本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種成纖維細胞及其制備方法和應用、細胞分泌液及其應用。

背景技術：

皮膚是身體在面對外在威脅性傷害、微生物等的第一道防御關卡，在生理上具有重要功能。皮膚創(chuàng)傷可能會對皮膚造成嚴重損害，影響其皮膜屏障的初級免疫功能，嚴重時可能會全身性的感染危險。

皮膚創(chuàng)傷后的創(chuàng)傷修復和愈合過程基本分成以下五個步驟：一、凝血、止血和炎癥細胞進入；二、細胞增殖、修補缺損；三、結(jié)締組織生成；四、創(chuàng)傷修復組織和部位收縮；五、組織重建其完整性。

然而，傳統(tǒng)的方法一般采用化學合成類藥物來治療皮膚創(chuàng)傷，較少采用生物類制劑治療皮膚創(chuàng)傷。

技術實現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種可用于制備創(chuàng)傷愈合藥物的成纖維細胞、以及一種制備成纖維細胞的方法、一種成纖維細胞的細胞分泌液及其應用。

一種成纖維細胞，保藏號為cctccno:c201684。

上述成纖維細胞在制備創(chuàng)傷愈合藥物中的應用。

一種成纖維細胞的細胞分泌液，所述細胞分泌液通過以下制備方法獲得：

用細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)一種成纖維細胞，得到細胞培養(yǎng)液；以及

收集所述細胞培養(yǎng)液中的上清，得到所述細胞分泌液。

在一個實施方式中，所述細胞分泌液中包括堿性成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β1中的一種或多種。

在一個實施方式中，所述細胞培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和細胞生長激素，所 述基礎培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，所述細胞生長激素包括胎牛血清、腺嘌呤和胰島素；所述胎牛血清在所述細胞培養(yǎng)基中的體積百分含量為5％～10％，所述腺嘌呤在所述細胞培養(yǎng)基中的濃度為0.1mm～0.2mm，所述胰島素在所述細胞培養(yǎng)基中的濃度為2μg/ml～8μg/ml。

上述細胞分泌液在制備創(chuàng)傷愈合藥物中的應用。

一種成纖維細胞的制備方法，包括如下步驟：

提供飼養(yǎng)層細胞；

將未分化的胚胎干細胞移植至所述飼養(yǎng)層細胞上；以及

將所述胚胎干細胞和所述飼養(yǎng)層細胞置于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導所述胚胎干細胞分化得到所述成纖維細胞。

在一個實施方式中，所述未分化的胚胎干細胞為未分化的人類胚胎干細胞，所述飼養(yǎng)層細胞為有絲分裂滅活的小鼠成纖維細胞。

在一個實施方式中，誘導所述胚胎干細胞分化得到所述成纖維細胞的操作具體為：將所述胚胎干細胞和所述飼養(yǎng)層細胞置于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天～28天，培養(yǎng)的第4天～7天，在誘導培養(yǎng)基中額外加入人源骨形成蛋白-4，繼續(xù)培養(yǎng)后得到所述成纖維細胞；其中，所述誘導培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和細胞生長激素，所述基礎培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，所述細胞生長激素包括胎牛血清、腺嘌呤、胰島素和氫化可的松。

在一個實施方式中，所述胎牛血清在所述誘導培養(yǎng)基中的體積百分含量為5％～10％，所述腺嘌呤在所述誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.1mmol/l～0.2mmol/l，所述胰島素在所述誘導培養(yǎng)基中的濃度為2μg/ml～8μg/ml，所述氫化可的松在所述誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.3μg/ml～0.7μg/ml，所述人源骨形成蛋白-4在所述誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.3nmol/l～0.7nmol/l。

經(jīng)elisa試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，酶聯(lián)免疫吸附測定試驗)證明，這種成纖維細胞的細胞分泌液中含有堿性成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β1中的一種或多種與創(chuàng)傷愈合有關的細胞生長因子。動物試驗表明，該成纖維細胞的細胞分泌液能夠促進創(chuàng)傷愈合，具有良好的治療效果。

附圖說明

圖1為一實施方式的成纖維細胞的制備方法的流程圖；

圖2為胚胎干細胞誘導培養(yǎng)得到的成纖維細胞在光學顯微鏡下的圖片；

圖3為流式細胞儀中加入cd90抗體，分化培養(yǎng)后的成纖維細胞經(jīng)過流式細胞儀的檢測結(jié)果圖；

圖4為流式細胞儀中加入cd90抗體，分化培養(yǎng)后的成纖維細胞經(jīng)過流式細胞儀的檢測結(jié)果圖；

圖5為一實施方式的成纖維細胞的細胞分泌液的制備方法的流程圖；

圖6a為用藥組的sd大鼠創(chuàng)傷時的照片；

圖6b為用藥組的sd大鼠用藥4天后的照片；

圖6c為用藥組的sd的大鼠用藥8天后的照片；

圖6d為用藥組的sd大鼠用藥12天后的照片；

圖7a為實驗對照組的大鼠創(chuàng)傷時的照片；

圖7b為實驗對照組的sd大鼠用藥4天后的照片；

圖7c為實驗對照組的sd大鼠用藥8天后的照片；

圖7d為實驗對照組的sd大鼠用藥12天后的照片；

圖8為用藥組和實驗對照組的sd大鼠創(chuàng)面面積隨時間變化的結(jié)果圖。

具體實施方式

下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對成纖維細胞、成纖維細胞的細胞分泌液及其在創(chuàng)傷愈合藥物中應用作進一步的說明。

一實施方式的成纖維細胞于2016年4月27日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：中國.武漢.武漢大學，保藏號為cctccno：c201684，分類命名：人成纖維細胞hf-1。該成纖維細胞來源于人胚胎干細胞。

該成纖維細胞可分泌出堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，簡稱bfgf)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，簡稱：vegf)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，簡稱tgf-β1) 中的一種或多種與皮膚創(chuàng)傷愈合相關的細胞生長因子。該成纖維細胞可用于制備創(chuàng)傷愈合藥物。

一實施方式的成纖維細胞的制備方法獲得，如圖1所示，該方法包括以下步驟s110～s130。細胞屬于僅用結(jié)構和/或組成特征不能清楚表征的產(chǎn)品，并且用制備方法之外的其他特征不能充分表征。根據(jù)審查指南第二部分第十章第4.3節(jié)的規(guī)定，該類產(chǎn)品的權利要求，允許采用制備方法來表征。

s110、提供飼養(yǎng)層細胞。

飼養(yǎng)層細胞是指一些特定細胞，經(jīng)有絲分裂阻斷劑處理后所得的細胞單層?？勺鳛轱曫B(yǎng)層細胞的有顆粒細胞、成纖維細胞、輸卵管上皮細胞等。經(jīng)有絲分裂阻斷劑處理后，飼養(yǎng)層細胞不分裂不增殖，但仍保持代謝活性。有絲分裂阻斷劑可以為絲裂霉素。飼養(yǎng)層細胞可以分泌一些促進干細胞維持的因子，為干細胞生長提供有利的條件。

具體的，飼養(yǎng)層細胞可以為小鼠成纖維細胞(mouseembryonicfibroblasts，mefs)，還可以為人的成纖維細胞(humanembryonicfibroblasts，hefs)。本實施方式中，飼養(yǎng)層細胞為小鼠成纖維細胞。

本實施方式中，將小鼠成纖維細胞復蘇培養(yǎng)后，使用絲裂霉素c在37℃，5％的co2的溫箱中孵育2小時。用磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline，pbs)洗去多余的絲裂霉素c，然后用0.05％的胰酶消化。小鼠成纖維細胞脫壁后加入培養(yǎng)基中和，之后將小鼠成纖維細胞細胞以2×10⁵個/孔～4×10⁵個/孔的密度接種于六孔板中(六孔板的單孔面積大約為10cm²)，小鼠成纖維細胞細胞的密度大約為2×10⁴個/cm²～4×10⁴個/cm²。37℃，5％的co2的溫箱中孵育24小時后用于接種胚胎干細胞。

s120、將未分化的胚胎干細胞移植至飼養(yǎng)層細胞上。

在本說明書中“胚胎干細胞”(embryonicstemcell，escs，簡稱es、ek或esc細胞)可以包含哺乳動物來源的所有胚胎干細胞，包括人體胚胎干細胞。人體胚胎干細胞可以使用例如chhes-253等，但并不限定于此。并且，胚胎干細胞可被公眾所獲得。

一般的，預先用固定劑將飼養(yǎng)層細胞固定，固定劑可以為4％的多聚甲醛等。 然后將未分化的胚胎干細胞移植至飼養(yǎng)層細胞上。本實施方式中，未分化的胚胎干細胞的植入密度為3個克隆/cm²～5個克隆/cm²。相當于大約以30個克隆/孔～50個克隆/孔的密度接種于六孔板中。

s130、將胚胎干細胞和飼養(yǎng)層細胞置于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導胚胎干細胞分化得到成纖維細胞。

將胚胎干細胞移植至飼養(yǎng)層細胞上后，胚胎干細胞和飼養(yǎng)層細胞置于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。胚胎干細胞是早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的一類細胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，胚胎干細胞可在誘導培養(yǎng)基分化得到成纖維細胞。

具體的，誘導所述胚胎干細胞分化得到成纖維細胞的操作具體為：將胚胎干細胞和飼養(yǎng)層細胞置于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天～28天，培養(yǎng)第4天～7天，在誘導培養(yǎng)基中額外加入人源骨形成蛋白-4(humanbonemorphogeneticprotein4，簡稱bmp-4)，繼續(xù)培養(yǎng)后得到成纖維細胞。其中，誘導培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和細胞生長激素，基礎培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，細胞生長激素包括胎牛血清、腺嘌呤、胰島素和氫化可的松。

具體的，dmem/f12培養(yǎng)基可以從lifetechenology公司、sigma公司等地方購買。胎牛血清在誘導培養(yǎng)基中的體積百分含量為5％～10％，所述腺嘌呤在所述細胞培養(yǎng)基中的濃度為0.1mmol/l～0.2mmol/l，胰島素在誘導培養(yǎng)基中的濃度為2μg/ml～8μg/ml，氫化可的松在誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.3μg/ml～0.7μg/ml，人源骨形成蛋白-4在誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.3nmol/l～0.7nmol/l。這種培養(yǎng)基可有效誘導胚胎干細胞分化成成纖維細胞。

本實施方式中，誘導培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和細胞生長激素，基礎培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，胎牛血清在誘導培養(yǎng)基中的體積百分含量為10％，腺嘌呤在細胞培養(yǎng)基中的濃度為0.15mmol/l，胰島素在誘導培養(yǎng)基中的濃度為5μg/ml，氫化可的松在誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5μg/ml。將胚胎干細胞和飼養(yǎng)層細胞置于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，第4天～7天再額外加入bmp-4，bmp-4的加入量為0.5nmol/l。

光學顯微鏡下觀察胚胎干細胞誘導培養(yǎng)得到的成纖維細胞如圖2所示。通 過光學顯微鏡看到細胞的形態(tài)，從而判斷胚胎干細胞是否分化。從圖2可以看出，絕大部分的細胞均為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構，表明經(jīng)過誘導培養(yǎng)后，未分化的胚胎干細胞已經(jīng)分化成成纖維細胞。

進一步的，還可通過流式細胞儀檢測胚胎干細胞是否分化成成纖維細胞。成纖維細胞上可特異性標記cd90抗原和cd73抗原，通過流式細胞儀檢測未分化的胚胎干細胞和分化培養(yǎng)后的細胞中成纖維細胞的含量。流式細胞儀中加入cd90抗體，分化培養(yǎng)后的成纖維細胞經(jīng)過流式細胞儀的檢測結(jié)果如圖3所示，橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)目。流式細胞儀中加入cd73抗體，分化培養(yǎng)后的成纖維細胞經(jīng)過流式細胞儀的檢測結(jié)果如圖4所示，橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)目。通過圖3和圖4可以得出，cd90和cd73陽性細胞比例分別高達99.2％±0.4％和98.3％±0.9％。說明本申請的方法可有效的誘導胚胎干細胞分化為成纖維細胞。

本申請中，通過將未分化的胚胎干細胞移植至飼養(yǎng)層細胞上，并將胚胎干細胞和飼養(yǎng)層細胞置于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導胚胎干細胞分化得到成纖維細胞。獲得的胚胎干細胞來源的成纖維細胞可在細胞培養(yǎng)基中長期穩(wěn)定培養(yǎng)，并分泌出bfgf、vegf和tgf-β1中的一種或多種與創(chuàng)傷愈合有關的細胞生長因子。

本實施方式中，可通過培養(yǎng)這種胚胎干細胞來源的成纖維細胞，成纖維細胞的細胞分泌的bfgf、vegf和tgf-β1等細胞生長因子會擴散在細胞培養(yǎng)液中，取細胞培養(yǎng)液中的上清即可獲得成纖維細胞的細胞分泌液。這種細胞分泌液可用于制備創(chuàng)傷愈合的藥物。細胞分泌液獲取簡單，存儲方便。當然，在其他實施方式中，這種胚胎干細胞來源的成纖維細胞本身可用作制備創(chuàng)傷愈合的藥物，例如將成纖維細胞收集后干燥得到含細胞的凍干粉。

一種成纖維細胞的細胞分泌液，成纖維細胞的細胞分泌液通過以下制備方法獲得。如圖5所示，該方法包括以下步驟s210和s220。細胞分泌液屬于僅用結(jié)構和/或組成特征不能清楚表征的產(chǎn)品，并且用制備方法之外的其他特征不能充分表征。根據(jù)審查指南第二部分第十章第4.3節(jié)的規(guī)定，該類產(chǎn)品的權利要求，允許采用制備方法來表征。

s210、用細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)成纖維細胞，得到細胞培養(yǎng)液。

用于培養(yǎng)成纖維細胞的細胞培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和細胞生長激素，基礎培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，細胞生長激素包括胎牛血清、腺嘌呤和胰島素。

具體的，成纖維細胞與保藏號為cctccno：c201684的細胞相同。

具體的，dmem/f12培養(yǎng)基可以從lifetechnology公司，sigma公司等地方購買。胎牛血清在細胞培養(yǎng)基中的體積百分含量為5％～10％，腺嘌呤在細胞培養(yǎng)基中的濃度為0.1mmol/l～0.2mmol/l，胰島素在細胞培養(yǎng)基中的濃度為2μg/ml～8μg/ml。其他的培養(yǎng)條件采用本領域常規(guī)的方法培養(yǎng)即可。

本實施方式中，細胞培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和細胞生長激素，基礎培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，胎牛血清在細胞培養(yǎng)基中的體積百分含量為10％，腺嘌呤在細胞培養(yǎng)基中的濃度為0.15mmol/l，胰島素的在細胞培養(yǎng)基中的濃度為5μg/ml。

本實施方式中，將成纖維細胞用胰酶消化傳代至預先i型膠原蛋白鋪皿的培養(yǎng)板上，繼續(xù)擴增傳代。i型膠原蛋白可促進細胞貼壁。

s220、收集細胞培養(yǎng)液中的上清，得到細胞分泌液。

成纖維細胞分泌的bfgf、vegf和tgf-β1等細胞生長因子會擴散在細胞培養(yǎng)液中。由于成纖維細胞為貼壁生長的細胞，收集細胞培養(yǎng)液，離心去除培養(yǎng)液中的細胞碎片沉渣，收集培養(yǎng)液上清，即獲得細胞分泌液。

具體的，在培養(yǎng)過程中每隔20小時～28小時左右換液一次，收集換下的培養(yǎng)液，離心去除細胞碎片沉渣，收集培養(yǎng)液上清，并用elisa試驗檢測培養(yǎng)液上清中的bfgf、vegf和tgf-β1的分泌量。

本實施方式中，每隔24小時換液一次，收集換下的培養(yǎng)液，離心去除細胞碎片沉渣，收集培養(yǎng)液上清，并用elisa試驗檢測培養(yǎng)液上清中的bfgf、vegf和tgf-β1的分泌量。

實驗表明，成纖維細胞的細胞分泌液中包括bfgf、vegf和tgf-β1中的一種或多種。培養(yǎng)第三天可檢測到bfgf，濃度最高可達到30pg/ml。培養(yǎng)第二天可檢測到vegf，濃度最高可達到1653pg/ml。培養(yǎng)第一天可檢測到tgf-β1，濃度最高可達到1455pg/ml。并且bfgf、vegf和tgf-β1在低溫條件下存儲 30天后含量沒有明顯的變化，表明這些生長因子的穩(wěn)定性好，可長時間儲存。

動物實驗表明，該成纖維細胞的細胞分泌液可有效治療創(chuàng)傷?？蓱糜趧?chuàng)傷愈合的藥物中。

以下為具體實施例。

以下實施例中，如無特別說明，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。所用實驗材料dmem/f12培養(yǎng)基購自lifetechenologies公司，貨號為10565018。胎牛血清購自gibco公司，貨號為10099141。腺嘌呤購自sigma公司,貨號為a2786。胰島素購自sigma公司，貨號為a8626。氫化可的松購自sigma公司，貨號為d4902。bmp-4購自r&dsystems公司,貨號為314-bp。

實施例1

成纖維細胞的制備

將未分化的人胚胎干細胞(hescs)種植在預先4％多聚甲醛固定后的小鼠成纖維細胞(mef)上，將胚胎干細胞和飼養(yǎng)層細胞置于誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中誘導培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和細胞生長激素，基礎培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，胎牛血清在誘導培養(yǎng)基中的體積百分含量為5％，腺嘌呤在誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.15mmol/l，胰島素在誘導培養(yǎng)基中的濃度為5μg/ml，氫化可的松在誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5μg/ml。每隔24h更換誘導培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)的第4天～7天，誘導培養(yǎng)基中額外加入bmp-4，bmp-4的加入量為0.5nmol/l。誘導分化后得到胚胎干細胞來源的成纖維細胞?？蓪⒌玫降某衫w維細胞擴增后保存，以備下次使用。該成纖維細胞的保藏號為cctccno：c201684。

實施例2

成纖維細胞的細胞分泌液的制備

采用實施例1的方法制備得到成纖維細胞，擴增后用胰酶消化傳代至預先i型膠原蛋白鋪皿的培養(yǎng)板上，繼續(xù)擴增傳代。培養(yǎng)成纖維細胞的細胞培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和細胞生長激素，基礎培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，胎牛血清在 細胞培養(yǎng)基中的體積百分含量為10％，腺嘌呤在誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.15mmol/l，胰島素在細胞培養(yǎng)基中的濃度為5μg/ml。每隔24小時換液一次，收集換下的培養(yǎng)液，離心去除培養(yǎng)液中的細胞碎片沉渣，上清即為成纖維細胞的細胞分泌液。用elisa試驗檢測細胞分泌液中的bfgf、vegf和tgf-β1的含量。

實施例3

成纖維細胞的細胞分泌液中bfgf、vegf和tgf-β1含量的測定

采用實施例2的方法制備得到成纖維細胞的細胞分泌液，每隔24小時收集一次成纖維細胞的細胞分泌液。采用elisa試驗檢測bfgf、vegf和tgf-β1的含量，結(jié)果如表1所示。

表1細胞分泌液中bfgf、vegf和tgf-β1含量

從表1可以看出，成纖維細胞的細胞分泌液中包括bfgf、vegf和tgf-β1中的一種或多種與創(chuàng)傷愈合有關的生長因子。培養(yǎng)第三天可檢測到bfgf，濃度最高可達到30pg/ml。培養(yǎng)第二天可檢測到vegf，濃度最高可達到1653pg/ml。培養(yǎng)第一天可檢測到tgf-β1，濃度最高可達到1455pg/ml。

實施例4

bfgf、vegf和tgf-β1的穩(wěn)定性測定

采用實施例2的方法制備得到的細胞分泌液，分別測定新鮮的細胞分泌液中bfgf、vegf和tgf-β1的含量。然后將細胞分泌液存儲在-20℃條件下30天，再次測定新鮮的細胞分泌液中bfgf、vegf和tgf-β1的含量，結(jié)果如2所示。

表2bfgf、vegf和tgf-β1在低溫條件下的穩(wěn)定性結(jié)果

從表2可以看出，且bfgf、vegf和tgf-β1在-20℃條件下存儲30天后含量沒有明顯的變化，表明這些生長因子的穩(wěn)定性好，可長時間儲存。

實施例5

成纖維細胞的細胞分泌液的對大鼠創(chuàng)傷愈合的作用

1、sd大鼠燙傷模型的制作

sd大鼠為大鼠的一個品系，其毛色白化，廣泛用于藥理、毒理及藥效實驗中，sd大鼠可購自中南大學實驗動物學部。燙傷前將實驗用大鼠行腹腔注射戊巴比妥鈉(60mg/kg體重)麻醉，背部皮膚用8％的na2s脫毛。用截面積為2.5×2.5厘米的小鎖在100℃中煮沸后，在大鼠背部燙傷12秒鐘，得到sd大鼠燙傷模型。

2、燙傷的sd大鼠的治療

分別對燙傷的sd大鼠模型治療。實驗分為用藥組、實驗對照組和空白對照 組。

用藥組：采用實施例2的方法制備得到的成纖維細胞的細胞分泌液涂覆在燙傷的sd大鼠上，每天3次，每次1ml。每隔四天對sd大鼠拍攝，計算傷口面積。圖6a為用藥組的sd大鼠創(chuàng)傷時的照片，圖6b為用藥組的sd大鼠用藥4天后的照片，圖6c為用藥組的sd的大鼠用藥8天后的照片，圖6d為用藥組的sd大鼠用藥12天后的照片。從圖6a～圖6d可以看出用藥組的sd大鼠創(chuàng)傷面積逐漸縮小，說明成纖維細胞的細胞分泌液可有效治愈創(chuàng)傷。

實驗對照組：采用含慶大霉素的無菌生理鹽水涂覆在燙傷的sd大鼠上，慶大霉素的濃度為2萬單位/ml，每天3次，每次1ml。每隔四天對sd大鼠拍攝，計算傷口面積。圖7a為實驗對照組的大鼠創(chuàng)傷時的照片，圖7b為實驗對照組的sd大鼠用藥4天后的照片，圖7c為實驗對照組的sd大鼠用藥8天后的照片，圖7d為實驗對照組的sd大鼠用藥12天后的照片。從圖7a～圖7d可以看出實驗對照組的sd大鼠創(chuàng)傷面積逐漸縮小。

空白對照組：采用無菌生理鹽水涂覆在燙傷的sd大鼠上，每天3次，每次1ml。發(fā)現(xiàn)空白對照組的sd大鼠感染嚴重，創(chuàng)傷后死亡率高。

進一步對用藥組和實驗對照組的sd大鼠創(chuàng)面面積進行分析，所示。實驗中每隔兩天測量一次創(chuàng)面的大小。先使用透明紙覆蓋創(chuàng)面，然后用記號筆沿創(chuàng)面邊緣描繪，使用另一厚薄均勻的透明紙復制并剪取創(chuàng)面圖案，使用萬分之一的電子天平稱取圖案重量，以此轉(zhuǎn)換創(chuàng)傷愈合時的不規(guī)則面積。換算公式為：

創(chuàng)面面積＝(創(chuàng)面圖案重量/標準大小紙張重量)×標準面積

以創(chuàng)面面積為縱坐標，以時間為橫坐標，用藥組和實驗對照組的sd大鼠創(chuàng)面面積隨時間變化的結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出兩組的創(chuàng)傷面積隨時間變化組件減小，并且用藥組在用藥11天之后創(chuàng)傷面積明顯小于實驗對照組。說明該成纖維細胞的細胞分泌液可有效治愈創(chuàng)傷。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和 改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。