本發(fā)明涉及植物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及增強(qiáng)植物抗逆性的化合物及其制法和用途。

背景技術(shù)：

脫落酸(Abscisic Acid，ABA)是平衡植物內(nèi)源激素和有關(guān)生長活性物質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子，具有促進(jìn)植物平衡吸收水、肥和協(xié)調(diào)體內(nèi)代謝的能力，可有效調(diào)控植物的根/冠和營養(yǎng)生長與生殖生長，對(duì)提高農(nóng)作物的品質(zhì)、產(chǎn)量具有重要作用。通過施用ABA，在提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等許多方面有著重要的生理活性作用和應(yīng)用價(jià)值。此外，外源ABA能引起葉片氣孔的迅速關(guān)閉，抑制蒸騰作用，可用于花的保鮮，或在作物幼苗移植栽培的運(yùn)輸過程中防止萎蔫。ABA還能控制花芽分化，調(diào)節(jié)花期，在花卉園藝上有很大的應(yīng)用價(jià)值。

ABA可以改善作物在低溫、干旱、春寒、鹽漬等不良生長環(huán)境中的生長。因此，ABA具有廣泛應(yīng)用，可用于草坪、農(nóng)田、園林，尤其是可用于西部地區(qū)等缺水地區(qū)，對(duì)于發(fā)展中國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)具有重大意義。

然而，天然活性的(+)-ABA不穩(wěn)定且人工合成難度較大，生產(chǎn)成本很高。因此，ABA一直未被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，各國科學(xué)家都在開發(fā)天然ABA的替代物。

目前雖然已經(jīng)開發(fā)了一些ABA的替代物，然而這些替代物的活性尚不能令人滿意，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值低。此外，一些替代物的環(huán)境友好性較差。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)環(huán)境友好的且可有效提高植物抗逆性的化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)境友好的且可有效提高植物抗逆性的化合物及其制法和用途。

本發(fā)明第一方面提供了式I化合物、或其鹽、或其光學(xué)異構(gòu)體、或其外消旋體、或其溶劑化物、或其前體，

式中，

R₁為H、鹵素、C₁-C₃烷基、或C₁-C₃鹵代烷基；

R₂為H、鹵素、C₁-C₃烷基、或C₁-C₃鹵代烷基；

R₃為H、鹵素、C₁-C₃烷基、或C₁-C₃鹵代烷基；

R₄為H、鹵素、C₁-C₃烷基、或C₁-C₃鹵代烷基；

R₅為鹵素、C₁-C₃烷基、C₁-C₃鹵代烷基或SF₅；

R₆為H、C₁-C₃烷基、或C₁-C₃鹵代烷基；

R₇為C₁-C₇烷基、C₂-C₇鏈烯基、C₂-C₇鏈炔基、C₃-C₇環(huán)烷基、或-R₈-O-R₉,其中，R₈為C₁-C₂亞烷基而R₉為H、C₁-C₃烷基；

R₀為H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄鹵代烷基、或鹵素；

m為1或2；

表示單鍵或雙鍵；

附加條件是，R₁、R₂、R₃、R₄中有1-4個(gè)為鹵素。

在另一優(yōu)選例中，所述的化合物具有式Ia、Ib或Ic結(jié)構(gòu)：

或

式中，R₀，R₁-R₆，m的定義如上所述。

在另一優(yōu)選例中，R₁、R₂、R₃、R₄中有2-4個(gè)為鹵素。

在另一優(yōu)選例中，R₁、R₂、R₃、R₄中有3或4個(gè)為鹵素。

在另一優(yōu)選例中，R₁、R₂、R₃、R₄中有4個(gè)為鹵素。

在另一優(yōu)選例中，所述的鹵素包括F、Cl、Br或I。

在另一優(yōu)選例中，所述的鹵素包括F或Cl。

在另一優(yōu)選例中，所述的鹵素為F。

在另一優(yōu)選例中，R₁、R₂、R₃、R₄中有2-4個(gè)為F。

在另一優(yōu)選例中，R₁、R₂、R₃、R₄中有3或4個(gè)為F。

在另一優(yōu)選例中，R₁、R₂、R₃、R₄中有4個(gè)為F。

在另一優(yōu)選例中，R₁和/或R₃為F。

在另一優(yōu)選例中，R₂和/或R₄為F。

在另一優(yōu)選例中，R₅為甲基、Cl、三氟甲基、或SF₅。

在另一優(yōu)選例中，R₆為H。

在另一優(yōu)選例中，R₇為C₃烷基、或C₃鏈烯基。

在另一優(yōu)選例中，R₇為正丙基、或-CH₂-CH＝CH₂。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)m＝2時(shí)，R₀相同或不同。

在另一優(yōu)選例中，R₀為H、或甲基。

在另一優(yōu)選例中，所述的化合物選自下組：

本發(fā)明第二方面提供了第一方面所述的式I化合物、或其鹽、或其光學(xué)異構(gòu)體、或其外消旋體、或其溶劑化物、或其前體的用途，用于制備農(nóng)用制劑或組合物，所述農(nóng)用制劑或組合物用于(i)增強(qiáng)植物抗逆性；(ii)植物保鮮處理(如鮮花保鮮)；和/或(iii)果實(shí)著色處理(如葡萄著色)。

在另一優(yōu)選例中，所述農(nóng)用制劑或組合物用于一種或多種以下用途：

(i)促進(jìn)ABA受體PYL蛋白與PP2C蛋白磷酸酶的相互作用；

(ii)減弱葉片的蒸騰作用；

(iii)抑制種子萌發(fā)。

在另一優(yōu)選例中，所述抗逆性為ABA相關(guān)的非生物脅迫抗逆性。

在另一優(yōu)選例中，所述抗逆性選自下組：抗旱性、耐冷性、耐鹽堿、耐滲透壓、耐熱性、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述植物為含有PYR/PYL家族ABA受體的植物。

在另一優(yōu)選例中，所述植物包括苔蘚、蕨類、裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括農(nóng)業(yè)植物、園藝植物、林業(yè)植物。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括木本植物、草本植物。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括完整的植株、器官(如根、莖、葉、枝、花、果實(shí)、種子)、組織(如愈傷組織)、或細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物選自下組：禾本科、菊科、百合科、十字花科、薔薇科、豆科、茶科、梧桐科、松科、胡桃科、胡椒科、木蘭科、杜鵑花科、獼猴桃科、葡萄科、秋海棠科、鳳梨科、銀杏科、八角茴香科、姜科、石榴科、夾竹桃科、小檗科、蕓香科、茄科、柏科、冬青科、棕櫚科植物、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述植物選自下組：擬南芥、煙草、棉花、生菜、水稻、小麥、玉米、花生、高粱、燕麥、黑麥、甘蔗、大豆、馬鈴薯、蕎麥、胡椒、葡萄、梨、蘋果、香蕉、人參、番茄、辣椒、茄子、花椰菜、大白菜、油菜、黃瓜、西瓜、洋蔥、向日葵、百合、玫瑰、菊花、牡丹、康乃馨、樟樹、梧桐、松樹、或其組合。

本發(fā)明第三方面提供了一種農(nóng)用制劑，所述農(nóng)用制劑包括：

(i)本發(fā)明第一方面所述的式I化合物、或其鹽、或其光學(xué)異構(gòu)體、或其外消旋體、或其溶劑化物、或其前體；和

(ii)農(nóng)業(yè)上可接受的載體。

在另一優(yōu)選例中，組分(i)在農(nóng)用制劑中的含量為0.1-1000μM，較佳地，1-200μM，更佳地，5-100μM。

在另一優(yōu)選例中，所述農(nóng)用制劑中，含有0.0001-99wt％，較佳地0.1-90wt％的組分(i)，以農(nóng)用制劑的總重量計(jì)。

在另一優(yōu)選例中，所述農(nóng)用制劑還包括額外的抗旱劑(如抗旱種衣劑、抗旱保水劑、或抗旱噴灑劑)或其他農(nóng)用活性成分。

在另一優(yōu)選例中，所述的農(nóng)用活性成分選自下組：殺真菌劑、除草劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、殺昆蟲劑、植物激活劑、增效劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、殺螨劑。

在另一優(yōu)選例中，所述農(nóng)用制劑還包括表面活性劑(如陽離子型、陰離子型、兩性、或非離子型表面活性劑)。

在另一優(yōu)選例中，所述農(nóng)用制劑的劑型選自下組：溶液劑、乳劑、混懸劑、粉劑、泡沫劑、糊劑、顆粒劑、氣霧劑、或其組合。

本發(fā)明第四方面提供了一種增強(qiáng)植物抗逆性的方法，給所述植物施用本發(fā)明第一方面所述的式I化合物、或其鹽、或其光學(xué)異構(gòu)體、或其外消旋體、或其溶劑化物、或其前體或施用本發(fā)明第三方面所述的農(nóng)用制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述施用選自下組：噴灑或灌溉。

在另一優(yōu)選例中，所述施用的劑量為2-100g/公頃，較佳地，4-80g/公頃，更佳地，6-60g/公頃。

在另一優(yōu)選例中，所述施用的劑量為1-5000微克/株，較佳地，10-2500微克/株，更佳地，20-1000微克/株。

本發(fā)明第五方面提供了一種式I化合物或其鹽的制法，包括步驟：

(a)在惰性溶劑中，將式Ia-6化合物與式Ia-4化合物進(jìn)行反應(yīng)，從而形成式I化合物；

上述各式中，R₀、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、m和如上定義。

在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)在縛酸劑的存在下進(jìn)行。

在另一優(yōu)選例中，所述縛酸劑選自下組：碳酸鉀、三乙胺、吡啶或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述惰性溶劑選自下組：DMF、DCM、乙腈或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)溫度為0-150℃(或回流溫度)，較佳地，20-60℃，更佳地，25-40℃。

在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)時(shí)間為0.1-72小時(shí)，更佳地，1-24小時(shí)，更佳地，2-20小時(shí)。

本發(fā)明第六方面提供了一種植物保鮮處理方法，包括步驟：

將待保鮮的植物與本發(fā)明第一方面所述的式I化合物、或其鹽、或其光學(xué)異構(gòu)體、或其外消旋體、或其溶劑化物、或其前體進(jìn)行接觸，從而對(duì)植物保鮮。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括完整的植株、或植物器官(如根、莖、葉、枝、花、果實(shí))。

在另一優(yōu)選例中，所述的植物保鮮處理包括鮮花保鮮。

本發(fā)明第七方面提供了一種果實(shí)著色處理方法，包括步驟：

將待著色的果實(shí)與本發(fā)明第一方面所述的式I化合物、或其鹽、或其光學(xué)異構(gòu)體、或其外消旋體、或其溶劑化物、或其前體進(jìn)行接觸，從而對(duì)果實(shí)著色。

在另一優(yōu)選例中，所述的果實(shí)包括葡萄。

本發(fā)明第八方面提供了一種本發(fā)明第一方面所述的式I化合物、或其鹽、或其光學(xué)異構(gòu)體、或其外消旋體、或其溶劑化物、或其前體的用途，其特征在于，用于制備(i)ABA受體的激動(dòng)劑；和/或(ii)種子萌發(fā)抑制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的激動(dòng)劑促進(jìn)ABA受體PYL蛋白與PP2C蛋白磷酸酶的相互作用。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示本發(fā)明的兩種AMX化合物0604c和0918可以結(jié)合于擬南芥PYR/PYL受體(PYR1、PYL1、PYL2和PYL7)-HAB1復(fù)合物,進(jìn)而抑制蛋白磷酸酶HAB1的活性。在1μM濃度下，抑制效果均顯著優(yōu)于ABA。

圖2顯示了六種AMX化合物(0604c、0918、1125A、1125B、1127和1103B)以及ABA的擬南芥PYR/PYL受體激動(dòng)劑的劑量響應(yīng)曲線。AMX化合物可以促進(jìn)蛋白磷酸酶HAB1與四種擬南芥PYR/PYL受體(PYR1、PYL1、PYL2和PYL7)的相互作用，且該作用存在劑量依賴效應(yīng)。

圖3顯示三種AMX化合物(0925、1020A和1020B)和ABA的PYR/PYL受體激動(dòng)劑的劑量響應(yīng)曲線。AMX化合物可促進(jìn)蛋白磷酸酶HAB1與三種PYR/PYL受體(PYR1、PYL1和PYL2)的相互作用，且該相互作用存在劑量依賴效應(yīng)。

圖4a至4i分別顯示ABA(a)、現(xiàn)有ABA類似物(b)或本發(fā)明多個(gè)AMX化合物(c至i)與PYL2-HAB1復(fù)合體口袋結(jié)構(gòu)內(nèi)多個(gè)氨基酸殘基相互作用的二維結(jié)構(gòu)。圖中顯示了水分子、氮原子、氧原子和鹵素原子，虛線代表氫鍵，其上的數(shù)字則表示兩個(gè)原子/分子之間的距離(單位是埃，)。結(jié)果顯示，與現(xiàn)有的ABA或其類似物相比，本發(fā)明的AMX化合物與PYL2口袋結(jié)構(gòu)內(nèi)的氨基酸殘基形成更多氫鍵，這使得AMX與PYL2-HAB1復(fù)合體的結(jié)合更加緊密。

圖5顯示用本發(fā)明不同AMX化合物處理6小時(shí)后，野生型擬南芥體內(nèi)受ABA誘導(dǎo)的脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。DMSO和ABA處理分別為陰性和陽性對(duì)照組。

圖6顯示1μM濃度下，不同AMX化合物和ABA對(duì)于Col-0和pyr1；pyl1；pyl4三突變體種子萌發(fā)的影響。每個(gè)培養(yǎng)皿的左半邊播種Col-0，右半邊播種pyr1；pyl1；pyl4三突變體。照片為pyr1；pyl1；pyl4三突變體種子萌發(fā)4天后(播種6天后)拍攝。DMSO處理為對(duì)照組。

圖7a和7b顯示本發(fā)明AMX化合物處理顯著降低了擬南芥葉面的蒸騰速率，導(dǎo)致葉面溫度升高。

圖7a顯示了5μM AMX化合物和ABA處理后，葉面溫度較DMSO處理顯著增加。其中0918和1127在處理四天后仍能顯著抑制葉面蒸騰作用。

圖7b顯示了AMX化合物對(duì)于葉面蒸騰作用的抑制效應(yīng)存在濃度依賴效應(yīng)，相同濃度下抑制效果排序?yàn)?127>0918>1125A。

圖8顯示土壤干旱實(shí)驗(yàn)結(jié)果。短日照環(huán)境中生長3周的野生型擬南芥植物(Col-0)停止?jié)菜娛┫鄳?yīng)濃度的化合物。DMSO作為負(fù)對(duì)照。其中，圖8a顯示了首次噴施化合物當(dāng)天和17天后的植物生長狀況，實(shí)驗(yàn)中使用的化合物濃度為10μM；圖8b顯示了首次噴施化合物當(dāng)天，18和20天后的植物生長狀況，實(shí)驗(yàn)中使用的化合物濃度為5μM；圖8c顯示了首次噴施化合物當(dāng)天和14天后的植物生長狀況，實(shí)驗(yàn)中使用的化合物濃度為10μM。

圖9顯示三種AMX化合物(0604c,0918和1127)以及ABA的大豆PYR/PYL受體激動(dòng)劑劑量響應(yīng)曲線。AMX化合物可以促進(jìn)擬南芥蛋白磷酸酶HAB1與二種大豆PYR/PYL受體(GmPYL3和GmPYL6)的相互作用，且該相互作用存在劑量依賴效應(yīng)。

圖10顯示了50μM AMX化合物1127處理3天后仍能顯著降低擬南芥葉面的蒸騰速率，導(dǎo)致葉面溫度升高。

圖11顯示了大豆和玉米的土壤干旱實(shí)驗(yàn)結(jié)果。大豆實(shí)驗(yàn)中，選取生長一致的大豆植株，在干旱一周后復(fù)水，照片顯示了復(fù)水一個(gè)月后的整體生長狀況。實(shí)驗(yàn)中各測(cè)試化合物濃度為50μM。玉米實(shí)驗(yàn)方法同大豆實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中化合物0918濃度為50μM。復(fù)水后經(jīng)AMX處理的大豆和玉米的存活率均要顯著高于對(duì)照組。

圖12顯示了AMX化合物1127的水懸浮劑處理后的葡萄果皮花色苷含量顯著高于清水對(duì)照組?；ㄉ蘸颗c葡萄果皮上色成正相關(guān)。

圖13顯示了本發(fā)明化合物0720B可以結(jié)合于擬南芥PYR/PYL受體(PYR1、PYL1、PYL2和PYL7)-HAB1復(fù)合物，進(jìn)而抑制蛋白磷酸酶HAB1的活性。在1μM濃度下，抑制效果均顯著優(yōu)于ABA。

圖14顯示了本發(fā)明化合物0720B和ABA的擬南芥PYR/PYL受體激動(dòng)劑的劑量響應(yīng)曲線。0720B化合物可以促進(jìn)蛋白磷酸酶HAB1與兩種擬南芥PYR/PYL受體(PYR1和PYL2)的相互作用，且該作用存在劑量依賴效應(yīng)。

圖15顯示了AMX化合物(0720B)處理顯著降低了大豆葉面的蒸騰速率，導(dǎo)致葉面溫度升高。播種16天后的大豆植株停止?jié)菜?，同時(shí)噴施相應(yīng)化合物，與對(duì)照組(DMSO)相比，噴施10/20/50μM的化合物0720B可顯著降低大豆葉面的蒸騰速率，且抑制效果優(yōu)于噴施50μM ABA。

圖16顯示了AMX化合物(0720B)處理顯著降低了棉花葉面的蒸騰速率，導(dǎo)致葉面溫度升高。播種23天后的棉花植株停止?jié)菜?，同時(shí)噴施50μM的化合物0720B，與對(duì)照組(DMSO)相比，50μM的化合物0720B均可顯著降低棉花葉面的蒸騰速率，且抑制效果優(yōu)于50μM ABA。

圖17顯示了大豆的土壤干旱實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖15中的大豆在干旱11天后復(fù)水，照片顯示了復(fù)水一天后的大豆生長狀況。經(jīng)10/20/50μM的化合物0720B處理的大豆長勢(shì)要顯著優(yōu)于對(duì)照組(DMSO)或50μM ABA處理的大豆。

圖18顯示了棉花的土壤干旱實(shí)驗(yàn)結(jié)果。照片顯示了圖16中的棉花在干旱10天后的生長狀況。經(jīng)50μM化合物0720B處理的棉花長勢(shì)要顯著優(yōu)于對(duì)照組(DMSO)或50μM ABA處理的棉花。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次開發(fā)了一類具有高脫落酸(ABA)活性的ABA替代物(本發(fā)明化合物)。本發(fā)明化合物具有明顯高于現(xiàn)有ABA類似物的活性，能夠顯著增強(qiáng)植物的多種抗逆性(如抗旱、耐冷等)。此外，本發(fā)明化合物制法簡便，且具有優(yōu)異的環(huán)境友好性和作用迅速等優(yōu)點(diǎn)，因此，具有廣泛的應(yīng)用前景。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明化合物(簡稱為AMX化合物)不僅活性優(yōu)于脫落酸(Abscisic Acid，ABA)以及現(xiàn)有的ABA類似物(如4-甲基-氮-(1,2,3,4-四氫-2-羰基-1-丙基-6-喹啉基)-苯甲基磺酰胺(4-methyl-N-(1,2,3,4-tetrahydro-2-oxo-1-propyl-6-quinolinyl)-benzene methanesulfonamide))，而且可結(jié)合于多個(gè)不同PYL受體，可顯著增強(qiáng)各種不同植物的抗逆性。

基團(tuán)定義

如本文所用，術(shù)語“C₁-C₇烷基”是指具有1-7個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₂-C₇鏈烯基”指具有2-7個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烯基，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₂-C₇鏈炔基”是指具有2-7個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的炔基，例如乙炔基、丙炔基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₁-C₃烷基”是指具有1-3個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₁-C₃鹵代烷基”是指氫被1個(gè)或1個(gè)以上的鹵素取代的具有1-3個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如，鹵代甲基、鹵代乙基、鹵代丙基、鹵代異丙基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₃-C₇環(huán)烷基”指具有3-7個(gè)碳原子的環(huán)狀烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴、或碘，優(yōu)選氟和氯。

如本文所用，術(shù)語“鹵代的”指被相同或不同的一個(gè)或多個(gè)上述鹵原子取代的基團(tuán)，可以部分鹵代或全部鹵代，例如三氟甲基、五氟乙基、七氟異丙基、或類似基團(tuán)。

本發(fā)明的化合物可以含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心，并因此以消旋體、外消旋混合物、單一對(duì)映體、非對(duì)映異構(gòu)體化合物和單一非對(duì)映體的形式出現(xiàn)?？梢源嬖诘牟粚?duì)稱中心，取決于分子上各種取代基的性質(zhì)。每個(gè)這種不對(duì)稱中心將獨(dú)立地產(chǎn)生兩個(gè)旋光異構(gòu)體，并且所有可能的旋光異構(gòu)體和非對(duì)映體混合物和純或部分純的化合物包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明包括化合物的所有異構(gòu)形式。

式I化合物及其制備方法

如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明化合物”、“AMX化合物”、"化合物AMX"、“本發(fā)明ABA替代物”、“式I化合物”可互換使用，均指具有式I所示結(jié)構(gòu)的化合物。此外，所述術(shù)語還包括式I化合物的鹽、光學(xué)異構(gòu)體、外消旋體、溶劑化物(如水合物)、和/或前體，

其中，R₀、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、m、的定義如前所述。

下面更具體地描述本發(fā)明式I化合物的制備方法，但這些具體方法不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。本發(fā)明化合物還可以任選將在本說明書中描述的或本領(lǐng)域已知的各種合成方法組合起來而方便的制得，這樣的組合可由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員容易的進(jìn)行。通常，在本發(fā)明的制備方法中，各反應(yīng)大多在惰性溶劑中，在0℃至150℃(或回流溫度)(較佳地，20-60℃，或25－40℃)下，反應(yīng)一段時(shí)間(如0.1-72小時(shí)，較佳地2－20小時(shí))。

較佳地，本發(fā)明式I化合物可以通過以下方案及實(shí)施例中所述的示例性方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所用的相關(guān)公開文獻(xiàn)操作完成。

典型地，本發(fā)明的式Ia和/或Ib化合物的制備方法可包括(但不限于)如下流程。

方案I(以R₆＝H且R₇＝丙基為例)

(1)制備6-氨基-1-丙基-喹啉酮

步驟1：在堿(如碳酸鉀，氫化鈉)存在下，在惰性溶劑(如DMF)中，首先將式Ia-1化合物與鹵代烷在一定溫度(如25-40℃)下進(jìn)行反應(yīng)一段時(shí)間，形成式Ia-2化合物。

步驟2：在酸(如硫酸)存在下，式Ia-2化合物與硝酸鉀在一定溫度(如0-20℃)下進(jìn)行反應(yīng)一段時(shí)間，形成式Ia-3化合物。

步驟3：在惰性溶劑(如甲醇)中，以鈀碳作催化劑，在一定溫度(如10-40℃)下，將式Ia-3化合物進(jìn)行還原反應(yīng)，形成式Ia-4化合物。

(2)制備對(duì)甲基鹵代芐磺酰氯

步驟4：在惰性溶劑(如乙醇、乙腈)中，式Ia-5化合物(如對(duì)甲基芐溴或?qū)谆S氯)與硫脲反應(yīng)，形成反應(yīng)產(chǎn)物。然后，在酸(如濃鹽酸)存在下，在惰性溶劑(如乙腈)中，將所述反應(yīng)產(chǎn)物和亞氯酸鈉在一定溫度(如0-20℃)下進(jìn)行反應(yīng)一段時(shí)間，形成式Ia-6化合物。

(3)制備式Ia/Ib化合物

步驟5：在惰性溶劑(如DMF)中，在縛酸劑(如碳酸鉀)存在下，式Ia-6化合物與式Ia-4化合物在一定溫度(如25-40℃)下進(jìn)行反應(yīng)一段時(shí)間，從而得到式Ia/Ib化合物。

方案I中，X₂為離去基團(tuán)，為氯、溴、碘。其它各取代基和基團(tuán)如說明書中所定義。表示單鍵或雙鍵。

本發(fā)明的式Ic化合物的制備方法可包括(但不限于)如下流程：

方案II(以m＝1，R₆為H，R₇＝丙基且R₀為甲基為例)

(1)制備6-氨基-4-甲基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮

步驟1：在催化劑(如鈀碳，二氧化鉑)存在下，在惰性溶劑(如乙酸，乙酸乙酯)中，在一定溫度下(如50-80℃)下Ia-7進(jìn)行氫化反應(yīng)一段時(shí)間，形成式Ia-8化合物。

步驟2：在堿(如碳酸鉀，氫化鈉)存在下，在惰性溶劑(如DMF)中，首先將式Ia-8化合物與鹵代烷在一定溫度(如25-40℃)下進(jìn)行反應(yīng)一段時(shí)間，形成式Ia-9化合物。

步驟3：在酸(如硫酸)存在下，將式Ia-9化合物與硝酸鉀在一定溫度(如0-20℃)下進(jìn)行反應(yīng)一段時(shí)間，形成式Ia-10化合物。

步驟4：在惰性溶劑(如甲醇)中，以鈀碳作催化劑，在一定溫度(如10-40℃)下，將式Ia-10化合物進(jìn)行還原反應(yīng)，形成式Ia-11化合物。

(2)制備對(duì)甲基鹵代芐磺酰氯

步驟5：在惰性溶劑(如乙醇、乙腈)中，式Ia-5化合物(如對(duì)甲基芐溴或?qū)谆S氯)與硫脲反應(yīng)，形成反應(yīng)產(chǎn)物。然后，在酸(如濃鹽酸)存在下，在惰性溶劑(如乙腈)中，將所述反應(yīng)產(chǎn)物和亞氯酸鈉在一定溫度(如0-20℃)下進(jìn)行反應(yīng)一段時(shí)間，形成式Ia-6化合物。

(3)制備式Ic化合物

步驟6：在惰性溶劑(如DMF)中，在縛酸劑(如碳酸鉀)存在下，式Ia-6化合物與式Ia-11化合物在一定溫度(如25-40℃)下進(jìn)行反應(yīng)一段時(shí)間，從而得到式Ic化合物。

方案II中，X₂為離去基團(tuán)，為氯、溴、碘。其它各取代基和基團(tuán)如說明書中所定義。

農(nóng)用制劑

可將本發(fā)明的活性物質(zhì)(式I化合物、或其鹽、或其光學(xué)異構(gòu)體、或其外消旋體、或其溶劑化物、或其前體)以常規(guī)的方法制備成農(nóng)用制劑，例如溶液劑、乳劑、混懸劑、粉劑、泡沫劑、糊劑、顆粒劑、氣霧劑、用活性物質(zhì)浸漬的天然的和合成的材料、在多聚物中的微膠囊、用于種子的包衣劑。

這些制劑可用已知的方法生產(chǎn)，例如，將活性化合物與擴(kuò)充劑混合，這些擴(kuò)充劑就是液體的或液化氣的或固體的稀釋劑或載體，并可任意選用表面活性劑即乳化劑和/或分散劑和/或泡沫形成劑。例如在用水作擴(kuò)充劑時(shí)，有機(jī)溶劑也可用作助劑。

用液體溶劑作稀釋劑或載體時(shí)，基本上是合適的，如：芳香烴類，例如二甲苯，甲苯或烷基萘；氯化的芳香或氯化的脂肪烴類，例如氯苯，氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烴類，例如環(huán)己烷或石蠟，例如礦物油餾分；醇類，例如乙醇或乙二醇以及它們的醚和脂類；酮類，例如丙酮，甲乙酮，甲基異丁基酮或環(huán)已酮；或不常用的極性溶劑，例如二甲基甲酰胺和二甲基亞砜，以及水。

就液化氣的稀釋劑或載體說，指的是在常溫常壓下將成為氣體的液體，例如氣溶膠推進(jìn)劑，如鹵化的烴類以及丁烷，丙烷，氮?dú)夂投趸肌?/p>

固體載體可用研磨的天然礦物質(zhì)，例如高嶺土，粘土，滑石，石英，活性白土，蒙脫土，或硅藻土，和研磨合成的礦物質(zhì)，例如高度分散的硅酸，氧化鋁和硅酸鹽。供顆粒用的固體載體是碾碎的和分級(jí)的天然鋯石，例如方解石，大理石，浮石，海泡石和白云石，以及無機(jī)和有機(jī)粗粉合成的顆粒，和有機(jī)材料例如鋸木屑，椰子殼，玉米棒子和煙草梗的顆粒等。

非離子的和陰離子的乳化列可用作乳化劑和/或泡沫形成劑。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯類，聚氧乙烯-脂肪醇醚類，例如烷芳基聚乙二醇醚類，烷基磺酸酯類，烷基硫酸酯類，芳基磺酸酯類以及白蛋白水解產(chǎn)物。分散劑包括，例如木質(zhì)素亞硫酸鹽廢液和甲基纖維素。

在制劑中可以用粘合劑，例如羧甲基纖維素和以粉末，顆?；蛉橐盒问降奶烊缓秃铣傻亩嗑畚铮绨⒗z，聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。

可以用著色劑例如無機(jī)染料，如氧化鐵，氧化鉆和普魯士藍(lán)；有機(jī)染料，如有機(jī)染料，如偶氮染料或金屬鈦菁染料；和用痕量營養(yǎng)劑，如鐵，猛，硼，銅，鈷，鋁和鋅的鹽等。

在本發(fā)明中，所述“農(nóng)用制劑”通常是農(nóng)用植物生長調(diào)節(jié)劑，其含有式I化合物或其鹽、其光學(xué)異構(gòu)體、外消旋體、溶劑化物或前體作為增強(qiáng)植物抗逆性(如抗旱性)的活性成分；以及農(nóng)業(yè)上可接受的載體。

如本文所用，所述“農(nóng)業(yè)上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的式I化合物或其鹽、光學(xué)異構(gòu)體、外消旋體、溶劑化物或前體傳送給植物的農(nóng)藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。適用于本發(fā)明的農(nóng)業(yè)上可接受的載體選自下組：水、緩沖液、DMSO、表面活性劑如Tween-20、或其組合。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的農(nóng)業(yè)上可接受的載體均可用于本發(fā)明中。

本發(fā)明的農(nóng)用制劑可與其他抗旱劑制成一種混合物存在于它們的商品制劑中或從這些制劑制備的使用劑型中，這些其他的抗旱劑包括(并不限于)：抗旱種衣劑、抗旱保水劑、或抗旱噴灑劑等。

此外，本發(fā)明的農(nóng)用制劑也可與增效劑制成一種混合物存在于它們的商品制劑中或從這些制劑制備的使用劑型中，這些增效劑是提高活性化合物作用的化合物，由于活性化合物本身有活性，也可不必加增效劑。

本發(fā)明所述的農(nóng)用制劑的劑型可以是多種多樣的，只要能夠使活性成分有效地到達(dá)植物體內(nèi)的劑型都是可以的，從易于制備和施用的立場看，優(yōu)選的農(nóng)用制劑是一種噴霧劑或溶液制劑。

本發(fā)明所述的農(nóng)用制劑通常含有占所述農(nóng)用制劑總重量的0.0001-99wt％，較佳地0.1-90wt％的本發(fā)明化合物。商品制劑或使用劑型中的本發(fā)明化合物的濃度可在廣闊的范圍內(nèi)變動(dòng)。商品制劑或使用劑型中的本發(fā)明化合物的濃度可從0.0000001-100％(g/v)，最好在0.0001與1％(g/v)之間。

增強(qiáng)植物抗逆性的方法

本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)植物抗逆性(如抗旱性)的方法，包括步驟：給植物施用式I化合物或其鹽、其光學(xué)異構(gòu)體、外消旋體、溶劑化物或前體、或其相應(yīng)的的農(nóng)用制劑。

施用可采用已知的各種方法，例如，通過在植物葉片、繁殖材料上噴灑、噴霧、噴粉或播撒該化合物或含有該化合物的農(nóng)用制劑，或以其他方式使植物接觸該化合物或含有該化合物的農(nóng)用制劑，如果是種子，則通過涂布、包裹或以其他方式處理種子。另一種在種植前直接處理植物或種子的方法，還可將本發(fā)明的農(nóng)用制劑引入土壤或其他待播種種子的培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，還可以使用載體，所述載體可以是如上所述的固態(tài)、液態(tài)。

在一優(yōu)選實(shí)施方式中，還可以通過噴灑(如飛機(jī)噴灑)或灌溉將該化合物或含有該化合物的農(nóng)用制劑遞送給所述植物。

其他應(yīng)用

本發(fā)明的化合物可以用作植物保鮮劑，所述植物包括(但不限于)：鮮花、園藝植物等，尤其對(duì)鮮花(如非洲菊)有著非常顯著的保鮮效果。

本發(fā)明的化合物還可以用作果實(shí)著色劑，其中，所述果實(shí)包括(但不限于)葡萄。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

首次開發(fā)了一類具有高脫落酸(ABA)活性的ABA替代物(本發(fā)明化合物)。本發(fā)明化合物具有明顯高于現(xiàn)有ABA類似物的活性，能夠顯著增強(qiáng)植物的多種抗逆性(如抗旱、耐冷等)。此外，本發(fā)明化合物制法簡便，且具有優(yōu)異的環(huán)境友好性，因此，具有廣泛的應(yīng)用前景。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明化合物(簡稱為AMX化合物)不僅活性優(yōu)于脫落酸(Abscisic Acid，ABA)以及現(xiàn)有的ABA類似物(如4-甲基-氮-(1,2,3,4-四氫-2-羰基-1-丙基-6-喹啉基)-苯甲基磺酰胺(4-methyl-N-(1,2,3,4-tetrahydro-2-oxo-1-propyl-6-quinolinyl)-benzene methanesulfonamide))，而且可結(jié)合于多個(gè)不同PYL受體，可顯著增強(qiáng)各種不同植物的抗逆性。

(1)本發(fā)明首次合成了天然脫落酸(Abscisic Acid，ABA)的高活性的替代物AMX化合物。本發(fā)明的AMX化合物能夠顯著增強(qiáng)植物多種抗逆性(如抗旱、耐冷)。并且，光學(xué)異構(gòu)體或外消旋體的本發(fā)明化合物均具有高活性。

(2)本發(fā)明的AMX化合物的活性顯著優(yōu)于脫落酸(Abscisic Acid，ABA)以及現(xiàn)有的ABA類似物。

(3)本發(fā)明化合物AMX對(duì)于多個(gè)PYR/PYL受體蛋白與PP2C蛋白磷酸酶HAB1的相互作用均有促進(jìn)作用，且對(duì)PYR1、PYL1、PYL2、PYL7的促進(jìn)作用尤為顯著。

(4)本發(fā)明化合物更容易被植物吸收，且作用迅速。

(5)本發(fā)明化合物對(duì)環(huán)境友好，對(duì)哺乳動(dòng)物無害。

(6)本發(fā)明化合物的合成方法簡單、成本低廉。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

材料和通用方法

材料

實(shí)驗(yàn)中使用的模式植物均為常規(guī)的或市售的品種，其中擬南芥(Arabidopsis thaliana)包括：哥倫比亞(Col-0)生態(tài)型和基于Col-0生態(tài)型的ABA合成突變體aba2-1和ABA受體PYL三突變體pyr1；pyl1；pyl4；大豆品種為Williams 82，棉花品種為陸地棉R15，玉米品種為丹玉402。

化合物AM1：現(xiàn)有的ABA類似物，化學(xué)名稱為4-甲基-氮-(1,2,3,4-四氫-2-羰基-1-丙基-6-喹啉基)-苯甲基磺酰胺(4-methyl-N-(1,2,3,4-tetrahydro-2-oxo-1-propyl-6-quinolinyl)-benzene methanesulfonamide)。

AMX化合物：本發(fā)明所述的各化合物(如0604c等)見實(shí)施例1-17。

植物生長

擬南芥生長溫度為22℃，生長在植物生長培養(yǎng)基上的植物(如種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)和基因表達(dá)分析)的光周期為長日照(24小時(shí)光照)，生長在土壤中的植物(如葉面蒸騰實(shí)驗(yàn)和土壤干旱實(shí)驗(yàn))的光周期為短日照(8小時(shí)光照/16小時(shí)黑暗)，光強(qiáng)為75μmol·m^–2·s^–1。

大豆生長溫度為26℃，光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。玉米的生長溫度為27℃，光周期為11小時(shí)光照/13小時(shí)黑暗_；棉花生長溫度為26℃，光周期為14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗，光強(qiáng)均為400μmol·m^-2·s^-1。

如無特殊指明，實(shí)驗(yàn)中使用的植物生長培養(yǎng)基均為含1％(w/v)蔗糖和0.6％(w/v)瓊脂的1/2MS(Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基。

蛋白表達(dá)純化

帶6×His和SUMO雙標(biāo)簽序列的擬南芥基因PYL1(氨基酸序列36-211)，PYL2(氨基酸序列14-188)和帶Biotin標(biāo)簽序列的擬南芥基因HAB1(氨基酸序列172-511)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法詳見“A gate-latch-lock mechanism for hormone signalling by abscisic acid receptors”(Nature,Vol 462,2009)，帶6×His和SUMO雙標(biāo)簽序列的其他擬南芥PYL基因，包括PYR1，PYL3，PYL4，PYL5，PYL6，PYL7，PYL8，PYL9和PYL10(以上9個(gè)基因均為全基因編碼序列)，以及大豆PYL基因(包括GmPYL3和GmPYL6)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法與PYL1/PYL2相同。

將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌BL21(DE3)，接種到含有Amp抗性的200ml LB液體培養(yǎng)基，37℃200rpm培養(yǎng)過夜；按1:50-1:100接種至2L含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃200rpm培養(yǎng)3-4小時(shí)，16℃低溫培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.8-1.0左右。帶6×His和SUMO雙標(biāo)簽序列的PYR1/PYL1/PYL2/PYL7的重組質(zhì)粒用100μM IPTG誘導(dǎo)過夜，而帶Biotin標(biāo)簽序列的HAB1重組質(zhì)粒要用100μM IPTG和40μM biotin同時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。

將誘導(dǎo)16小時(shí)后的菌液在低速大容量離心機(jī)中離心收集菌體，4℃以4000rpm轉(zhuǎn)速離心20min。每2L菌液用50ml提取緩沖液(含20mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl和10％(v/v)甘油)重懸菌體，然后在4℃進(jìn)行1000Pa壓力破碎3-5次。破碎后的細(xì)胞進(jìn)行超速離心，16000rpm離心30min，重復(fù)2次，收集上清液過親和層析柱。

對(duì)于帶6×His和SUMO雙標(biāo)簽序列的PYR/PYL蛋白，選擇50ml親和層析Ni柱(50ml Ni-NTA column，購自GE公司)；先用10％緩沖液B(含20mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，500mM imidazole和10％甘油)平衡600ml，再用200ml 50％緩沖液B洗脫，最后用100ml100％緩沖液B洗脫；用于晶體解析的蛋白與ulp1酶以1000：1的摩爾比混合進(jìn)行酶切透析過夜；酶切后的蛋白再過一次親和層析Ni柱；收集液用洗脫溶液(含25mM Tris，pH 8.0，200mM ammonium acetate，1mM dithiotreitol和1mM EDTA)過HiLoad 26/60Superdex200凝膠過濾柱(購自GE公司)進(jìn)一步分離純化蛋白。

對(duì)于帶Biotin標(biāo)簽序列的HAB1蛋白，過50ml MBP親和層析柱(購自GE公司)；先用10％緩沖液C(含20mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，10mM Maltose和10％甘油)平衡600ml，再用200ml 50％緩沖液C洗脫，最后用100ml 100％緩沖液C洗脫；收集液用洗脫溶液(含20mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl和10％甘油)過HiLoad 26/60Superdex200凝膠過濾柱進(jìn)一步分離純化蛋白。

蛋白晶體解析

結(jié)晶前，將酶切后的PYL2和HAB1蛋白與化合物按1:1:5的摩爾比混合，濃縮到6mg/ml用于點(diǎn)晶體。采用懸滴法進(jìn)行點(diǎn)晶體；用于結(jié)晶的孔緩沖液(well buffer)包含0.1M Succinic acid和15％PEG3350、或0.2M丙二酸二鈉(Di-sodium malonate)和20％PEG 3350、或0.2M檸檬酸三鈉(Tri-sodium Citrate)和20％PEG 3350、或0.2M甲酸鎂(Magnesium formate)和20％PEG 3350。一天后可看到晶體出現(xiàn)，約3-4天可長到100-120μm。晶體用X射線衍射并收集衍射數(shù)據(jù)，再根據(jù)相關(guān)PYR/PYL受體結(jié)構(gòu)模型來解析復(fù)合物結(jié)構(gòu)。

AlphaScreen實(shí)驗(yàn)

采用AlphaScreen試劑盒(購自Perkin Elmer)，方法如下：150μl實(shí)驗(yàn)體系中含1:10稀釋的10×buffer(50mM MOPS，pH 7.4，50mM NaF，50mM CHAPS，0.1mg/ml bovine serum albumin)，各100nM帶Biotin標(biāo)簽序列的HAB1和帶6×His和SUMO雙標(biāo)簽序列的PYR1/PYL1/PYL2/PYL7/GmPYL3/GmPYL6蛋白，相應(yīng)濃度的(+)-ABA/AM1/AMX，5ug/ml供體珠(donor beads)和受體珠(acceptor beads)(購自Perkin Elmer)，室溫下避光孵育1.5小時(shí)后，置于Envision Plate Reader(購自Perkin Elmer)中按設(shè)定的AlphaScreen程序進(jìn)行讀數(shù)。

HAB1磷酸酶活性檢測(cè)

反應(yīng)體系中含50mM咪唑，pH 7.2，5mM MgCl₂，0.1％β-巰基乙醇，0.5μg·ml^-1BSA，100nM帶Biotin標(biāo)簽序列的HAB1蛋白，500nM帶6×His-SUMO雙標(biāo)簽序列的PYL受體蛋白及相應(yīng)濃度的(+)-ABA/AM1/AMX，室溫孵育30分鐘，隨后加入含11個(gè)氨基酸的磷酸化多肽作為底物繼續(xù)反應(yīng)30分鐘，該磷酸化多肽為SnRK2.6蛋白激酶的170-180位氨基酸(序列HSQPKpSTVGTP)，購自金斯瑞，其中175位的磷酸化絲氨酸，為已知的HAB1脫磷酸化靶位點(diǎn)。30分鐘后加入顯色試劑(購自BioVision)，用酶標(biāo)儀(購自Molecular Device)讀取650nm波長的吸收值。

基因表達(dá)分析

取全植株或葉子，用常規(guī)方法進(jìn)行RNA抽提、經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR。每種處理取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)并進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，ACT7基因被用作內(nèi)參。

種子萌發(fā)和土壤干旱實(shí)驗(yàn)

(1)種子萌發(fā)

擬南芥Col-0生態(tài)型和PYL受體三缺失突變體(pyr1；pyl1；pyl4)的種子用NaClO消毒后置于4℃春化3天，然后播種在含1μM(+)-ABA/AM1/0604c/0918/1127等多種AMX化合物或0.05％DMSO(對(duì)照)的1/2MS固體培養(yǎng)基上。每個(gè)6cm直徑的培養(yǎng)基上同時(shí)播種兩個(gè)株系，每個(gè)株系播種15粒種子，每種化合物設(shè)4個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)基置于22℃長日照培養(yǎng)，5天后拍照。

(2)植物葉面蒸騰實(shí)驗(yàn)

擬南芥葉面蒸騰實(shí)驗(yàn)使用ABA合成突變體aba2-1。在環(huán)境脅迫條件下，該突變體中的內(nèi)源ABA含量并不增加，僅為同樣條件下野生型擬南芥Col-0中的1/40，因此使用該突變體可以排除內(nèi)源ABA對(duì)于蒸騰實(shí)驗(yàn)的影響。持續(xù)澆水三周后的植物一次性噴施含0.05％tween-20和相應(yīng)濃度的DMSO(對(duì)照)/(+)-ABA/0918/1127化合物，使用量為1.2ml/盆，噴施前和噴施后每天在相同時(shí)間段使用FLIR A655sc紅外熱像儀成像。用于0604c，0918和1127的大豆葉面蒸騰實(shí)驗(yàn)使用Williams 82生態(tài)型在26℃長日照培養(yǎng)，3組3葉后一次性噴施，含0.05％tween-20和50μM的DMSO(對(duì)照)/(+)-ABA/0604c/0918/1127化合物，使用量為4ml/盆，噴施前和噴施后每天在相同時(shí)間段使用FLIR A655sc紅外熱像儀成像。

用于0720B實(shí)驗(yàn)的大豆和棉花葉面蒸騰實(shí)驗(yàn)在26℃長日照進(jìn)行，分別在播種16天和23天后噴施含0.1％tween-20和相應(yīng)濃度的(+)-ABA/0720B化合物或0.1％Tween-20和0.05％DMSO(對(duì)照)的溶液，使用量為4ml/盆，噴施前和噴施后每天在相同時(shí)間段使用FLIR A655sc紅外熱像儀成像。

(3)土壤干旱實(shí)驗(yàn)

擬南芥Col-0生態(tài)型種子用NaClO消毒后置于4℃春化3天后播種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，生長6天后選取長勢(shì)良好且大小一致的幼苗移入裝滿土的8×7×6cm³的花盆中。每個(gè)花盆裝有相同重量的土并移入相同數(shù)目的植物(六株)以減少實(shí)驗(yàn)誤差，所有的花盆均置于22℃短日照培養(yǎng)，兩周后停止?jié)菜M(jìn)行干旱處理，期間每周向葉面噴灑一次含0.02％tween-20和相應(yīng)濃度的(+)-ABA/AM1/0604c/0918/1127或0.02％tween-20和0.05％DMSO(對(duì)照)的溶液，噴施量為2ml溶液/盆，干旱過程中每天變換花盆位置以減少環(huán)境因素引起的誤差，整個(gè)干旱期間總計(jì)噴施兩次溶液，定期拍照記錄。約三周后恢復(fù)澆水。

用于0918和1127的大豆和玉米的土壤干旱實(shí)驗(yàn)與擬南芥類似，每盆只包含一株植物，所有的大豆植株均在26℃長日照培養(yǎng)，3組3葉后停止?jié)菜x擇長勢(shì)一致的植株進(jìn)行干旱處理，玉米則在小喇叭口期停止?jié)菜M(jìn)行干旱處理。干旱處理期間每三天向葉面噴灑一次含0.05％tween-20和50μM(+)-ABA/0918/1127或0.05％tween-20和0.05％DMSO(對(duì)照)的溶液，噴施量為4ml/盆，同時(shí)變換花盆位置。一周后恢復(fù)澆水。

用于進(jìn)行0720B相關(guān)葉面蒸騰實(shí)驗(yàn)的大豆和棉花同時(shí)用于土壤干旱實(shí)驗(yàn)，每個(gè)花盆只包含一株植物并裝有相同重量的土以減少實(shí)驗(yàn)誤差。所有的大豆植株均在26℃長日照培養(yǎng)，播種16天后停止?jié)菜x擇長勢(shì)一致的植株進(jìn)行干旱處理。干旱開始時(shí)向葉面噴施一次含0.1％Tween-20和相應(yīng)濃度的(+)-ABA/0720B或0.1％Tween-20和0.05％DMSO(對(duì)照)的溶液，此后每3天噴施一次，噴施量為4ml/盆，同時(shí)變換花盆位置，干旱11天后復(fù)水并在復(fù)水一天后拍照。棉花干旱實(shí)驗(yàn)與大豆類似，播種23天后停止?jié)菜?，選擇長勢(shì)一致的植株進(jìn)行干旱處理。干旱開始時(shí)向葉面噴施一次含0.1％Tween-20和50μM(+)-ABA/0720B或0.1％Tween-20和0.05％DMSO(對(duì)照)的溶液，此后每4天噴施一次，噴施量為4ml/盆，同時(shí)變換花盆位置，干旱10天后拍照。

鮮花保鮮實(shí)驗(yàn)

市售云南百合品種“西伯利亞”二年生花苞，每支5個(gè)花苞，每支留10片葉，每瓶1支進(jìn)行試驗(yàn)；分別將花枝插入10ppm(22.5μM)的AMX化合物1127水懸浮劑和自來水中，處理前和處理20天后記錄花朵狀況。

葡萄著色實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)使用的葡萄為市售品種巨峰。根據(jù)天氣情況，在葡萄轉(zhuǎn)色期，選取大小、長勢(shì)均勻一致的果穗，分別用6％AMX化合物1127水懸浮劑2000mg/L、1000mg/L、500mg/L、100mg/L浸泡果穗10秒鐘，清水浸泡作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)各處理重復(fù)10次，每個(gè)果穗為一次重復(fù)。成熟采收后取樣，樣品采集時(shí)分別從每個(gè)果穗的上、中、下3個(gè)部位的向光面、背光面兩個(gè)方向進(jìn)行采樣，每穗采果6粒。帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

用直徑10mm的打孔器于葡萄果粒的赤道處上下均勻取30片果皮，混勻稱其重量，進(jìn)行果皮花色苷的測(cè)定。將果皮加入5ml含1％甲酸的甲醇溶液中，25℃下避光搖床萃取30min，然后用8000×g低溫離心10min，收集上清液，殘?jiān)貜?fù)提取4次，合并上清液，30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲酸和甲醇，然后用甲酸乙醇的水溶液(甲酸：乙醇：水＝2:10:88)溶解復(fù)溶，定容至5ml。用pH示差法測(cè)定花色苷的含量(以矢車菊蘇-3-葡萄糖苷當(dāng)量計(jì)算)，每個(gè)處理重復(fù)三次，花色苷含量(mg/g)X＝ΔA×F×M/ε×m，其中ΔA為吸光值；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2，ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)26900；m為樣品質(zhì)量。

AMX毒理實(shí)驗(yàn)

AMX毒理實(shí)驗(yàn)包括：1)細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)受試物是否具有誘發(fā)突變的作用，2)體外微核實(shí)驗(yàn)檢測(cè)受試物是否在非代謝活化系統(tǒng)條件(-S9)具有誘導(dǎo)中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)微核率升高的作用和3)通過SD大鼠單次經(jīng)口灌胃受試物最大耐受量實(shí)驗(yàn)來初步估測(cè)毒性作用的靶器官和可能的毒作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)中使用的受試物為AMX化合物1127。

細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)使用菌株為TA98和TA100兩種鼠傷寒沙門氏菌株，實(shí)驗(yàn)在非代謝活化系統(tǒng)條件(-S9)下采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共設(shè)定5g/皿、15g/皿、50g/皿、150g/皿、500g/皿、1500g/皿和5000g/皿7個(gè)劑量以及陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

體外微核實(shí)驗(yàn)中使用CHL細(xì)胞首先進(jìn)行IC₅₀測(cè)定實(shí)驗(yàn)，根據(jù)IC₅₀測(cè)定結(jié)果設(shè)定體外微核實(shí)驗(yàn)給藥劑量，共設(shè)定1μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL4個(gè)給藥劑量，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，在-S9條件下作用CHL細(xì)胞24h后進(jìn)行制片，通過計(jì)數(shù)每個(gè)劑量500個(gè)細(xì)胞中的單核細(xì)胞、雙核細(xì)胞和多核細(xì)胞數(shù)來計(jì)算該劑量的胞質(zhì)分裂阻滯增殖指數(shù)(cytokinesis-block proliferation index，CBPI)和細(xì)胞毒性。

SD大鼠單次經(jīng)口灌胃受試物最大耐受量實(shí)驗(yàn)選用8只SD大鼠，隨機(jī)分為2組，每組4雌4雄。大鼠單次經(jīng)口灌胃給藥后，連續(xù)觀察14天，于第15天解剖。對(duì)下列指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)價(jià)：臨床觀察、體重和病理學(xué)(肉眼形態(tài)學(xué))檢查。

實(shí)施例1 化合物0604c的制備

1.1制備1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

將1.47g(10mmol)3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮加入到20ml無水DMF，分批加入0.48g(60％in oil，12mmol)氫化鈉，加畢攪拌0.5小時(shí)；滴加2.04g(12mmol)碘丙烷，室溫反應(yīng)16小時(shí)；冰浴下加入飽合氯化銨溶液淬滅反應(yīng)，加入乙酸乙酯萃取。用飽和氯化鈉水溶液洗滌，在加入無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。減壓蒸去溶劑和過量的碘丙烷，得到油狀1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮，未經(jīng)純化直接用于下一步。

1.2制備6-硝基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

在冰水浴下將10ml濃硫酸加入到1.89g(10mmol)1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮中，并劇烈攪拌0.5小時(shí)；用滴液漏斗緩慢滴加硝酸鉀/硫酸溶液(1.01g KNO₃/10ml H₂SO₄)，維持反應(yīng)溫度低于5℃，并反應(yīng)2小時(shí)；傾倒反應(yīng)液入冰水中攪拌0.5h。過濾并用大量的水洗滌濾餅。用乙醇對(duì)粗品進(jìn)行重結(jié)晶。得淡黃色固體1.65g，收率70％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.16-7.05(m,3H),3.95(t,2H),3.00(t,2H),2.71(t,2H),1.72-1.63(m,2H),0.98(t,3H)ppm。

1.3制備6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

將1.18g(5mmol)6-硝基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮加入到50ml甲醇中，再加入催化劑量鈀碳。反應(yīng)體系用氫氣真空置換三次。室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)液通過加入硅藻土的玻璃砂漏斗，濾去催化劑。濃縮濾液得6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮，未經(jīng)純化直接用于下一步。

1.4制備3-氟-4-甲基芐磺酰氯

取2.02g(10mmol)3-氟-4-甲基芐溴和0.76g(10mmol)硫脲溶于50ml無水乙醇中，然后慢慢加熱至回流。反應(yīng)4-6小時(shí)。減壓蒸去溶劑。加入30ml乙腈和10ml濃鹽酸。控制溫度低于20℃，在劇烈攪拌下分批加入5.4g(60mmol)亞氯酸鈉。在15-20℃下反應(yīng)8-16小時(shí)。加入冰水終止反應(yīng)。乙酸乙酯萃取。濃縮萃取液得2.03g白色固體。3-氟-4-甲基芐磺酰氯未經(jīng)純化直接用于下一步。

1.5制備0604c

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.33g(6mmol)3-氟-4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物，為淡黃色固體1.38g，收率71％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.58-6.90(m,6H),4.25(s,2H),3.85(t),2.83(t,2H),2.60(t,2H),2.22(s,3H),1.69-1.60(m,2H),0.95(t,3H)ppm。

實(shí)施例2 化合物1125A的制備

2-氟-4-甲基芐磺酰氯的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.4，不同點(diǎn)在于，用2-氟-4-甲基芐溴代替3-氟-4-甲基芐溴。

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.33g(6mmol)2-氟-4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物，為淡黃色固體1.15g，收率60％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.34-6.91(m,6H),4.36(s,2H),3.89(t,2H),2.87(t,2H),2.65(t,2H),2.34(s,3H),1.71-1.63(m,2H),0.98(t,3H)ppm。

實(shí)施例3 化合物1125B的制備

3，5-二氟-4-甲基芐磺酰氯的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.4，不同點(diǎn)在于，用3，5-二氟-4-甲基芐溴代替3-氟-4-甲基芐溴。

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.44g(6mmol)3，5-二氟4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物0.98g，為淡黃色固體，收率48％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ9.75(s,1H),7.09-6.96(m,5H),4.49(s,2H),3.80(t,2H),2.80(t,2H),2.53(t,2H),2.13(s,3H),1.60-1.49(m,2H),0.88(t,3H)ppm。

實(shí)施例4 化合物0918的制備

2，3-二氟-4-甲基芐磺酰氯的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.4，不同點(diǎn)在于，用2，3-二氟-4-甲基芐溴代替3-氟-4-甲基芐溴。

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.44g(6mmol)2，3-二氟-4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到淡黃色固體1.12g，收率55％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.09-6.79(m,5H),4.42(s,2H),3.89(t,2H),2.87(t,2H),2.65(t,2H),2.29(s,3H),1.73-1.63(m,2H),0.98(t,3H)ppm。

實(shí)施例5 化合物1127的制備

2，3，5，6-四氟-4-甲基芐磺酰氯的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.4，不同點(diǎn)在于，用2，3，5，6-四氟-4-甲基芐溴代替3-氟-4-甲基芐溴。

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.66g(6mmol)2，3，5，6-四氟-4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物，為淡黃色固體1.56g，收率70％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.07(s,1H),7.08-7.05(m,3H),4.58(s,2H),3.81(t,2H),2.80(t,2H),2.53(t,2H),2.25(s,3H),1.57-1.48(m,2H),0.88(t,3H)ppm。

實(shí)施例6 化合物1020A的制備

3-氟-4-三氟甲基芐磺酰氯的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.4，不同點(diǎn)在于，用3-氟-4-三氟甲基芐溴代替3-氟-4-甲基芐溴。

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.65g(6mmol)3-氟-4-三氟甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物，淡黃色固體0.85g，收率39％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.02(s,1H),7.79-6.99(m,6H),4.63(s,2H),3.80(t,2H),2.78(t,2H),2.48(t,2H),1.56-1.47(m,2H),0.87(t,3H)ppm。

實(shí)施例7 化合物1020B的制備

2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐磺酰氯的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.4，不同點(diǎn)在于，用2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐溴代替3-氟-4-甲基芐溴。

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.98g(6mmol)2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物，為黃色固體0.85g，收率35％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.17(s,1H),7.07-7.05(m,3H),4.74(s,2H),3.78(t,2H),2.79(t,2H),2.48(t,2H),1.56-1.49(m,2H),0.86(t,3H)ppm。

實(shí)施例8 化合物1103B的制備

3-氯-4-甲基芐磺酰氯的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.4，不同點(diǎn)在于，用3-氯-4-甲基芐溴代替3-氟-4-甲基芐溴。

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.43g(6mmol)3-氯-4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物，為黃色固體0.96g，收率42％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.17(s,1H),7.41-6.96(m,6H),4.41(s,2H),3.81(t,2H),2.78(t,2H),2.23(t,2H),1.99(s,3H),1.56-1.50(m,2H),0.87(t,3H)ppm。

實(shí)施例9 化合物0925的制備

2-氟-4-氯芐磺酰氯的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.4，不同點(diǎn)在于，用2-氟-4-氯芐溴代替3-氟-4-甲基芐溴。

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.45g(6mmol)2-氟-4-氯芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物，為黃色固體0.83g，收率40％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.63-6.90(m,6H),4.39(s,2H),3.87(t,2H),2.87(t,2H),2.61(t,2H),1.71-1.61(m,2H),0.96(t,3H)ppm。

實(shí)施例10 化合物0703B的制備

6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.1，1.2，1.3，不同點(diǎn)在于：用2-羥基喹啉代替3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮。

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.33g(6mmol)3-氟-4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物，為淡黃色固體1.44g，收率75％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.00(s,1H),7.81-6.59(m,8H),4.47(s,2H),4.17(t,2H),2.28(s,3H),1.66-1.57(m,2H),0.96(t,3H)ppm。

實(shí)施例11 化合物0717的制備

將1.01g(5mmol)6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.66g(6mmol)2，3，5，6-四氟-4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物，為黃色固體1.35g，收率64％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.29(s,1H),7.86-6.60(m,5H),4.64(s,2H),4.15(t,2H),2.19(s,3H),1.69-1.57(m,2H),0.96(t,3H)ppm。

實(shí)施例12 化合物0707的制備

將1.01g(5mmol)6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.33g(6mmol)2-氟-4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物(1.23g)，收率64％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ9.90(s,1H),7.91-6.59(m,8H),4.49(s,2H),4.16(t,2H),2.18(s,3H),1.67-1.55(m,2H),0.95(t,3H)ppm。

實(shí)施例13 化合物0714的制備

將1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.44g(6mmol)2，3-二氟-4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到標(biāo)題化合物(1.45g)，為黃色固體，收率71％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ10.07(s,1H),7.87-6.61(m,8H),4.55(s,2H),4.15(t,2H),2.57(s,3H),1.67-1.58(m,2H),0.95(t,3H)ppm。

實(shí)施例14 化合物130925AMX的制備

6-氨基-1-烯丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.1，1.2和1.3，不同點(diǎn)在于：用3-溴丙烯代替3-碘丙烷。

將1.01g(5mmol)6-氨基-1-烯丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1.23g(6mmol)4-甲基芐磺酰氯加入到30mL DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到化合物130925，為淡黃色固體1.36g，收率73％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.22-6.93(m,7H),5.91-5.83(m，1H),5.25-5.13(dd,2H),4.54(s,2H),4.27(d,2H),2.89(t,2H),2.68(t,2H),2.32(s,3H)ppm。

類似地，重復(fù)上述步驟，用3-氟-4-甲基芐磺酰氯替代4-甲基芐磺酰氯，制得AMX化合物，即為130925AMX。

實(shí)施例15 化合物140228AMX的制備

6-氨基-4-甲基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮的制備方法同實(shí)施例1的步驟1.1，1.2和1.3，不同點(diǎn)在于：用2-羥基-4-甲基喹啉代替3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮。

將1.08g(5mmol)6-氨基-4-甲基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.23g(6mmol)4-甲基芐磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得到化合物140228，為淡黃色固體1.15g，收率62％。

類似地，重復(fù)上述步驟，用3-氟-4-甲基芐磺酰氯替代4-甲基芐磺酰氯，制得AMX化合物，即為140228AMX。

實(shí)施例16 化合物0720B的制備

16.1制備4-甲基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

將3.0g 4-甲基喹啉酮加入到200mL乙酸中，氮?dú)夥諊录尤?00mg鈀碳，用氫氣置換三次。升溫到70℃，反應(yīng)12小時(shí)；玻璃砂漏斗加入硅藻土真空抽濾，濾液減壓濃縮，得到2.7g淡黃色固體。收率為90％。¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ10.11(s，1H),6.84-7.20(m，4H),3.04(m，1H),2.59(dd，1H)，2.22(dd，1H)，1.17(d，3H)ppm。

16.2制備4-甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

將2.0g 4-甲基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮加入到80mL N，N-二甲基甲酰胺中，在冰水浴下攪拌分批加入1.05當(dāng)量氫化鈉，加完攪拌0.5小時(shí)；滴加1.1當(dāng)量的碘丙烷，撤去冰水浴，反應(yīng)12小時(shí)；加入飽和氯化銨溶液淬滅反應(yīng)，加入乙酸乙酯萃取反應(yīng)，合并有機(jī)相，用飽和氯化鈉水溶液洗滌，在加入無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。減壓蒸去溶劑和過量的碘丙烷，得到淡黃色油狀液體2.2g。粗品未經(jīng)過進(jìn)一步純化，粗收率為88％。

16.3制備4-甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

在冰水浴下將20mL硫酸加入到盛有2.0g 4-甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮燒瓶中，并劇烈攪拌0.5小時(shí)；用滴液漏斗緩慢滴加1.1當(dāng)量硝酸鉀的硫酸溶液，維持冰水浴溫度并反應(yīng)1-2小時(shí)；傾倒反應(yīng)液倒冰水中攪拌0.5小時(shí)。過濾并用大量的水洗滌濾餅。用乙醇對(duì)粗品進(jìn)行重結(jié)晶。得1.8g 4-甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮，收率為77％。¹HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.22-7,32(m,3H)，3.93(m,2H)，3.26(m,1H)，2.76(dd,1H)，2.44(dd,1H)，1.64(m,2H)，1.22(d,3H),0.89(t，3H)ppm。

16.4制備16-氨基-4-甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

將1.8g 4-甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮加入到甲醇中，再加入鈀碳作為催化劑。反應(yīng)體系用氫氣置換三次。室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)液通過加入硅藻土的玻璃砂漏斗，濾去固體。濃縮濾液得1.4g 6-氨基-4-甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮。未進(jìn)一步純化直接進(jìn)行下一步，收率為90％。

16.5制備2，3，5，6-四氟-4-甲基芐磺酰氯

取2，3，5，6-四氟-4-甲基芐氯和1當(dāng)量的硫脲溶于乙醇中，然后慢慢加熱至回流。反應(yīng)4-6小時(shí)后濃縮反應(yīng)液。加入乙腈和濃鹽酸?？刂茰囟?-10℃下，在劇烈攪拌下分批加入1.5當(dāng)量的亞氯酸鈉。在15-20℃下反應(yīng)8-16小時(shí)。加入冰水終止反應(yīng)。乙酸乙酯萃取三次。濃縮萃取液得2，3，5，6-四氟-4-甲基芐磺酰氯。未進(jìn)一步純化直接進(jìn)行下一步。

16.6制備化合物0720B

將1.0g 6-氨基-4-甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1當(dāng)量的2，3，5，6-四氟-4-甲基芐磺酰氯加入到DMF中，再加入3當(dāng)量碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品用硅膠柱層析得1.5g化合物0720B，收率為70％。

¹HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.10(s,1H)，7.06-7.12(m,3H),4.59(s,2H),3.80(m,2H)，2.93(m,1H),2.61(dd,1H),2.31(dd,1H)，2.23(s,3H),1.60(m,2H)，1.11(d,3H),0.98(t，3H)ppm。

實(shí)施例17 化合物0825A的制備

17.1制備3-甲基-N-苯基-丁烯酰胺

將4.9g苯胺加入到100mL氯仿中，加入3摩爾當(dāng)量的三乙胺。攪拌狀態(tài)下滴加1.1摩爾當(dāng)量的3-甲基丁烯酰氯，冰浴控溫小于5攝氏度。滴加完畢，移去冰浴，緩慢升溫至回流，反應(yīng)2小時(shí)；減壓蒸干得到8.2g 3-甲基-N-苯基-丁烯酰胺。收率為89％。

17.2制備4,4-二甲基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

將7.0g 3-甲基-N-苯基-丁烯酰胺加入到50mL甲苯中，加入18g無水三氯化鋁。緩慢升溫至80℃。反應(yīng)2.5小時(shí)；減壓蒸干，硅膠柱層析純化得到4.7g淡黃色固體。收率為67％¹HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.12(s,1H),6.86-7.29(m,4H),2.34(s,2H)，1.82(s，6H)ppm。

17.3制備4,4-二甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

將4.0g 4,4-二甲基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮加入到80mL N，N-二甲基甲酰胺中，在冰水浴下攪拌分批加入1.05當(dāng)量氫化鈉，加完攪拌0.5小時(shí)；滴加1.1當(dāng)量的碘丙烷，撤去冰水浴，反應(yīng)12小時(shí)；加入飽和氯化銨溶液淬滅反應(yīng)，加入乙酸乙酯萃取反應(yīng)。合并有機(jī)相，用飽和氯化鈉水溶液洗滌，在加入無水硫酸鈉干燥有機(jī)相。減壓蒸去溶劑和過量的碘丙烷，得到4.4g淡黃色油狀液體。收率為89％。

17.4制備4,4-二甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

在冰浴下將20mL硫酸加入到4.0g 4，4-二甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮燒瓶中，并劇烈攪拌0.5小時(shí)；用滴液漏斗緩慢滴加1.1當(dāng)量的硝酸鉀硫酸溶液，維持冰水浴溫度并反應(yīng)1-2小時(shí)；傾倒反應(yīng)液倒冰水中攪拌0.5小時(shí)。過濾,并用大量的水洗滌濾餅。紅外燈下干燥。用乙醇對(duì)粗品進(jìn)行重結(jié)晶。得3.6g 4,4-二甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮，收率為77％

17.5制備6-氨基-4,4-二甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮

將4.0g 4,4-二甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮加入到50mL甲醇中，再加入300mg鈀碳作為催化劑。反應(yīng)體系用氫氣置換三次。室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)液通過加入硅藻土的玻璃砂漏斗，濾去固體。濃縮濾液得3.1g 6-氨基-4，4-二甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮。未進(jìn)一步純化直接進(jìn)行下一步，收率為89％。

17.6制備0825A

將1.0g 6-氨基-4，4-二甲基-1-丙基-3,4-二氫-2(1H)-喹啉酮和1當(dāng)量的2，3，5，6-四氟-4-甲基芐磺酰氯加入到DMF中，加入3當(dāng)量碳酸鉀為縛酸劑。使反應(yīng)保持在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束加入冰水，乙酸乙酯萃取。無水硫酸鈉干燥。濃縮有機(jī)相。粗品經(jīng)硅膠柱層析純化得1.9淡黃色化合物0825A，收率為78％。

¹HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.07(s,1H),7.09-7.18(m,3H),4.58(s,2H),3.87(t,2H)，2.41(s,2H),2.23(s,3H),1.61(m,2H),1.20(s,6H),0.91(t，3H)ppm。

實(shí)施例18 AMX化合物(化合物0604c、化合物0918和化合物1127)體外實(shí)驗(yàn)的活性測(cè)試

18.1 體外生化實(shí)驗(yàn)和PP2C蛋白磷酸酶活性測(cè)試

體外生化實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的AMX化合物作為一系列廣譜高效的PYL受體激動(dòng)劑，與多個(gè)PYL受體具有高親和性的結(jié)合能力，同時(shí)促進(jìn)PYL受體結(jié)合并抑制PP2C蛋白磷酸酶活性。

以SnRK2.6磷酸化多肽為底物的HAB1蛋白磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)表明，AMX可促進(jìn)PYL2受體可與PP2C蛋白磷酸酶(HAB1)結(jié)合，從而抑制HAB1對(duì)于SnRK2.6磷酸化多肽的去磷酸化作用，且在相同濃度下其效果顯著優(yōu)于ABA。

其中化合物0604c和化合物0918的PYR/PYL受體結(jié)合能力廣譜性實(shí)驗(yàn)表明，在1μM濃度下，其可與PYR1/PYL1/PYL2/PYL3/PYL4/PYL5/PYL7/PYL10結(jié)合，其中與PYR1/PYL1/PYL2/PYL7的結(jié)合能力顯著高于ABA(圖1)，上述結(jié)果表明，AMX是一種廣譜高效的PYL受體激動(dòng)劑。

18.2 AlphaScreen實(shí)驗(yàn)

用AlphaScreen技術(shù)檢測(cè)AMX對(duì)于PYL受體和PP2C蛋白磷酸酶(HAB1)結(jié)合的促進(jìn)能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于PYR1/PYL1/PYL2/PYL7，AMX顯著優(yōu)于ABA的PYL受體親和性和結(jié)合能力(圖2和圖3)。在多個(gè)AMX化合物存在的條件下，上述四種PYL受體與HAB1均具有顯著優(yōu)于ABA和現(xiàn)有ABA類似物的親和性，并且AMX的EC₅₀值較ABA要小1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，且四種PYL受體與HAB1的結(jié)合能力存在AMX的劑量依賴效應(yīng)(圖2和圖3)。

此外，使用大豆GmPYL3(擬南芥PYL1的同源基因)和GmPYL6(擬南芥PYL2的同源基因)與擬南芥AtHAB1的實(shí)驗(yàn)表明，化合物0604c、化合物0918和化合物1127與大豆GmPYL蛋白同樣具有顯著高于ABA的親和性(圖9)。

上述結(jié)果表明，AMX化合物(如化合物0604c、化合物0918和化合物1127)是一系列比ABA等現(xiàn)有化合物更為高效的PYL受體激動(dòng)劑。

實(shí)施例19 AMX化合物(化合物0720B和0825A)體外實(shí)驗(yàn)的活性測(cè)試

19.1 體外生化實(shí)驗(yàn)和PP2C蛋白磷酸酶活性測(cè)試

體外生化實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的化合物0720B和0825A作為高效的PYL受體激動(dòng)劑，與多個(gè)PYL受體具有高親和性的結(jié)合能力，同時(shí)促進(jìn)PYL受體結(jié)合并抑制PP2C蛋白磷酸酶活性。

以SnRK2.6磷酸化多肽為底物的HAB1蛋白磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)表明，化合物0720B和0825A均可促進(jìn)PYL2受體可與PP2C蛋白磷酸酶(HAB1)結(jié)合，從而抑制HAB1對(duì)于SnRK2.6磷酸化多肽的去磷酸化作用，且在同濃度下的效果顯著優(yōu)于同濃度的ABA(表1)。

化合物0720B的PYR/PYL受體結(jié)合能力廣譜性實(shí)驗(yàn)表明，在1μM濃度下，其與PYR1/PYL1/PYL2/PYL7的結(jié)合能力顯著高于ABA(圖13)，上述結(jié)果表明，化合物0720B是一種廣譜高效的PYL受體激動(dòng)劑。

19.2 AlphaScreen實(shí)驗(yàn)

用AlphaScreen技術(shù)檢測(cè)化合物0720B對(duì)于PYL受體和PP2C蛋白磷酸酶(HAB1)結(jié)合的促進(jìn)能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于擬南芥PYL2受體和PYR1受體，化合物0720B顯著優(yōu)于ABA的PYL受體親和性和結(jié)合能力(圖2)，且0720B的EC₅₀值較ABA要小1-2個(gè)數(shù)量級(jí)(表1)，表明這兩種PYL受體與HAB1的結(jié)合能力存在0720B的劑量依賴效應(yīng)(圖14)。

上述結(jié)果表明，AMX化合物(如化合物0720B和0825A)是比ABA等現(xiàn)有化合物更為高效的PYL受體激動(dòng)劑。

實(shí)施例20 AMX化合物(0604c、1125A、1125B、0918、1127)的生理活性測(cè)試

20.1 對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的抑制效果

結(jié)果如圖6所示。播種6天后，1μM對(duì)照化合物AM1、化合物0604c、化合物0918、化合物1127和ABA同樣能夠抑制Col-0生態(tài)型種子的萌發(fā)，而無法抑制PYR/PYL三突變體pyr1；pyl1；pyl4種子的萌發(fā)。

結(jié)果表明，AMX化合物的萌發(fā)抑制效應(yīng)是因?yàn)槠浼せ盍酥参飪?nèi)在的ABA信號(hào)通路，而非對(duì)植物種子產(chǎn)生了毒性。其中兩種AMX化合物(化合物0918和化合物1127)對(duì)Col-0生態(tài)型種子萌發(fā)的抑制效果顯著優(yōu)于對(duì)照化合物。

20.2 擬南芥葉面蒸騰作用

本實(shí)驗(yàn)中，利用紅外攝像機(jī)觀察記錄葉面的溫度變化，從而反映出植物的蒸騰作用強(qiáng)弱。

擬南芥葉面蒸騰實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7a所示。5μM對(duì)照化合物ABA、對(duì)照化合物AM1和多種AMX化合物噴施擬南芥兩天后，葉面溫度均高于DMSO對(duì)照組，意味著化合物處理的植物蒸騰作用減弱；噴施4天后，化合物0918和化合物1127處理過的植物葉面溫度仍要高于對(duì)照組，其余化合物處理過的植物葉面溫度則已降至DMSO對(duì)照組水平。濃度梯度實(shí)驗(yàn)則顯示AMX化合物對(duì)于蒸騰作用的抑制存在劑量效應(yīng)(圖7b)，其效果與使用化合物的濃度以及化合物中鹵素原子的數(shù)量均呈正相關(guān)。

對(duì)大豆進(jìn)行的葉面蒸騰抑制實(shí)驗(yàn)表明，噴施50μM的化合物1127的植株，每株的用量是0.2μmol，三天后其葉面溫度仍顯著高于噴施DMSO的對(duì)照組。結(jié)果表明，此時(shí)大豆葉面的蒸騰效應(yīng)仍受到抑制，而噴施相同濃度ABA的植株葉面溫度已與對(duì)照組無異(圖10)。這表明化合物1127在大豆中也存在與擬南芥同樣的抑制葉面蒸騰作用的效果。

20.3 擬南芥的抗旱性

為了進(jìn)一步探索AMX對(duì)于植株抗旱性的影響，在土壤中生長兩周的擬南芥Col-0生態(tài)型停止給水，干旱期間每周向葉面噴灑一次含相應(yīng)濃度的(+)-ABA/AM1/AMX或0.05％DMSO(對(duì)照)的溶液，共噴施兩次，溶液中同時(shí)添加了0.02％(v/v)的表面活性劑Tween-20以增強(qiáng)噴劑對(duì)于葉片表皮的穿透作用。經(jīng)過17天的干旱處理后，噴施DMSO的對(duì)照組和噴施10μM ABA和AM1的植物均已旱死，而噴施10μM 0604c的植物仍能存活(圖8a)；濃度降至5μM后，噴施化合物0918、化合物1125b和化合物1127的植株在干旱18天后仍然存活，而噴施DMSO的對(duì)照組ABA的植株均已旱死，其中噴施化合物1127的植株在干旱20天后仍然保持良好的長勢(shì)(圖8b)。

利用結(jié)構(gòu)相似的化合物(如化合物0604c、化合物0918和化合物1127)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，植物的抗旱性強(qiáng)弱與噴施化合物的鹵素原子個(gè)數(shù)呈正相關(guān)，干旱2周后，鹵素原子多的化合物(如化合物0918和化合物1127)處理后的植物較相同濃度下鹵素原子少的化合物(如化合物0604c)處理后的植物有更強(qiáng)的抗旱性(圖8c)。

20.4 大豆和玉米的抗旱性

大豆在3組3葉期，玉米在小喇叭口期開始干旱，選取相同大小的植株進(jìn)行土壤干旱實(shí)驗(yàn)，期間每隔兩天噴施一次含50μM的各測(cè)試化合物AMX或各對(duì)照化合物的水溶液，溶液中同樣添加了0.05％(v/v)的表面活性劑Tween-20。經(jīng)過一周的干旱處理后復(fù)水，噴施50μM的化合物0918和化合物1127的大豆在復(fù)水一月后長勢(shì)明顯優(yōu)于噴施DMSO的對(duì)照組和噴施50μM ABA的株系，其中噴施化合物0918與噴施ABA的株系存活率相當(dāng)，而噴施化合物1127的株系存活率要高于上述兩者(圖11)。噴施化合物0918的玉米在復(fù)水后大部分存活，而噴施DMSO的對(duì)照組玉米在復(fù)水后亦無法復(fù)原(圖11)。

上述結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物可以顯著提高單子葉(玉米)和雙子葉(大豆)農(nóng)作物的抗旱性。

本發(fā)明所述化合物活性(通過促進(jìn)PYR/PYL受體與HAB1蛋白磷酸酶的結(jié)合從而抑制后者磷酸酶活的能力)的具體數(shù)據(jù)見表1。

實(shí)施例21 AMX化合物(化合物0720B)的抗旱活性測(cè)試

21.1 對(duì)大豆和棉花葉面蒸騰作用的抑制

本實(shí)驗(yàn)中，利用紅外攝像機(jī)觀察記錄葉面的溫度變化，從而反映出植物的蒸騰作用強(qiáng)弱。

大豆和棉花的葉面蒸騰實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15和圖16所示，對(duì)大豆進(jìn)行的葉面蒸騰抑制實(shí)驗(yàn)表明，分別噴施10/20/50μM 0720B化合物的植株，在噴施一天后其葉面溫度均顯著高于噴施DMSO的對(duì)照組和噴施50μM ABA的植株，這意味著化合物處理的植物的蒸騰作用要弱于后者。其中噴施20或50μM 0720B化合物的植株其葉面溫度在噴施兩天后仍顯著高于噴施DMSO的對(duì)照組，表明此時(shí)大豆葉面的蒸騰效應(yīng)仍受到抑制，而此時(shí)噴施50μM ABA的植株葉面溫度已與對(duì)照組無異(圖15)。對(duì)棉花進(jìn)行的葉面蒸騰抑制實(shí)驗(yàn)則表明，噴施50μM0720B化合物的植株，兩天后其葉面溫度仍顯著高于噴施DMSO的對(duì)照組，而噴施50μM ABA的植株葉面溫度此時(shí)已與對(duì)照組無異(圖16)。

上述結(jié)果表明，0720B化合物對(duì)于大豆和棉花葉面蒸騰作用的抑制效果均顯著優(yōu)于ABA。

21.2 對(duì)大豆和棉花抗旱性的增強(qiáng)

分別播種16天的大豆和23天的棉花，選取相同大小的植株進(jìn)行土壤干旱實(shí)驗(yàn)。大豆在開始干旱后每3天噴施含10/20/50μM的0720B或50μM的ABA水溶液，棉花則在開始干旱后每4天噴施一次含50μM的ABA/0720B化合物的水溶液，大豆和棉花干旱實(shí)驗(yàn)均使用含0.05％DMSO的水溶液作為對(duì)照組，上述溶液中均添加了0.1％(v/v)的表面活性劑Tween-20以增強(qiáng)噴劑對(duì)于葉片表皮的穿透作用。大豆在干旱11天后復(fù)水，噴施10/20/50μM 0720B化合物的大豆復(fù)水后長勢(shì)均明顯優(yōu)于噴施DMSO的對(duì)照組以及噴施50μM ABA的植株(圖17)。噴施50μM 0720B化合物的棉花在干旱10天后長勢(shì)同樣明顯優(yōu)于噴施DMSO的對(duì)照組以及噴施50μM ABA的植株(圖18)。

本發(fā)明所述化合物活性(通過促進(jìn)PYR/PYL受體與HAB1蛋白磷酸酶的結(jié)合從而抑制后者磷酸酶活的能力)的具體數(shù)據(jù)見表1。

表1式I化合物的代表化合物的活性列表

從表1可以看出，本發(fā)明的式I化合物的活性顯著高于對(duì)照化合物(1、2)，并且，鹵素原子的數(shù)量與化合物的活性成正比。

實(shí)施例22 PYL2-AMX-HAB1復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

采用通用方法中所述的蛋白晶體解析方法，檢測(cè)了多個(gè)本發(fā)明AMX化合物所形成的PYL2-AMX-HAB1復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。對(duì)照為ABA和現(xiàn)有的ABA類似物，各復(fù)合物的二維結(jié)構(gòu)局部示意圖如圖4所示。

從圖4看出，AMX存在于PYL2的口袋結(jié)構(gòu)中，ABA結(jié)構(gòu)上的四個(gè)氧原子可通過多個(gè)水分子與PYL2口袋結(jié)構(gòu)以及HAB1的多個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵(圖4a)，AMX化合物磺酰氨基團(tuán)上的氧原子和氮原子以及喹啉環(huán)上的氧原子同樣可以形成氫鍵。此外，對(duì)二甲苯上的鹵素取代基可通過空間位阻效應(yīng)幫助磺酰氨基團(tuán)上的氧原子和氮原子與更鄰近的氨基酸殘基形成氫鍵，或直接與PYL2口袋結(jié)構(gòu)形成氫鍵，如化合物0918(圖4d)、化合物1127(圖4e)、化合物1020A(圖4f)、化合物1020B(圖4g)、和化合物1125A(圖4h)上的氟原子。

值得注意的是，在對(duì)位存在甲基或鹵素原子(如氯原子)的情況下，鄰位的氟原子多形成氫鍵，間位的鹵素原子則多利用空間位阻效應(yīng)幫助磺酰氨基團(tuán)上的氧原子和氮原子與更臨近的氨基酸殘基形成氫鍵；而當(dāng)對(duì)位存在鹵素代甲基的情況下，間位的氟原子也可形成氫鍵，如化合物1020A(圖4f)。

此外，通過比較三組結(jié)構(gòu)相似的化合物(化合物0604c(圖4c)/化合物0918(圖4d)/化合物1127(圖4e)，化合物1020A(圖4f)/化合物1020B(圖4g)以及化合物1125A(圖4h)/化合物1125B(圖4i))，可以發(fā)現(xiàn)鹵素原子的數(shù)量與氫鍵的數(shù)量也呈正相關(guān)性。與對(duì)照化合物相比，化合物AMX與PYL2口袋結(jié)構(gòu)之間形成的氫鍵數(shù)量更多或結(jié)合更強(qiáng)，因此，AMX表現(xiàn)出更強(qiáng)的PYL受體親和性。

實(shí)施例23 AMX可誘導(dǎo)ABA響應(yīng)的脅迫相關(guān)基因的表達(dá)

本發(fā)明人分析了外源添加AMX對(duì)于植物基因表達(dá)的影響。

基因表達(dá)分析的結(jié)果表明，AMX可誘導(dǎo)ABA響應(yīng)的脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，且表達(dá)水平大多可以達(dá)到或高于相同濃度外源ABA所誘導(dǎo)的表達(dá)水平(圖5)。10μM的化合物AMX處理后，10天大的野生型擬南芥(Col-0)苗期植株中，7個(gè)已知的受ABA誘導(dǎo)的與環(huán)境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量顯著增加，其中用化合物0604c和化合物0717處理6小時(shí)后，多數(shù)基因的表達(dá)水平顯著超過10μM ABA處理相同時(shí)間后的水平，而10μM AM1處理6小時(shí)后，上述基因的表達(dá)水平則低于10μM ABA處理相同時(shí)間后的水平。此外，化合物0604c和化合物0918處理一天后，相關(guān)基因的表達(dá)水平亦顯著超過10μM ABA處理相同時(shí)間后的水平(圖5)。

綜上，結(jié)果表明，AMX對(duì)于多數(shù)環(huán)境脅迫相關(guān)基因的誘導(dǎo)效果要顯著優(yōu)于ABA和AM1。

實(shí)施例24 植物保鮮(鮮花保鮮)

結(jié)果表明，AMX化合物1127的水懸浮劑可顯著延緩花苞凋謝和葉片枯萎的情況。自來水對(duì)照組放置20天后花朵全部凋謝，葉片全部枯萎，而AMX化合物1127的水懸浮劑處理組尚有60％花朵正常開放，沒有葉片枯萎且有70％葉片保持綠色。

實(shí)施例25 葡萄著色

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示。

結(jié)果表明，AMX化合物1127的水懸浮劑處理后的葡萄果皮花色苷含量顯著高于清水對(duì)照組，因此，花色苷的含量與葡萄果皮上色成正相關(guān)。

實(shí)施例26 毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，AMX化合物1127在各劑量下對(duì)TA98和TA100菌株均未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)菌毒性。

體外微核實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，AMX化合物1127在-S9條件下不具有誘導(dǎo)CHL細(xì)胞微核率升高的作用。

SD大鼠單次經(jīng)口灌胃受試物最大耐受量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥量為5000mg/kg組的雌雄大鼠在臨床觀察、體重和各組織/臟器的肉眼形態(tài)學(xué)觀察方面均未見藥物相關(guān)性改變，AMX化合物1127的最大耐受量(MTD)大于5000mg/kg。

這表明，本發(fā)明的AMX化合物具有很高的安全性。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。