本發(fā)明是關(guān)于一種雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，具體而言，本發(fā)明是關(guān)于一種用來(lái)高效、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變cho細(xì)胞株(cho/dhfr-)的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，以及該載體的構(gòu)建方法與相關(guān)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備治療性重組蛋白質(zhì)藥物已成為當(dāng)今生物制藥領(lǐng)域中的主流技術(shù)。采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)既能保證重組蛋白質(zhì)的正確糖基化和磷酸化，又能保證重組蛋白二硫鍵的正確配對(duì)和蛋白質(zhì)的正確折疊，從而使由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白與天然蛋白質(zhì)具有相似的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。目前有60％以上的重組蛋白質(zhì)藥物(市場(chǎng)份額已經(jīng)接近70％)的生產(chǎn)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。但是在一般情況下，外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)量很低，常常在1mg/l以下，很難用于實(shí)際制藥生產(chǎn)，成為制約藥物發(fā)展的瓶頸。
在確定宿主細(xì)胞后，目的基因的表達(dá)產(chǎn)量主要由其表達(dá)載體的各表達(dá)調(diào)控元件及組織方式?jīng)Q定。影響外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)因素有轉(zhuǎn)錄效率、mrna的加工、mrna的穩(wěn)定性及翻譯效率、目的基因拷貝數(shù)和外源蛋白翻譯后的加工、分泌和穩(wěn)定性?；谝陨弦蛩?，一個(gè)高效率的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體至少具備以下幾個(gè)特征：強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、多聚腺苷酸加尾信號(hào)(polya)、終止子、選擇性標(biāo)記包括基因擴(kuò)增標(biāo)志等。由于商品化的表達(dá)載體未能有效整合調(diào)控元件，難以獲得高表達(dá)的細(xì)胞株，因而，在表達(dá)載體中替換或加入有助于提高表達(dá)量的調(diào)控元件是必須的。
載體中最關(guān)鍵的元件是驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，它是獲得基因高表達(dá)的第一步。目前，商業(yè)化的表達(dá)載體中主要使用三種啟動(dòng)子：sv40啟動(dòng)子、hcmv啟動(dòng)子和ef-1啟動(dòng)子。sv40啟動(dòng)子和hcmv啟動(dòng)子是外源病毒啟動(dòng)子，而ef-1啟動(dòng)子是cho細(xì)胞的同源啟動(dòng)子，研究發(fā)現(xiàn)ef-1啟動(dòng)子的效率比sv40啟動(dòng)子和hcmv啟動(dòng)子都高，而且利用它所建立的生產(chǎn)細(xì)胞株的穩(wěn)定性也優(yōu)于sv40啟動(dòng)子和 hcmv啟動(dòng)子。因此，今后的一個(gè)方向是分離宿主細(xì)胞的同源強(qiáng)啟動(dòng)子用于表達(dá)，這些同源啟動(dòng)子可能比異源啟動(dòng)子更好地在宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用。
在cho細(xì)胞表達(dá)載體中有兩類(lèi)選擇標(biāo)記，neo等是非擴(kuò)增基因，這種選擇標(biāo)志對(duì)目的基因的拷貝數(shù)沒(méi)有影響，主要用于構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體；另一類(lèi)選擇標(biāo)志具有擴(kuò)增基因的功能，也稱(chēng)共擴(kuò)增基因，如dhfr(二氫葉酸還原酶)、gs(谷氨酰胺合成酶)等。當(dāng)攜帶共擴(kuò)增基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染cho細(xì)胞后，隨著培養(yǎng)基中選擇性藥物濃度的逐漸增加，使共擴(kuò)增基因的拷貝數(shù)不斷增加；同時(shí)其側(cè)翼的dna片段也會(huì)相應(yīng)得到擴(kuò)增，使目的基因的拷貝數(shù)增加幾百倍到幾千倍，從而達(dá)到外源基因的高效表達(dá)。表達(dá)外源蛋白最成功的這類(lèi)載體受體系統(tǒng)主要有cho/dhfr和cho/gs。dhfr基因編碼的dhfr是細(xì)胞代謝途徑中的一個(gè)重要的酶，當(dāng)細(xì)胞缺乏此酶或酶失活時(shí)必須依靠在培養(yǎng)基中添加次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷才能存活。氨甲蝶呤(mtx)是dhfr的類(lèi)似底物，可競(jìng)爭(zhēng)抑制dhfr的活性。當(dāng)環(huán)境存在高濃度的mtx時(shí)，dhfr基因可自發(fā)地在染色體上擴(kuò)增其拷貝數(shù)，以產(chǎn)生更多的dhfr來(lái)維持細(xì)胞的正常代謝，當(dāng)其擴(kuò)增時(shí)，可以與連在它兩側(cè)的序列一起擴(kuò)增，與dhfr基因共擴(kuò)增的序列的大小通常比dhfr基因要大許多，可達(dá)上千個(gè)kb，足以包含其兩翼的基因序列。這種共擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)了目的基因劑量擴(kuò)增，從而提高表達(dá)產(chǎn)量。但是，當(dāng)采用dhfr共擴(kuò)增系統(tǒng)時(shí)，細(xì)胞需在遞增mtx濃度的培養(yǎng)基中逐漸適應(yīng)，操作繁瑣而且需要耗費(fèi)大量時(shí)間，并需在高濃度mtx下才能達(dá)到最高表達(dá)水平。高濃度的mtx對(duì)細(xì)胞具有毒性，使細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，不利于蛋白生產(chǎn)，也不利于基因擴(kuò)增篩選，同時(shí)遺傳穩(wěn)定性也有所下降。
近年來(lái)發(fā)展的弱化dhfr基因表達(dá)的方法包括：采用弱啟動(dòng)子降低dhfr基因的表達(dá)，在相同的mtx濃度下，細(xì)胞需要更多的dhfr基因拷貝才能適應(yīng)。因而這種弱化dhfr基因表達(dá)的擴(kuò)增載體可在較低mtx濃度下獲得較高的基因擴(kuò)增。目前，這種依靠弱化啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)可擴(kuò)增標(biāo)志基因的載體成為設(shè)計(jì)目的基因高效表達(dá)的主流。另外有種弱化手段是通過(guò)在載體中插入ires(internalribosomeentrysite，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))，將目的基因位于ires上游，而dhfr基因位于ires下游。ires上游的可讀框的翻譯采用常規(guī)的依賴(lài)于帽子結(jié)構(gòu)的掃描翻譯起始模式；ires下游的可讀框的翻譯采用不依賴(lài)于帽子結(jié)構(gòu)的直接翻譯起始，這樣的翻譯效率是很低的，所以dhfr基因的表達(dá)量將比較少。
為了使外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得高水平的表達(dá)，有必要探索構(gòu)建新的表達(dá)載體或優(yōu)化已有的表達(dá)載體系統(tǒng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用來(lái)高效、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變cho細(xì)胞株(cho/dhfr-)的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述載體的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述載體的應(yīng)用，特別是在弱化dhfr基因表達(dá)中的應(yīng)用。
一方面，本發(fā)明提供了一種雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，其是在pires質(zhì)粒上分別插入s100a6啟動(dòng)子、目的基因和dhfr基因構(gòu)建而成。
本發(fā)明的載體使用的啟動(dòng)子是cho細(xì)胞內(nèi)源的s100a6誘導(dǎo)啟動(dòng)子。cho細(xì)胞的同源s100a6啟動(dòng)子在33℃是一個(gè)非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，效率比sv40啟動(dòng)子高3倍，而在37℃時(shí)s100a6啟動(dòng)子是一個(gè)較弱的啟動(dòng)子，效率與sv40啟動(dòng)子相當(dāng)。這個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)對(duì)于弱化dhfr(二氫葉酸還原酶基因)表達(dá)、增加目的基因拷貝數(shù)和提高目的基因的產(chǎn)量來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。本發(fā)明利用該啟動(dòng)子在37℃時(shí)效率低的性質(zhì)弱化dhfr基因的表達(dá)。同時(shí)，本發(fā)明中，dhfr基因是置于ires的下游，將dhfr基因置于ires的下游進(jìn)一步弱化dhfr基因的表達(dá)。本發(fā)明的載體，能在低濃度的mtx濃度下獲得足夠多的dhfr基因和目的基因的拷貝數(shù)，減輕篩選強(qiáng)度，縮短建立高效表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞系所需要的時(shí)間，提高重組蛋白穩(wěn)定克隆的篩選效率和表達(dá)蛋白產(chǎn)量。另外，利用s100a6誘導(dǎo)啟動(dòng)子在33℃時(shí)效率提高3倍的性質(zhì)，在生產(chǎn)重組蛋白的時(shí)候，將培養(yǎng)溫度降低到33℃，使多拷貝的目的基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，大大增加了重組蛋白的產(chǎn)量。這種僅僅需要調(diào)整溫度而不必加入化合物的誘導(dǎo)方法不但可以提高產(chǎn)量，而且可以抑制雜蛋白的產(chǎn)生，減輕了純化的難度。
另一方面，本發(fā)明提供了一種雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體的構(gòu)建方法，該方法包括：
在pires質(zhì)粒相鄰的酶切位點(diǎn)xmai和noti之間插入共擴(kuò)增基因dhfr，使dhfr基因置于核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)的下游；
在pires質(zhì)粒的ires上游的多克隆位點(diǎn)中插入目的基因；
用限制酶bglii和nhei雙酶切pires質(zhì)粒，切除pcmv啟動(dòng)子，s100a6啟動(dòng)子(ps)經(jīng)同樣雙酶切后插入pires質(zhì)粒中形成重組的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體pires-ps-dhfr。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括：
以dhfr全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本cdna克隆為模板，用含有xmai酶切位點(diǎn)的上游引物和含有noti酶切位點(diǎn)的下游引物，pcr擴(kuò)增dhfr基因，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后經(jīng)xmai和noti雙酶切，插入經(jīng)同樣雙酶切的pires中，得到含有共擴(kuò)增基因的重組質(zhì)粒pires-dhfr；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中保存；
提取cho細(xì)胞株的dna，并以此為模板用含bglii酶切位點(diǎn)的上游引物和含有nhei酶切位點(diǎn)的下游引物，pcr擴(kuò)增s100a6的啟動(dòng)子，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后用nhei和bglii雙酶切，與同樣雙酶切切除了pcmv啟動(dòng)子的pires-dhfr載體相連，得到pires-ps-dhfr；
在多克隆位點(diǎn)mcsa(nhei、xhoi、ecor1、mlu1)插入目的基因。
本發(fā)明的載體是利用ires把目的基因和共擴(kuò)增基因dhfr置于同一個(gè)表達(dá)載體中并在同一個(gè)啟動(dòng)子作用下轉(zhuǎn)錄，利用cho細(xì)胞內(nèi)源的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在37℃時(shí)效率低的性質(zhì)和把dhfr基因置于ires下游降低其翻譯效率的手段，弱化dhfr基因的表達(dá)，使目的基因僅僅通過(guò)兩到三輪的加壓篩選(基因擴(kuò)增)就在低濃度mtx下獲得足夠的拷貝數(shù)，短時(shí)間內(nèi)建立了高效、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，同時(shí)利用低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子的性質(zhì)，在生產(chǎn)過(guò)程中降低培養(yǎng)溫度，最大限度提高目的蛋白的產(chǎn)量。
另一方面，本發(fā)明還提供了所述的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體在cho細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白中的應(yīng)用。其中，是利用低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子弱化dhfr表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中，在cho細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白的過(guò)程包括：接種dhfr缺陷型的cho細(xì)胞，加入含血清、不含抗生素的dmem培養(yǎng)基，37℃，5％co2培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染時(shí)要求細(xì)胞40％-80％匯合；轉(zhuǎn)染表達(dá)載體；繼續(xù)培養(yǎng)；進(jìn)行單克隆篩選和基因擴(kuò)增；降溫培養(yǎng)細(xì)胞高效生產(chǎn)重組蛋白。
綜上所述，本發(fā)明通過(guò)使用低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和構(gòu)建雙順?lè)醋虞d體，弱化dhfr基因的表達(dá)，使目的基因僅僅通過(guò)兩或三輪的加壓篩選，在低濃度mtx下獲得足夠的拷貝數(shù)，同時(shí)利用誘導(dǎo)啟動(dòng)子的性質(zhì)，在生產(chǎn)過(guò)程中降低溫度，最大限度增加重組蛋白的產(chǎn)量。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體pires-ps-sdr5-dhfr的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照下列實(shí)施例及附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照制造商所建議的條件。
實(shí)施例1
本發(fā)明公開(kāi)一種利用低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子弱化dhfr表達(dá)的雙順?lè)醋虞d體及其應(yīng)用方法，其中是在pires載體中，分別插入cho細(xì)胞內(nèi)源的s100a6誘導(dǎo)啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、ires和dhfr。該載體利用s100a6啟動(dòng)子在37℃時(shí)效率低的性質(zhì)和把dhfr基因置于ires下游降低其翻譯效率的手段，弱化dhfr的表達(dá)，在低濃度的mtx下增加dhfr和目的基因的拷貝數(shù)，減輕篩選強(qiáng)度，縮短建立高效、穩(wěn)定表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞系所需要的時(shí)間。同時(shí)利用s100a6的啟動(dòng)子在33℃時(shí)效率提高3倍的性質(zhì)，在生產(chǎn)過(guò)程中降低培養(yǎng)溫度，大大增加目的蛋白的產(chǎn)量和純度。
本發(fā)明的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體構(gòu)建方法如下：
以dhfr全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本cdna克隆(購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司，dhfr序列參見(jiàn)seqidno.1)為模板，用含有xmai酶切位點(diǎn)的上游引物f1：ctacccgggatggttcgaccattgaactgc(seqidno.2)和含有noti酶切位點(diǎn)的下游引物s1：cgatgcggccgcttagtctttcttctcgtagac(seqidno.3)，pcr擴(kuò)增dhfr基因，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后經(jīng)xmai和noti雙酶切，插入經(jīng)同樣雙酶切的pires中，得到含有共擴(kuò)增基因的重組質(zhì)粒pires-dhfr。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中保存。
提取cho細(xì)胞株的dna，并以此為模板用含bglii酶切位點(diǎn)的上游引物f2：gtcagatctatgccggagtcacgagtcac(seqidno.4)和含有nhei酶切位點(diǎn)的下游引物s2：gcctttggaggatgataagcttaattgaccactgg(seqidno.5)，pcr擴(kuò)增s100a6的啟動(dòng)子，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后用nhei和bglii雙酶切，與同樣雙酶切切除了pcmv啟動(dòng)子的pires-dhfr載體相連，命名 為pires-ps-dhfr(圖1)。
(3)在多克隆位點(diǎn)mcsa(nhei、xhoi、ecor1、mlu1)插入目的基因。
本發(fā)明的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體的應(yīng)用：
(1)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染前一天，在60mm的培養(yǎng)皿中接種1x106個(gè)dhfr缺陷型的cho細(xì)胞，加入5ml含血清、不含抗生素的dmem培養(yǎng)基，37℃，5％co2培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)染時(shí)要求細(xì)胞40％-80％匯合。用opti-mem1的培養(yǎng)基稀釋5μg的重組質(zhì)粒至總體積250ul，稀釋后應(yīng)顛倒幾次離心管以混勻混合物。向混合物中加入10μl轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000，用加樣器吹打數(shù)次。在室溫下孵育混合物5-10分鐘。在孵育的同時(shí)，吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用pbs洗滌一次，加入3ml的培養(yǎng)基。往混合物中加入1ml含血清的培養(yǎng)基，用加樣器吹打2次，將產(chǎn)物全部加入培養(yǎng)皿中，輕輕搖動(dòng)以混勻。37℃，5％co2培養(yǎng)4-5個(gè)小時(shí)后更換dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。
(2)單克隆篩選和基因擴(kuò)增
培養(yǎng)24小時(shí)后，加入10nm氨甲喋呤(mtx)的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行加壓篩選。37℃，5％co2，靜置培養(yǎng)兩周后出現(xiàn)分散的細(xì)胞抗性克隆。將抗性克隆消化，計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞1個(gè)/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150μl/孔，再加入細(xì)胞液10μl/孔，進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，24小時(shí)后用elisa檢測(cè)各克隆細(xì)胞株的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選得到的單克隆細(xì)胞株全部都是陽(yáng)性克隆。選取表達(dá)量高的細(xì)胞移入24孔板擴(kuò)增傳代，24小時(shí)后用elisa檢測(cè)各克隆細(xì)胞株的表達(dá)量，篩選表達(dá)量最高的克隆細(xì)胞，液氮保存的同時(shí)進(jìn)行mtx遞增加壓篩選。
將1x106轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種于20nm氨甲喋呤(mtx)的dmem培養(yǎng)基中，37℃，5％co2培養(yǎng)兩個(gè)星期，換液再培養(yǎng)24小時(shí)后elisa檢測(cè)表達(dá)量。接著將獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種入30nm氨甲喋呤(mtx)的dmem培養(yǎng)基中，37℃，5％co2培養(yǎng)兩個(gè)星期，換液培養(yǎng)24小時(shí)后elisa檢測(cè)表達(dá)量。同樣方法進(jìn)行40nm和60nm的氨甲喋呤(mtx)遞增加壓篩選，直到基因表達(dá)量沒(méi)有顯著增加為止。
(3)降溫培養(yǎng)細(xì)胞高效生產(chǎn)重組蛋白
將重組細(xì)胞接種于6cm的培養(yǎng)皿中，37℃，5％co2培養(yǎng)48小時(shí)，待細(xì)胞匯合 度為100％，將溫度調(diào)整為33℃，于5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)后測(cè)定表達(dá)量。s100a6啟動(dòng)子不但能夠在37℃弱化dhfr基因的表達(dá)，使dhfr基因和目的基因能夠在短時(shí)間內(nèi)和低濃度的mtx下獲得更多的拷貝數(shù)，而且能夠在33℃提升自身效率，大大增加目的基因的表達(dá)量。