。

圖4：組織學(xué)分析BIP1驅(qū)動(dòng)GUS基因和GFP基因在水稻不同組織中的表達(dá)情況。

圖5：由BIP1驅(qū)動(dòng)GUS基因和GFP基因的轉(zhuǎn)化植株的不同組織中GUS蛋白活性檢測(cè)和GFP定量分析結(jié)果。GFP relative expression level代表GFP的相對(duì)表達(dá)量；GUS activity(pMol 4-MU/min/mg protein)代表GUS酶活。

圖6：是本發(fā)明對(duì)BIP1進(jìn)行5’和3’缺失分析的示意圖。

圖7：組織學(xué)分析不同BIP1缺失啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因和GFP基因在水稻不同組織中的表達(dá)情況。

圖8：由不同BIP1缺失啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因和GFP基因分別在轉(zhuǎn)化植株各組織或器官中GUS蛋白活性檢測(cè)和GFP定量分析結(jié)果。附圖標(biāo)記說明：圖8中A圖顯示葉片的結(jié)果；圖8中B圖顯示的是葉鞘的結(jié)果；圖8中C圖顯示的是穗的結(jié)果；圖8中D圖顯示的是莖桿的結(jié)果；圖8中E圖顯示的是種子中的結(jié)果；圖8中F圖顯示的是根的結(jié)果。GFP relative expression level代表GFP的相對(duì)表達(dá)量；GUS activity(pMol4-MU/min/mg protein)代表GUS酶活。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：植物表達(dá)載體的構(gòu)建

如無(wú)特別說明，本說明書中所列參考方法及相應(yīng)分子生物學(xué)常規(guī)操作，參考：【J.薩姆布魯克等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)》，中譯本，科學(xué)出版社，北京，1996版】的相關(guān)信息。

本發(fā)明首先以MSU和RAP數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA-seq數(shù)據(jù)以及CREP數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)來(lái)選取候選的雙向啟動(dòng)子。選取原則基于：1、符合相鄰且轉(zhuǎn)錄方向相反呈“頭對(duì)頭結(jié)構(gòu)”的基因?qū)Γ?、RNA-seq數(shù)據(jù)中，基因?qū)Φ淖畲蟊磉_(dá)數(shù)值同時(shí)高于10；表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)中，基因?qū)Φ淖畲蟊磉_(dá)數(shù)值同時(shí)高于5000；3、基因?qū)υ?5個(gè)樣品的RNA-seq數(shù)據(jù)中的表達(dá)相關(guān)性高于0.4。依據(jù)以上原則選取了一組基因?qū)?，并分離它們的基因間區(qū)，即為候選雙向啟動(dòng)子。將其命名為BIP1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。利用PCR法，以明恢63基因組DNA為模板，通過特異引物(表1)擴(kuò)增BIP1。PCR擴(kuò)增得到的BIP1經(jīng)過TA克隆(Promega公司)后利用SP6和T7引物測(cè)序。經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證的克隆通過Pst I單酶切將BIP1導(dǎo)入載體DX2181(載體圖及多克隆位點(diǎn)等信息見圖2)，得到重組的表達(dá)載體BIP1-DX2181(見圖3)。將表達(dá)載體BIP1-DX2181通過電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌株EHA105菌株于-70℃下保存待用。

表1本發(fā)明中使用的引物序列

表1的說明：^a下劃線序列表示酶切位點(diǎn)。

實(shí)施例2：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的“農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化操作手冊(cè)”所示的方法(林擁軍等，2002)。轉(zhuǎn)化受體為水稻品種中花11(為常規(guī)品種，來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)的成熟種子所誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織。經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選得到具有潮霉素抗性的愈傷，再經(jīng)過分化、生根、練苗和移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述：

(1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟

1)愈傷誘導(dǎo)

a.將成熟的中花11水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl₂)種子表面消毒15分鐘；

b.用滅菌水洗種子4-5次；

c.將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；

d.將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1℃。

2)愈傷繼代

挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。

3)預(yù)培養(yǎng)

挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。

4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)

a.在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(該菌株來(lái)自CAMBIA公司商業(yè)化的農(nóng)桿菌菌株)兩天，溫度28℃；

b.將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。

5)農(nóng)桿菌侵染

a.將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；

b.調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

c.將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；

d.轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。

6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)

a.滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；

b.浸泡在含400mg/L羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；

c.轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；

d.轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。

7)分化

將生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，放置于光照培養(yǎng)室中進(jìn)行光照培養(yǎng)至分化出再生小苗。

8)生根

待再生小苗的芽長(zhǎng)至2-3cm高時(shí)即可進(jìn)行生根。用剪刀和鑷子將再生植株在分化培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的根清除干凈，將再生植株芽的下部插入生根培養(yǎng)基中，放置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)直至長(zhǎng)出白色的新根。

9)煉苗及移栽

當(dāng)新根生長(zhǎng)到2cm左右時(shí)，可進(jìn)行煉苗：將生根培養(yǎng)基的封口膜揭掉，加入適量自來(lái)水，在光照培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)3天。移栽：洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。

(2)主要溶液配方

1)N₆培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配制)：

將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000ml。

2)N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制：

將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。

3)鐵鹽(Fe_2-EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)：

將3.73g乙二胺四乙酸二鈉(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78g FeSO₄·7H₂O分別溶解，混合并用蒸餾水定容至1000ml，至70℃溫浴2小時(shí)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4)維生素貯存液(按照100X濃縮液配制)：

加蒸餾水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5)MS培養(yǎng)基大量元素母液(按照10X濃縮液配制)：

將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000ml。

6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(按照100X濃縮液配制)：

將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000ml。

7)2,4-D貯存液(1mg/ml)的配制：

稱取2,4-D 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，于室溫下保存。

8)6-BA貯存液(1mg/ml)的配制：

稱取6-BA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。

9)萘乙酸(NAA)貯存液(1mg/ml)的配制：

稱取NAA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10)吲哚乙酸(IAA)貯存液(1mg/ml)的配制：

稱取IAA 100mg，用1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)的配制：

稱取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

12)AS貯存液的配制：

稱取AS 0.392g，加入DMSO 10ml溶解，分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

13)1N氫氧化鉀貯存液配制：

稱取氫氧化鉀5.6g，用蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方

1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(例如121℃下滅菌25分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的滅菌方法相同)。

2)繼代培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法滅菌。

3)預(yù)培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。

使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250ul AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。

4)共培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。

使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250ul AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。

5)懸浮培養(yǎng)基

加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100ml的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。

使用前加入1ml無(wú)菌葡萄糖貯存液和100ul AS貯存液。

6)選擇培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。

使用前溶解培養(yǎng)基，加入250ul HN(50mg/ml)和400ul CN(250mg/ml)分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。(注：第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400mg/l，第二次及以后選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為250mg/l)。

7)預(yù)分化培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。

使用前溶解培養(yǎng)基，250ul HN(50mg/ml)250ul CN(250mg/ml)，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。

8)分化培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。

煮沸并用蒸餾水定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方法滅菌。

9)生根培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。

煮沸并用蒸餾水定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法滅菌。

實(shí)施例3：利用PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株

將轉(zhuǎn)化苗移入溫室后，待其返青，然后分單株取1-2cm幼嫩葉片，抽提其基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用PCR法檢測(cè)陽(yáng)性植株。擴(kuò)增片段為報(bào)告基因gus的部分片段，片段大小為699bp。引物序列為GUS-F:GGGCGAACAGTTCCTGATTA，GUS-R:AACGTATCCACGCCGTATTC。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min，94℃50sec，57℃40sec，72℃50sec，30個(gè)循環(huán)，72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖膠電泳檢測(cè)。對(duì)所有T₀代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果剔除假陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株。

利用小量葉片基因組DNA的提取方法提取基因組DNA:取適量幼嫩葉片，加800μl 1.5×CTAB(1.5×CTAB配方：1.5％CTAB、75mM Tris-HCl、15mM EDTA及1.05M NaCl)研磨，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中；65℃水浴30min；加入600μL氯仿/異戊醇(體積比為24:1)上下顛倒數(shù)次(約15min)，下層液相呈深綠色為止；室溫下12000r/min離心10min；取500μL上清于一新1.5ml離心管，加入預(yù)冷的95％乙醇1mL，混勻后置-20℃，30min；室溫下12000r/min離心10min，去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100μL ddH₂O溶解，備用。

實(shí)施例4：?jiǎn)?dòng)子BIP1在水稻各組織中的表達(dá)模式

取表達(dá)載體BIP1-DX2181陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株(參考實(shí)施例3)的不同組織(包括：根、葉片、葉鞘、莖桿、穗及種子)切成約0.5CM長(zhǎng)度的適當(dāng)大小，浸入約200μl的GUS染液，37℃過夜，然后用75％酒精脫色，觀察是否有藍(lán)色出現(xiàn)。染色液的配方參照J(rèn)efferson等報(bào)道的方法(Jefferson,R.A.,Kavanagh,T.A.and Bevan,M.W.GUS fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.1987,6,3901-3907)。

表達(dá)載體BIP1-DX2181陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的GFP組織學(xué)分析通過熒光顯微鏡進(jìn)行。取T₀代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的各個(gè)組織(葉片、葉鞘、莖桿、根、穗及種子)在熒光顯微鏡(Leica MZ16F)的GFP2檔下觀察，并利用Leica Application Suite software拍照。

檢測(cè)結(jié)果顯示：本發(fā)明分離的啟動(dòng)子BIP1在水稻中呈現(xiàn)出雙向表達(dá)模式，且兩個(gè)方向均為組成型高效表達(dá)(見圖4)。

實(shí)施例5：?jiǎn)?dòng)子BIP1在水稻不同組織中的表達(dá)強(qiáng)度分析

取表達(dá)載體BIP1-DX2181陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的不同組織(包括：根、葉片、葉鞘、莖桿、穗及種子)并抽提總蛋白，然后測(cè)定其GUS活性。總蛋白的抽提及濃度測(cè)定參考Bradford的方法(Bradford,M.M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.1976,72,248-254)，GUS活性測(cè)定參考Xu的方法(Xu,L.et al.Isolation of the endosperm-specific LPAAT gene promoter from coconut(Cocos nucifera L.)and its functional analysis in transgenic rice plants.Plant Cell Rep.2010,29,1061-1068)。

BIP1-DX2181陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株不同組織的GFP表達(dá)量利用quantitative real-time PCR(qRT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因植株不同組織的總RNA抽提方法和具體步驟如下(采用北京全式金生物科技有限公司的TransZol，具體操作步驟參考其說明書)。進(jìn)行質(zhì)量分析和濃度檢測(cè)后，使用invitrogen公司的SSIII試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成用于real-time PCR的cDNA第一鏈。qRT-PCR使用寶生物工程大連有限公司的SYBR Green Master Mix試劑盒。所用引物序列為：目的基因：GFP-F:5’-ATCCGCCACAACATCGAGGA-3’；GFP-R:5’-TCGTCCATGCCGAGAGTGAT-3’；內(nèi)參基因：GAPDH-F:5’-CTGCAACTCAGAAGACCGTTG-3’； GAPDH-R:5’-CCTGTTGTCACCCTGGAAGTC-3’。反應(yīng)在ABI 7500PCR儀上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析方法采用2^-ΔΔC_T法。

BIP1-DX2181轉(zhuǎn)基因植株的GUS及GFP報(bào)告基因定量檢測(cè)的結(jié)果(圖5)顯示，啟動(dòng)子BIP1的3’方向的表達(dá)活性在種子中最高，其GUS活性達(dá)到17806±2108pmol 4-MU/min/mg protein；其次是根，GUS活性為14769±1782pmol 4-MU/min/mg protein；接下來(lái)是莖桿，葉鞘，穗和葉片，GUS活性分別為9825±1510，8681±834，7380±895和6092±875pmol 4-MU/min/mg protein。啟動(dòng)子BIP1的5’方向的表達(dá)活性在穗中最高，是葉片中表達(dá)活性的3.4倍；而根，葉鞘，莖桿和種子中GFP的表達(dá)量分別是葉片中的2.8，2.5，1.4和1.1倍。

實(shí)施例6：?jiǎn)?dòng)子BIP1的5’和3’缺失分析

為了尋找雙向啟動(dòng)子BIP1的雙向表達(dá)調(diào)控區(qū)域，對(duì)它進(jìn)行5’和3’缺失分析。以測(cè)序驗(yàn)證的TA-BIP1為模板，利用PCR法，設(shè)計(jì)特異引物(表1)來(lái)構(gòu)建BIP1的一系列5’和3’缺失啟動(dòng)子(圖6)。載體構(gòu)建、水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的GUS和GFP相關(guān)分析方法均與上述實(shí)施例相同。不同BIP1缺失啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因和GFP基因在水稻不同組織中的表達(dá)情況見圖7。不同BIP1缺失啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因和GFP基因的轉(zhuǎn)化植株的不同組織中GUS蛋白活性檢測(cè)和GFP定量分析結(jié)果見圖8。

結(jié)果顯示，BIP1-1F2R轉(zhuǎn)基因植株各組織的GUS活性遠(yuǎn)低于BIP1轉(zhuǎn)基因植株，尤其是根，莖桿，種子和穗的GUS活性低于BIP1轉(zhuǎn)基因植株相應(yīng)組織的10％。由此可以推斷，Region 1能夠大幅度提升BIP1的3’方向的轉(zhuǎn)錄活性。與此同時(shí)，BIP1-1F2R轉(zhuǎn)基因植株各組織的GFP表達(dá)量也明顯低于BIP1轉(zhuǎn)基因植株。以上結(jié)果表明，Region 1是一個(gè)雙向轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)段。進(jìn)一步截短BIP1的3’端導(dǎo)致BIP1-1F3R轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性完全喪失，而BIP1-1F3R轉(zhuǎn)基因植株各組織的GFP表達(dá)量與BIP1-1F2R轉(zhuǎn)基因植株相比并無(wú)明顯降低。該結(jié)果表明，Region 2調(diào)控BIP1的3’方向的基本轉(zhuǎn)錄活性，而與5’方向的轉(zhuǎn)錄活性無(wú)關(guān)。BIP1-2F1R和BIP1-2F2R轉(zhuǎn)基因植株均檢測(cè)不到GFP表達(dá)，說明Region 3的缺失導(dǎo)致BIP1的5’方向的轉(zhuǎn)錄活性完全喪失。BIP1-2F1R轉(zhuǎn)基因植株的GUS分析結(jié)果顯示，Region 3的缺失對(duì)于BIP1在大多數(shù)組織中3’方向的表達(dá)活性影響微弱，但對(duì)啟動(dòng)子在根中3’方向的表達(dá)活性卻影響很大，BIP1-2F1R轉(zhuǎn)基因植株根的GUS活性明顯低于BIP1轉(zhuǎn)基因植株。上述結(jié)果表明，Region 3調(diào)控BIP1的5’方向的基本轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)，它還能夠正向調(diào)控BIP1的3’方向在根中的轉(zhuǎn)錄活性。

實(shí)施例7：?jiǎn)?dòng)子BIP1在禾本科植物中的保守性分析

由于啟動(dòng)子并不像基因編碼區(qū)有產(chǎn)物可以限制其在進(jìn)化過程中的變異，因此，除了保守的順式調(diào)控元件之外，啟動(dòng)子的序列存在高度變異。故研究啟動(dòng)子的保守性可以通過其調(diào)控的下游基因入手。本發(fā)明利用Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/index.html)中的信息分析四組基因?qū)υ诤瘫究浦参镏小邦^對(duì)頭結(jié)構(gòu)”的保守性。若一組基因?qū)υ诹硪晃锓N中均存在同源基因，且同源基因的排列方式仍然呈現(xiàn)“頭對(duì)頭結(jié)構(gòu)”，則將調(diào)控它們的啟動(dòng)子視為保守的雙向啟動(dòng)子(c-BIP)；反之，若同源基因的排列方式不呈現(xiàn)“頭對(duì)頭結(jié)構(gòu)”，則將調(diào)控它們的啟動(dòng)子視為非保守的雙向啟動(dòng)子(n-BIP)。

表2啟動(dòng)子BIP1在不同禾本科植物間的保守性分析

表2的結(jié)果顯示，本發(fā)明克隆的啟動(dòng)子BIP1在六個(gè)禾本科植物中的4個(gè)物種：水稻、高粱、二穗短柄草和玉米中均為保守，表明它調(diào)控的兩個(gè)基因在進(jìn)化過程中相對(duì)保守，在多數(shù)物種中均維持了這樣的“頭對(duì)頭結(jié)構(gòu)”。同時(shí)，受到雙向啟動(dòng)子BIP1調(diào)控的兩個(gè)基因，LOC_Os02g42314和LOC_Os02g42320的功能注釋分別為泛素偶聯(lián)酶和蛋白酶，都屬于保守的結(jié)構(gòu)基因。而且，它們?cè)诠δ苌弦泊嬖谝欢ǖ南嚓P(guān)性，進(jìn)一步佐證其共進(jìn)化的關(guān)系。

本發(fā)明獲得了一個(gè)在水稻中組成型高強(qiáng)度表達(dá)的雙向啟動(dòng)子BIP1，為基因工程和分子育種提供了高效的雙向啟動(dòng)子資源。同時(shí)，本發(fā)明結(jié)合生物信息學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)手段，根據(jù)雙向啟動(dòng)子調(diào)控基因的位置信息和表達(dá)信息，建立了一個(gè)雙向啟動(dòng)子的篩選、克隆及功能分析的完整方法。