本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠肝星狀細(xì)胞分離方法。

背景技術(shù)：

肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells，hscs)是肝臟特有的一種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，約占肝臟細(xì)胞總數(shù)的8％-13％，占肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的33％，占肝臟總體積的1.4％，為單層的貼壁生長型細(xì)胞，細(xì)胞呈星形，紡錘形，多邊形，梭形，有偽足，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含較多脂滴，亦稱肝貯脂細(xì)胞。肝星狀細(xì)胞作為肝臟合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞群，不僅能分泌蛋白多糖、糖蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，還能合成一定量的膠原酶以維持正常的基底膜結(jié)構(gòu)，還能通過其突起的收縮參與肝竇的微循環(huán)調(diào)節(jié)同。肝損傷導(dǎo)致的hscs的激活、增殖及轉(zhuǎn)化是肝纖維化過程中的重要環(huán)節(jié)，因此肝星狀細(xì)胞在探討新的抗肝纖維化治療措施，對降低慢性肝病的發(fā)生率和死亡率具有不可估量的理論意義。目前常用的肝臟原位灌注方法分離的肝星狀細(xì)胞?；祀skupffer細(xì)胞，獲得的星狀細(xì)胞量少，活性低，而且得到的為靜止?fàn)顟B(tài)下的肝星狀細(xì)胞，不能被激活。本發(fā)明所提供得肝星狀細(xì)胞的分離方法可以獲得產(chǎn)量高、純度高、活性高且能被激活的大鼠肝星狀細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種獲得產(chǎn)量高、純度高、活性高且能被激活的大鼠肝星狀細(xì)胞分離的方法。

為了解決上述所涉及到的問題，本發(fā)明采取如下方法獲得大鼠肝星狀細(xì)胞：

大鼠肝星狀細(xì)胞分離方法的步驟包括：(a)腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，于大鼠腹腔開口以暴露肝臟及門靜脈；(b)靜脈注射肝素，預(yù)熱灌流液灌注肝臟；(d)取充分灌注后的肝臟，剪碎后于預(yù)熱消化液中震蕩消化；(e)消化后的肝組織經(jīng)篩網(wǎng)過濾，低速離心吸取上清，再次離心獲得細(xì)胞沉淀，清洗液清洗一次；(f)將獲得的細(xì)胞沉淀重懸，經(jīng)nycoden分離純化；(g)細(xì)胞清洗數(shù)次，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，鋪板培養(yǎng)；(h)細(xì)胞免疫熒光鑒定大鼠肝星狀細(xì)胞。

可選的大鼠為體重400-600g，飼養(yǎng)6-8個(gè)月的sd大鼠。

可選的肝素注射位置為近左腎位置且脂肪組織較多的下腔靜脈處。

可選的灌流液1、2、3分別為無ca²⁺、mg²⁺的gbss液，含0.25％-0.3％(m/v)鏈霉蛋白酶e的gbss液、含0.025％-0.03％(m/v)iv型膠原酶的gbss液。

可選的灌流液的流速為8-12ml/min，灌流時(shí)間為12-18min，預(yù)熱溫度為30-37℃。

可選的酶消化液為含0.03％-0.035％的(m/v)鏈霉蛋白酶e和0.0025％-0.003％的(m/v)dnasei的gbss液，消化液預(yù)熱溫度為30-37℃，消化時(shí)間為30-40min，震蕩的速度為190-200rpm/min，消化溫度為37℃。

可選的過濾用的篩網(wǎng)為100目的篩網(wǎng)，低速離心時(shí)的轉(zhuǎn)速為50-100g/min，離心時(shí)間為2-5min。

可選的清洗細(xì)胞時(shí)離心的轉(zhuǎn)速為1500-1800rpm/min，離心時(shí)間為4-8min。

可選的nycoden分離液的終濃度為8-11％，離心機(jī)設(shè)置為緩升緩降程序，離心轉(zhuǎn)速為800-1500g/min，離心時(shí)間為20-30min，離心溫度為20-25℃。

可選的完全培養(yǎng)基為含5％fcs和15％fbs的dmem培養(yǎng)基，接種時(shí)所用的細(xì)胞瓶及孔板均為未包被的細(xì)胞瓶及孔板。

本發(fā)明提供一種大鼠肝星狀細(xì)胞分離的方法，三種灌流液依次灌注，灌流液使用前均預(yù)熱，維持了膠原酶及鏈霉蛋白酶的溫度，使其活性保持最佳，保證了肝臟得到充分灌注，提高了肝星狀細(xì)胞的產(chǎn)量。

進(jìn)一步的，本發(fā)明選用低速離心及nycodenz密度梯度離心結(jié)合的方法，除去混雜的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞及kupffer細(xì)胞，提高了肝星狀細(xì)胞的純度。

本發(fā)明解決了肝星狀細(xì)胞分離過程純度低及產(chǎn)量少的問題，使獲得的大鼠肝星狀細(xì)胞產(chǎn)量高、純度高、活性高且能被激活。

附圖說明

圖1培養(yǎng)1d的細(xì)胞圖片(100×)

圖2培養(yǎng)7d的細(xì)胞圖片(100×)

圖3培養(yǎng)1d的細(xì)胞免疫熒光鑒定圖片

圖4培養(yǎng)7d的細(xì)胞免疫熒光鑒定圖片

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)勢更清新地展現(xiàn)，現(xiàn)將具體實(shí)施方式進(jìn)一步闡述。此處所闡述的具體實(shí)施方式僅針對本發(fā)明進(jìn)行解釋，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明選擇飼養(yǎng)6-8個(gè)月，體重為400-600g的雄性sd大鼠，分離肝星狀細(xì)胞。具體操作如下：

1、取sd雄性大鼠，腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，u型剖開大鼠腹腔以暴露肝臟及門靜脈；

2、于近左腎位置且脂肪組織較多的下腔靜脈處注射0.2ml的肝素(1500u/l)，并放置消毒后的棉球；

3、將靜脈留置針平行插入門靜脈，拔出針芯，于近肝門處結(jié)扎固定留置管，使針尖與門靜脈分支及針尖與結(jié)扎線距離分別在一公分位置，將留置針針管連接至蠕動(dòng)泵；

4、30-37℃預(yù)熱灌流液1灌流至肝臟脹大，并迅速剪開下腔靜脈放血，可見肝臟變?yōu)橥咙S色；灌流液1為無ca²⁺、mg²⁺的gbss液，灌流速度為8-12ml/min，灌流時(shí)間為12-18min；灌注過程中用步驟2中放置的棉球控制肝的充盈狀態(tài)；

5、30-37℃預(yù)熱灌流液2繼續(xù)灌注；灌流液2為含0.25％-0.3％(m/v)鏈霉蛋白酶e的gbss液，灌流速度為8-12ml/min，灌流時(shí)間為12-18min；灌注過程中用步驟2中放置的棉球控制肝的充盈狀態(tài)；

6、30-37℃預(yù)熱灌流液3繼續(xù)灌注；灌流液3為含0.025％-0.03％(m/v)iv型膠原酶的gbss液，灌流速度為8-12ml/min，灌流時(shí)間為12-18min；灌注過程中用步驟2中放置的棉球控制肝的充盈狀態(tài)；

7、迅速分離肝臟，撕開肝包膜，剪刀充分剪碎肝臟，并轉(zhuǎn)移至預(yù)熱消化液中恒溫震蕩消化30-40min；其中消化液為含0.03％-0.035％的(m/v)鏈霉蛋白酶e和0.0025％-0.003％的(m/v)dnasei的gbss液，震蕩速度為180-220rpm/min；

8、將消化后的肝臟組織依次經(jīng)80目、100目、200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，20-25℃低速離心2min，轉(zhuǎn)速為100-150g/min；

9、吸管小心吸取上層懸液，避免吸到臨近沉淀的液體，并將懸液轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，20-25℃離心5min，轉(zhuǎn)速為1500-1800rpm/min；

10、再用吸管小心吸取上層懸液，加入適量體積的清洗液，混勻后，20-25℃離心5min，轉(zhuǎn)速為1500-1800rpm/min，清洗液為含0.08％的(m/v)dnasei的gbss液；

11、再用吸管小心吸取上層懸液，加入適量體積的清洗液，混勻后，20-25℃ 離心5min，轉(zhuǎn)速為1500-1800rpm/min，清洗液為含0.08％的(m/v)dnasei的gbss液；

12、吸棄部分上清，剩余5-6ml液體，重懸沉淀，并加入一定體積且充分混勻的濃度為30％的nycoden至終濃度為8％-11％，在上層緩慢勻速加入2ml含dnasei的gbss液，其中30％的nycoden經(jīng)0.22μm過濾除菌，使用前充分混勻，避光保存；

13、20-25℃離心20min，轉(zhuǎn)速為800-1500g/min，設(shè)置離心機(jī)模式為緩升緩降；

14、取出離心管，吸管吸取中間白膜層至無菌離心管，加gbss液補(bǔ)足至50ml，充分混勻；

15、20-25℃離心5min，轉(zhuǎn)速為1800rpm/min；

16、棄去上清，再加入50ml的gbss液，重復(fù)步驟15；

17、用電子槍充分吸棄上清，加入預(yù)熱的含5％fcs和15％fbs和1％雙抗的dmem完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于未包被的細(xì)胞瓶及孔板中，置于37℃、5％(m/v)的co2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)增殖；

18、細(xì)胞免疫熒光鑒定：將大鼠肝星狀細(xì)胞種到放置于24孔板內(nèi)的蓋玻片上，體外培養(yǎng)1-7天，取出蓋玻片，pbs洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定20min，pbs洗3次，0.2％滲透液triton-100室溫下孵育15min，pbs洗3次，5％bsa室溫封閉1h，吸去封閉液。加入α-sma抗體于4℃過夜孵育，pbs洗3次。滴加羊抗鼠pe熒光二抗igg(1∶100)，在室溫下置于濕盒內(nèi)孵育45min，pbs洗3次，自然晾干后在顯微鏡下觀察。

以上已經(jīng)對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，但本發(fā)明創(chuàng)造不限定于上述實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)作出任何修改，等同替換和改進(jìn) 等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。