本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測禽流感病毒h7n9的時間分辨熒光免疫分析方法。

背景技術(shù)：

甲型h7n9流感病毒是在2013年3月在中國東部上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)的一種新型禽流感病毒，感染該病毒將引起肺炎、呼吸道衰竭、急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ards)。截止到2014年7月，世界衛(wèi)生組織(worldhealthorganization,who)公布人感染h7n9禽流感病例450例，死亡165例。h7n9是禽流感病毒中的一種亞型，主要發(fā)生在禽類，也可發(fā)生在哺乳類動物，h7n9對人類具有更高的感染性，在人間主要是散發(fā)病例。人類通過接觸帶毒的病、死禽排泄物、分泌物、或其排泄物、分泌物污染的環(huán)境或物品而感染，帶毒的分泌物或排泄物通過空氣飛沫播散，懸浮于空氣中成為氣溶膠，經(jīng)消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等途徑傳播到人。

目前，檢測h7n9病毒方法主要有：熒光定量pcr檢測病毒核酸、elisa方法檢測病毒顆?；蛘呖共《究贵w、膠體金檢測試劑、血凝抑制(hi)試驗檢測抗血凝素(ha)抗體、瓊脂免疫擴散(agp)試驗檢測抗核蛋白的抗體、病毒中和、補體結(jié)合、神經(jīng)氨酸酶抑制和單輻射溶血等方法。

針對h7n9病毒的檢測技術(shù)，國內(nèi)外發(fā)展最完善的技術(shù)是用實時熒光定量pcr檢測病毒的核酸，該方法具備敏感、準(zhǔn)確等優(yōu)勢，是大型實驗室最常用的h7n9病毒檢測方法。如廣州健侖生物科技有限公司生產(chǎn)的h7n9病毒檢測試劑盒，利用熒光pcr技術(shù)，針對樣本中h7n9特定基因片段，高靈敏性地，特異性地檢測出h7n9病毒的存在。在用elisa技術(shù)檢測h7n9病毒方面，國內(nèi)大部分產(chǎn)品是檢測血清中抗h7n9病毒的抗體，如奕旲（蘇州）生物技術(shù)有限公司和蘇州杰恩生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的禽流感h7n9elisa抗體診斷試劑盒，是將濃縮后的抗原包被微孔板，應(yīng)用間接elisa原理檢測血清中的抗禽流感h7n9亞型的抗體。國外有多家生物公司生產(chǎn)h7n9病毒的檢測試劑盒，如sinobiological公司生產(chǎn)的h7n9病毒ha蛋白的配對elisa檢測試劑盒，是將抗h7n9病毒ha蛋白的單抗包被酶聯(lián)板，以雙抗夾心elisa法為檢測原理，生物素-鏈親和素檢測體系檢測待檢樣品中ha蛋白，從而判定h7n9病毒的存在。

上述方法都存在一定的缺陷，如熒光定量pcr檢測技術(shù)雖然最靈敏，但成本高，操作要求復(fù)雜，不容易推廣。膠體金檢測試劑存在敏感度低等缺點。瓊脂免疫擴散試驗(agp)、血凝抑制試驗（hi）和病毒中和等方法，雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但都需要制備純化、濃縮完整的病毒作為檢測抗原，而h7n9病毒是高致病性病毒，需在p3實驗室（生物安全防護三級實驗室）完成，不易生產(chǎn)、純化、成本較高，且存在感染性和容易散毒，在應(yīng)用中存在很大的局限性。此外機體感染h7n9病毒，第7天后開始出現(xiàn)保護性抗體，檢測抗體不能達到早期檢出病毒的目的。

時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolvedfluorescenceimmunoassay，trfia）是一種新型的體外超微量分析定量技術(shù)，它采用具有獨特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物為示蹤物，用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強度，根據(jù)產(chǎn)物熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達到定量分析。它克服了酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定、化學(xué)發(fā)光僅能一次發(fā)光且易受環(huán)境干擾、電化學(xué)發(fā)光的非直接標(biāo)記等缺點，使非特異性信號降低到可以忽略的程度，達到了極高的信噪比，從而大大地超過了放射性同位素所能達到的靈敏度，且還具有標(biāo)記物制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、檢測重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點。

但是目前市場上暫時沒有利用trfia檢測h7n9的試劑盒以及方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種敏感性高、快速、簡便、易于推廣的、以檢測人、禽類、動物及外環(huán)境樣本中存在的h7n9病毒的時間分辨熒光免疫檢測試劑盒。

本發(fā)明的目的在于提供一種高致病性禽流感病毒h7n9的時間分辨熒光免疫分析方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種用于檢測禽流感病毒h7n9的單鏈抗體，其氨基酸序列為seqidno：1、seqidno：2或seqidno：3所示。

優(yōu)選的，編碼該單鏈抗體氨基酸序列的核苷酸序列為seqidno：4、seqidno：5或seqidno：6所示。

一種禽流感病毒h7n9的時間分辨熒光免疫檢測試劑盒，該試劑盒中含有上述單鏈抗體。

優(yōu)選的，該試劑盒中含有包被有單鏈抗體的酶聯(lián)板，所述單鏈抗體為上述單鏈抗體。

優(yōu)選的，該試劑盒中還含有鑭系元素離子標(biāo)記的抗體，所述抗體為上述單鏈抗體。

優(yōu)選的，鑭系元素離子選自eu³⁺或sm³⁺。

優(yōu)選的，該試劑盒中還含有洗滌液、分析緩沖液、增強液、h7n9病毒參考標(biāo)準(zhǔn)品。

優(yōu)選的，所述分析緩沖液中含有50mmol/lph7.8tris-hcl、0.9g/lnacl、0.02%w/vbsa、0.05%v/vtween-20和0.05%w/vnan3，余量為水。

優(yōu)選的，所述洗滌液中含有0.9%w/vnacl的50mmol/l的tris-hcl濃縮液，按照1：25倍稀釋使用。

優(yōu)選的，增強液購自perkinelmer公司，主要成份是β-nta，topo，tritonx-100和醋酸。

優(yōu)選的，所述h7n9病毒參考標(biāo)準(zhǔn)品為分別含有0.0、0.05、0.5、5、50、500ng/mlh7n9病毒抗原的溶液。

一種禽流感病毒h7n9的時間分辨熒光免疫檢測方法，用上述任一項所述的試劑盒進行檢測。

優(yōu)選的，具體檢測步驟如下：將包被有單鏈抗體的酶聯(lián)板加入h7n9病毒標(biāo)準(zhǔn)品或者待測樣品，再加入分析緩沖液室溫震蕩反應(yīng)，經(jīng)過洗滌液洗滌后，加入用分析緩沖液稀釋的鑭系元素離子標(biāo)記抗體100～200μl/孔，室溫震蕩反應(yīng)后用洗滌液洗滌，最后加入增強液進行熒光檢測。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法以及試劑盒具有敏感性高、快速、簡便、易于推廣的優(yōu)點，可及時檢測人、禽類、動物及外環(huán)境樣本中存在的h7n9病毒。首先可有效的防治h7n9病毒在禽類之間互相傳播而導(dǎo)致的大規(guī)模禽類感染事件，減少了禽類養(yǎng)殖人員的經(jīng)濟損失，也避免了人們產(chǎn)生不敢食用禽類的恐慌心理。其次，如果知道禽類帶毒，人們就會采取一定的防護措施，盡量不接觸帶毒禽類，降低了人類被h7n9感染的風(fēng)險，從而節(jié)約了由此產(chǎn)生的醫(yī)療費用和大量的人力、物力開支，也減少了人們擔(dān)心被感染的的憂慮和恐慌。

附圖說明

圖1為sds-page電泳檢測表達的噬菌體抗體a1、b7、f10；

圖2為h7n9-trfia標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

本發(fā)明的主要研究思路如下：

1、抗人禽流感病毒h7n9單鏈抗體噬菌體文庫的構(gòu)建

利用基因工程技術(shù)，從被禽流感病毒h7n9感染過的人禽流感康復(fù)患者的外周血淋巴細(xì)胞中，分離總mrna，rt-pcr擴增抗禽流感h7n9抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因，克隆抗體基因片段到噬菌粒載體上，使抗體片段以融合蛋白的形式表達在噬菌體的外殼蛋白中，形成一個匯集針對h7n9病毒的抗體庫，測定文庫的重組率和庫容。

2、抗h7n9病毒標(biāo)準(zhǔn)株抗體的篩選和制備

從上述構(gòu)建的抗人禽流感病毒h7n9單鏈抗體文庫和大容量人單鏈scfv抗體庫中，以親和吸附為原理，以滅活的人禽流感病毒h7n9標(biāo)準(zhǔn)株為靶蛋白，經(jīng)過2-3輪“吸附－洗脫－擴增”篩選，獲得能特異結(jié)合滅活h7n9病毒標(biāo)準(zhǔn)株的單鏈抗體分子，將噬菌體呈現(xiàn)的scfv分子進行可溶性表達，排除噬菌體載體對抗體分子活性的影響，純化分離抗體，測定序列，檢測抗體分子與病毒結(jié)合的特異性，檢測抗體分子與無關(guān)蛋白和類似滅活病毒的非特異性結(jié)合活性，測定抗體分子效價等。

3、雙抗夾心elisa法的建立及檢測條件的優(yōu)化

通過抗體配對實驗：粗配對和精確配對實驗篩選能在雙抗夾心elisa中應(yīng)用的scfv抗體分子。優(yōu)化雙抗夾心elisa檢測條件：確定包被抗體和檢測抗體濃度，確定洗滌液、洗滌強度和反應(yīng)條件。

4、trfia-elisa方法的建立及評估

待標(biāo)抗體分子的預(yù)處理，通過蛋白連接技術(shù)將鑭系元素標(biāo)記抗體分子，標(biāo)記抗體分子的純化、及濃度和抗原結(jié)合活性的鑒定，建立單標(biāo)記的時間分辨免疫熒光法模式，確定檢測性能指標(biāo)包括：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、精密度測定、靈敏度和特異性分析、穩(wěn)定性測試等。對試劑盒進行各項性能評價并進行陰陽性樣本的考核試驗。大規(guī)模生產(chǎn)檢測試劑盒。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1高致病性禽流感病毒h7n9的單鏈抗體噬菌體文庫的構(gòu)建、單鏈抗體的篩選以及誘導(dǎo)表達

（1）抗人禽流感病毒h7n9單鏈抗體噬菌體文庫的構(gòu)建

①總rna的分離：從禽流感h7n9愈后病人的10ml全血中，應(yīng)用血液rna提取試劑盒（qiagencorp）分離人總mrna。

②合成抗人禽流感病毒h7n9的抗體igg輕、重鏈基因的cdna第一鏈：以上步提取的rna為模板，為了增加擴增的特異性，選用逆轉(zhuǎn)錄引物（homoigg1-4h1f、homock-f和homocλ-f）特異性擴增獲得人igg1恒定區(qū)和輕鏈k、λ恒定區(qū)的cdna第一鏈。

上述逆轉(zhuǎn)錄引物序列為：

homoigg1-4h1f：5'-ccaccttggtgttgctgggc-3'（seqidno：7）；

homock-f：5'-actctcccctgttgaagctc-3'（seqidno：8）；

homocλ-f：5'-aagattctgtaggggccactgtc-3'（seqidno：9）。

③抗人禽流感病毒h7n9抗體可變區(qū)vh、vl基因pcr擴增：以上述所獲得的cdna為模板，設(shè)計引物并擴增人vh、vl基因。pcr擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，回收純化大小約350bp和320bp的特異性dna條帶進行純化，分別獲得vh、vl基因片段庫。

④vh和vl拼接得scfv基因片段

將純化獲得的vh、vl基因片段，通過連接子進行pcr拼接，獲得vh-連接子-vl基因片段，即單鏈抗體（singlechainfv，scfv）基因片段。

連接子序列為：5'-ggtggaggcggttcaggcggaggttctggcggtggcggatcg-3'（seqidno：10）。

⑤重組載體及重組菌的構(gòu)建

將上述獲得的scfv基因片段與噬菌體載體pcantab5e進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌tg1，獲得抗h7n9的單鏈抗基因庫。

⑥抗h7n9單鏈抗體噬菌體庫的構(gòu)建

將步驟⑤中獲得的重組大腸桿菌tg1加入2×yt-g培養(yǎng)基，混勻培養(yǎng)1h，補氨芐、葡萄糖、輔助噬菌體m13ko7共培養(yǎng)1h，5,000r/min離心10min沉淀感染細(xì)菌，用無菌生理鹽水洗滌一次，最后用10ml2×yt-ak培養(yǎng)基懸浮，37℃，250r/min培養(yǎng)過夜，將過夜菌5,000r/min離心10min沉淀菌體細(xì)胞，加入1ml的2×yt培養(yǎng)液溶解沉淀，0.45μm膜過濾，濾液即為抗h7n9噬菌體單鏈抗體庫，4℃放置備用。

（2）抗人禽流感病毒h7n9單鏈抗體的篩選

用禽流感h7n9抗原蛋白ha/np包被elisa板，對上述噬菌體單鏈抗體庫進行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12個與ha蛋白有結(jié)合活性噬菌體抗體庫od值為0.241～0.823，11個與np蛋白有結(jié)合活性噬菌體抗體庫od值為0.225～2.660。以上結(jié)果表明,本實驗構(gòu)建的抗人禽流感病毒h7n9的人源scfv噬菌體抗體庫，可以篩選出有效表達與禽流感h7n9ha/np蛋白特異性結(jié)合的可溶性單鏈抗體（scfv）。

為了保證本發(fā)明所制備的抗體能特異結(jié)合最新流行的禽流感毒株，本實驗以滅活的、滴度為1：32的2013年的h7n9標(biāo)準(zhǔn)株（a/shanghai/02/2013）為靶蛋白，去篩選抗h7n9噬菌體單鏈抗體庫，經(jīng)過3輪篩選，從第3輪洗脫液鋪的平皿上隨機挑選90個噬菌體抗體，擴大培養(yǎng)，用elisa方法檢測與h7n9（shanghai/02/2013/）的結(jié)合活性，結(jié)果顯示共篩選到12株噬菌體抗體克隆能與滅活的h7n9（shanghai/02/2013/）特異結(jié)合。

對上述篩選到的12株陽性噬菌體克隆進行pcr擴增，結(jié)果顯示每一種抗體分子都擴增到了長度為531bp的重鏈基因、369bp的輕鏈基因和942bp的輕鏈－連接子－重鏈的基因片段，說明篩選到的陽性噬菌體抗體克隆都插入了正確的重組抗體分子片段。測序結(jié)果顯示12株抗體序列中共包括了3條不同序列的單鏈抗體片段a1、b7和f10。

對篩選到的3個陽性單鏈抗體（scfv）分子進行插入片段的全序列測定并進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這3條單鏈抗體片段，在抗原表位33-41,77-80,154-157和197-200的氨基酸組成不同。（如表1所示）。

表1本發(fā)明3個單鏈抗體（scfv）的重鏈、輕鏈氨基酸的區(qū)別

a1的氨基酸序列如seqidno：1所示，b7的氨基酸序列如seqidno：2所示，f10的氨基酸序列如seqidno：3所示。編碼單鏈抗體a1、b7、f10氨基酸序列的核苷酸序列分別為seqidno：4、seqidno：5或seqidno：6所示。

（3）單鏈抗體的誘導(dǎo)表達及驗證

sds-page實驗步驟如下：

①用陽性噬菌體液10μl侵染200μl對數(shù)期的tg1菌(od600=0.43)，37℃放置30min,將菌液按照1∶100、1∶102和1∶104比例進行稀釋，涂布50μl稀釋液于tye平板上（含100μg/mlampicillin和1%glucose）37℃過夜培養(yǎng)生長；

②接種單克隆于5ml2×ty（含100μg/mlampicillin和1%glucose），37℃，220r/min搖床中生長到od600=0.43；

③加入5×10¹⁰輔助噬菌體于10ml上述培養(yǎng)液中，37℃水浴30min，5,000rpm離心10min，重懸沉淀于200ml的2×ty（含100μg/mlampicilli、50μg/mlkanamycin和0.1%glucose），30℃，220r/min搖床過夜培養(yǎng)；

④5,000rpm離心過夜菌液15min，收集上清加入體積比為20%的peg/nacl(polyethyleneglycol6000,2.5mol/lnacl)振蕩混勻，冰浴1h；

⑤5,000rpm離心30min，棄上清，用2mlpbs重懸沉淀，12,000rpm離心10min，收集上清為擴增到的陽性噬菌體抗體克隆，用sds-page電泳檢測表達的抗體。

檢測結(jié)果如圖1所示，從中可以看出3種陽性噬菌體中均能表達相應(yīng)的抗體蛋白a1、b7、f10，分子量約為30kd，大小與預(yù)期相符合。

（4）噬菌體單鏈抗體分子抑制血清中抗h7n9抗體與滅活h7n9抗原的結(jié)合活性

①抗h7n9抗體的陽性血清的稀釋：在血凝板的每孔中加入25ulpbs，加入25ul的抗h7n9抗體的陽性血清，做2倍系列稀釋血清，共做8個稀釋度；

②滅活抗原處理：稀釋滅活的a/shanghai/02/2013的h7n9標(biāo)準(zhǔn)株為3個血凝單位抗原，按1:1的濃度分別與噬菌體單鏈抗體（a1、b7、f10）溶液混合，37℃作用30min；

③免疫反應(yīng)：將25ul抗原抗體混合液加入血清孔中，混勻后室溫孵育20min，每孔加入50ul1%公雞紅細(xì)胞懸液，輕彈血凝板，使紅細(xì)胞與病毒充分混合。同時每個孔設(shè)置陽性對照（25ul抗原）和陰性對照（25ul噬菌體抗體溶液）；

④室溫孵育60min后，觀察紅細(xì)胞凝集抑制實驗，發(fā)現(xiàn)噬菌體單鏈抗體a1、b7、f10使陽性血清對h7n9抗原的抑制效價從1:180分別提高到1:680、1:340和1:640，噬菌體單鏈抗體（a1、b7、f10）結(jié)合了抗原的活性位點，從而部分抑制了抗原與血清中陽性抗體的結(jié)合活性。

實施例2高致病性禽流感病毒h7n9的時間分辨熒光免疫檢測試劑盒

h7n9的時間分辨熒光免疫檢測試劑盒含有以下成分：

（1）抗h7n9單鏈抗體

抗h7n9單鏈抗體選自上述實驗例1中所述的單鏈抗體a1、b7、f10中的一種。

（2）包被抗體的酶聯(lián)板

使用50mmol/l、ph9.6的碳酸鹽緩沖液將包被抗體b7（也可以選用a1或f10）稀釋成1～5μg/ml，然后100μl/孔加入到elisa板的每個板孔中，4℃過夜，棄去包被液，加入封閉液，200μl/孔，封閉過夜，棄去包被液，洗滌后拍干，真空-20℃冷凍保存。

（3）eu³⁺標(biāo)記的抗體

將0.5mg標(biāo)記抗體加入millipore公司的帶有濾膜的離心管中，8000r/min離心6min。再用標(biāo)記緩沖液（50mmol/l，naco3，ph9.0）重復(fù)洗滌6次。將200μl標(biāo)記抗體b7（也可以選用a1或f10）和50μgeu標(biāo)記試劑充分混勻，室溫震蕩過夜。標(biāo)記完成后用sephadexg-50層析柱分離純化，洗脫液（含0.9g/lnacl的50mmol/l的tris-hcl）洗脫，同時收集流出液（1ml/管），逐管測量吸光度（a280），合并峰管，測定蛋白含量，根據(jù)eu³⁺標(biāo)記試劑盒說明書所提供的公式測定標(biāo)記率和蛋白回收率。

（4）參考標(biāo)準(zhǔn)品

用含0.2%bsa（w/v），0.1%nan3（w/v），50mmol/l的tris-hcl（ph7.8）的標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將h7n9病毒抗原稀釋成0，0.05，0.5，5，50，500ng/ml作為系列參考標(biāo)準(zhǔn)溶液，每瓶1ml分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（5）分析緩沖液

分析緩沖液中含有50mmol/lph7.8tris-hcl、0.9g/lnacl、0.02%bsa（w/v）、0.05%tween-20（v/v）和0.05%nan3（w/v），余量為水。

（6）洗滌液

洗滌液中含有0.9g/lnacl的50mmol/l的tris-hcl濃縮液，按照1：25倍稀釋使用。

（7）增強液

增強液購自perkinelmer公司。主要成份是β-nta，topo，tritonx-100和醋酸。

實施例3高致病性禽流感病毒h7n9的時間分辨熒光免疫檢測方法

本發(fā)明定量檢測h7n9病毒的時間分辨熒光免疫檢測試劑盒的操作步驟為：向包被酶聯(lián)板上加入25μl參考標(biāo)準(zhǔn)品或者待測樣品，再加入200μl分析緩沖液，震蕩溫育1h，洗滌液洗滌4次，用分析緩沖液按1：（50～100）體積比稀釋的eu³⁺標(biāo)記抗體至1～5μg/ml，加入200μl/孔，震蕩溫育1h，洗滌液洗滌6次，最后加入增強液（perkinelmer公司）200μl/孔震蕩5min后在時間分辨熒光檢測儀上進行檢測。

下面對上述實施例中制備的試劑盒進行效果的檢測。

實施例4h7n9的時間分辨熒光免疫檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1）h7n9-trfia標(biāo)準(zhǔn)曲線，見附圖2，其相關(guān)系數(shù)r²=0.999，表明線性相關(guān)性良好。以零參考標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)本重復(fù)測量20次，計算其熒光均值x及標(biāo)準(zhǔn)差s，x+2s所得的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得出其靈敏度達到0.02ng/ml。

實施例5特異性實驗

選取多個與h7n9類似的病毒或者可能與h7n9同時出現(xiàn)的蛋白，當(dāng)作樣品，用本發(fā)明試劑盒測定，檢測結(jié)果如表2所示。

表2特異性實驗

由表2可知：本發(fā)明的試劑盒測定高濃度h7n9、h9n2、h7n7蛋白時，測定濃度均遠(yuǎn)低于理論濃度，說明本發(fā)明方法和試劑盒對的h7n9的特異性高，不會受h5n7、h9n2、h7n7等類似病毒的影響。

實施例6精密度實驗

采用本發(fā)明試劑盒對精確定量的高中低三個標(biāo)準(zhǔn)品濃度進行測定，各設(shè)置10個復(fù)孔，檢測結(jié)果如表3所示。

表3精密度實驗檢測結(jié)果

由表3可知：本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均≤10%，符合試劑盒規(guī)定要求。

實施例7精確度實驗（回收實驗）

按照常規(guī)方法進行回收實驗，結(jié)果見表4。

表4回收實驗

由表4可知：高中低三個濃度的回收率在100.38～101.48%之間，平均回收率為100.87%。

實施例8健全性實驗

把高濃度的h7n9病毒樣品按照1：（2～64）比例稀釋后用本發(fā)明試劑盒測定，換算后的h7n9病毒含量非常接近。用上述比例稀釋的病毒樣品代替h7n9病毒參考標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其斜率與標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率基本一致，表明本發(fā)明檢測h7n9的方法和試劑盒具有良好的健全性。

實施例9臨床應(yīng)用實驗

取中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院門診356例流感病人血清，其中21例為確診的h7n9病毒感染者，但檢測時并未標(biāo)出h7n9感染樣本和普通流感樣本。

具體檢測步驟：取實施例2中所述試劑盒中包被好的酶聯(lián)板，加入25μl參考標(biāo)準(zhǔn)品或者待測血清，再加入200μl分析緩沖液，震蕩溫育1h，洗滌液洗滌4次，再加入以分析緩沖液1：50稀釋的eu³⁺標(biāo)記抗體200μl/孔，震蕩溫育1h，洗滌液洗滌6次，最后加入增強液200μl/孔震蕩5min后在時間分辨熒光檢測儀上進行檢測。

結(jié)果示檢測出19例陽性樣本與確診的h7n9病毒感染者相符，2例陽性樣本實際為普通流感樣本，陽性檢測準(zhǔn)確率為90.5%。

實施例10臨床應(yīng)用實驗

取一養(yǎng)雞場的100只經(jīng)檢驗合格的健康肉雞的血清樣本，標(biāo)記備用；取188只發(fā)熱、呼吸困難、食欲不振等癥狀的病雞的血清樣本，分別標(biāo)記備用。

具體檢測步驟：同實施例9。

結(jié)果顯示100個健康肉雞h7n9陽性樣本個數(shù)為1，陰性樣本個數(shù)為99，檢測準(zhǔn)確率為99.0%；188個病雞h7n9陽性樣本個數(shù)為47，陰性樣本個數(shù)為131；對47個h7n9陽性樣本進行熒光定量pcr檢測，結(jié)果顯示全為h7n9陽性；對131個h7n9陰性樣本進行熒光定量pcr檢測，結(jié)果顯示有9個h7n9陽性樣本，122個h7n9陰性樣本，檢測準(zhǔn)確率為93.1%；總檢測準(zhǔn)確率為96.05%。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110>廣州優(yōu)迪生物科技有限公司

<120>一種用于檢測禽流感病毒h7n9的時間分辨熒光免疫分析方法

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