本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是核酸擴(kuò)增領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)管，特別是一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管。此外，本發(fā)明還涉及一種擴(kuò)增核酸的方法，其包括使用本發(fā)明的可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管。此外，本發(fā)明還涉及一種包含所述反應(yīng)管的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置。此外，本發(fā)明還涉及包含所述反應(yīng)管的試劑盒，以及所述反應(yīng)管用于制備試劑盒的用途。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)，是一種體外快速擴(kuò)增DNA的技術(shù)，每個(gè)循環(huán)包括變性、退火和延伸三個(gè)過程。首先，在大約95℃的高溫下加熱雙鏈DNA樣品，雙鏈間的氫鍵會(huì)斷裂，使得DNA熱分解成兩條互補(bǔ)的單鏈DNA分子，這一過程稱為高溫解鏈反應(yīng)；然后，溫度迅速降到大約50-65℃的范圍內(nèi)，在這個(gè)溫度下單鏈DNA與引物按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合，這一過程稱為低溫退火反應(yīng)；退火反應(yīng)結(jié)束后，溫度要迅速升高到72℃左右進(jìn)行延伸反應(yīng)，在DNA聚合酶以及適當(dāng)鎂離子濃度的條件下，從引物的3’端開始結(jié)合單核苷酸，從而形成一條新的DNA。經(jīng)過一個(gè)這樣的過程，原來的一個(gè)DNA雙鏈分子就形成了兩個(gè)DNA分子，數(shù)量增加了一倍。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，目的核酸分子的數(shù)目擴(kuò)增一倍，并且這些新形成的雙鏈又可以作為下次循環(huán)的模板，經(jīng)過30-40個(gè)循環(huán)，目的核酸分子數(shù)目擴(kuò)增到原來的近10⁹倍。PCR是體外大量獲得目的DNA片段的方法，便于對(duì)核酸分子做進(jìn)一步的分析和檢驗(yàn)。

目前，主流的PCR擴(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)裝置一般以溫控金屬塊加熱塑料制成的PCR反應(yīng)管，通過金屬塊的加熱、冷卻，達(dá)到平衡溫度后將 熱量通過反應(yīng)管傳遞至PCR反應(yīng)液。這種裝置的缺陷是：反應(yīng)體積較大，即系統(tǒng)通常具有較大的體積和熱容，常規(guī)PCR完成30個(gè)循環(huán)一般需要2-3小時(shí)，其中大部分時(shí)間消耗于加熱和冷卻過程，即將金屬塊達(dá)到平衡溫度并將熱通過反應(yīng)管傳遞至PCR反應(yīng)液，因此，PCR難以實(shí)現(xiàn)快速高效。

2002年Madhavi Krishnan等人報(bào)導(dǎo)的雷諾本納德(Rayleigh-Benard)PCR(簡(jiǎn)稱RB-PCR)方法，基于熱傳導(dǎo)及熱對(duì)流原理，利用上下兩個(gè)恒溫?zé)嵩唇⒕咦韵露蠝囟忍荻鹊姆忾]反應(yīng)內(nèi)腔，并因此使腔內(nèi)的PCR試劑發(fā)生自發(fā)的對(duì)流運(yùn)動(dòng)反復(fù)流經(jīng)不同溫度區(qū)域從而完成擴(kuò)增。該方法擴(kuò)增速度快、儀器較傳統(tǒng)PCR儀簡(jiǎn)單，但擴(kuò)增試劑須充滿整個(gè)封閉腔，造成上樣難度大、易泄漏、易污染等問題。

臺(tái)灣大學(xué)Chou等在RB-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上做了改進(jìn)，將封閉的反應(yīng)內(nèi)腔變成開放式的具特定規(guī)格的反應(yīng)試管，并利用單一恒溫?zé)嵩醇訜嵩嚬艿撞框?qū)動(dòng)管內(nèi)試劑自發(fā)循環(huán)，從而完成擴(kuò)增。該方法解決了RB-PCR易泄漏、污染的問題。

但現(xiàn)有的對(duì)流PCR擴(kuò)增方法均存在共同的缺陷，即管內(nèi)液體流動(dòng)路徑復(fù)雜。管內(nèi)流路為近同心橢圓型的多層流路(圖1a)，這種多層次的復(fù)雜流路在擴(kuò)增中存在以下問題：

1.擴(kuò)增效率偏低：

(a)變性的效率：如圖1a所示，從不低于模板或擴(kuò)增子所需的變性溫度的D1區(qū)經(jīng)過的模板或擴(kuò)增子，可發(fā)生有效的變性；而從位置高于D1區(qū)的D2區(qū)經(jīng)過的模板或擴(kuò)增子，則無法發(fā)生有效的變性反應(yīng)，導(dǎo)致總體變性效率偏低；

(b)退火的效率：如圖1a所示，從不高于模板或擴(kuò)增子所需的退火溫度的A1區(qū)經(jīng)過的單鏈模板及引物，才有可能發(fā)生有效的退火反應(yīng)；而從位置低于A1區(qū)的A2區(qū)經(jīng)過的單鏈模板及引物，則無法發(fā)生有效的退火反應(yīng)，導(dǎo)致總體退火效率偏低。

2.擴(kuò)增的特異性不好：

在對(duì)流PCR中，因沒有固定溫度的退火區(qū)域及時(shí)段，因此通常會(huì) 通過溫度場(chǎng)及流場(chǎng)的控制進(jìn)而使得反應(yīng)管上端的溫度低于引物的退火溫度，用以保障引物能夠盡可能充分的退火。但當(dāng)單鏈模板和(/或)引物在環(huán)流中經(jīng)過過低的溫度區(qū)域時(shí)，會(huì)導(dǎo)致退火的特異性降低，容易形成引物內(nèi)部或引物間或引物與模板(/擴(kuò)增子)之間的非特異性的配對(duì)，并進(jìn)而發(fā)生延伸反應(yīng)，形成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.平行反應(yīng)在擴(kuò)增中可能存在管間差異：

(a)終點(diǎn)定性檢測(cè)，在結(jié)果上主要表現(xiàn)為擴(kuò)增效率及產(chǎn)物組成的差異：上述第2點(diǎn)中描述的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性后，又會(huì)變成下一輪非特異性擴(kuò)增的模板，從而使得非特異性擴(kuò)增不斷放大，并與正確的擴(kuò)增競(jìng)爭(zhēng)引物、酶、dNTP等反應(yīng)組分，使得正確擴(kuò)增受到抑制，反應(yīng)效率降低。而這種非特異性反應(yīng)是否發(fā)生、發(fā)生的早晚、發(fā)生的比例都是不受控制的，即存在一定的隨機(jī)性，這就會(huì)導(dǎo)致發(fā)生了此類非特異性擴(kuò)增的反應(yīng)管的擴(kuò)增效率的不一致。非特異性擴(kuò)增發(fā)生的較早、發(fā)生比例較高的反應(yīng)管，其效率低于非特異性擴(kuò)增發(fā)生的較晚、發(fā)生比例較低的反應(yīng)管，并均低于未發(fā)生非特異性擴(kuò)增的反應(yīng)管。同樣的，非特異性擴(kuò)增發(fā)生的較早、發(fā)生比例較高的反應(yīng)管，其管內(nèi)產(chǎn)物組成中有較高比例的非特異性產(chǎn)物，非特異性擴(kuò)增發(fā)生的較晚、發(fā)生比例較低的反應(yīng)管，其管內(nèi)產(chǎn)物組成中有較低比例的非特異性產(chǎn)物，未發(fā)生非特異性擴(kuò)增的，其管內(nèi)產(chǎn)物均為正確擴(kuò)增產(chǎn)物。

(b)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，在結(jié)果上主要表現(xiàn)為單位時(shí)間內(nèi)有效擴(kuò)增效率的差異：也就是說，無法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。同上述1、2兩點(diǎn)的描述，當(dāng)對(duì)流PCR反應(yīng)起始，雙鏈模板能否經(jīng)過有效地變性區(qū)域、單鏈模板和引物能否經(jīng)過有效地退火區(qū)域、以及退火中是否發(fā)生了非特異性的反應(yīng)，都是不受控制的，因此在反應(yīng)起始就有可能造成不同管的產(chǎn)物組成存在差異，這些差異不僅會(huì)導(dǎo)致上述3(a)中描述的問題，還使得單位時(shí)間內(nèi)，不同反應(yīng)管的產(chǎn)物(模板)數(shù)量存在差異，進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期的時(shí)間點(diǎn)就會(huì)不同，因此無法用傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行模板的定量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管以及核酸擴(kuò)增方法，以解決現(xiàn)有的對(duì)流PCR技術(shù)中存在的擴(kuò)增效率偏低、特異性不好、管間差異大、定量不準(zhǔn)確等問題。

本發(fā)明的第一方面提供一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)管，包括一端封閉的管體，所述管體包括儲(chǔ)液區(qū)以及位于儲(chǔ)液區(qū)下方的核酸擴(kuò)增區(qū)，其特征在于，所述核酸擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)置有上下懸空的插片。當(dāng)反應(yīng)管內(nèi)注入試劑時(shí)，通過插片的物理阻隔，使得反應(yīng)管內(nèi)試劑在外力或內(nèi)力的作用下，形成圍繞插片上方及下方的環(huán)流路徑。

優(yōu)選地，所述插片沿管體的中軸線設(shè)置，并且插片的兩側(cè)與核酸擴(kuò)增區(qū)的內(nèi)壁連接。插片沿管體的中軸線方向?qū)⒑怂釘U(kuò)增區(qū)分隔成第一區(qū)域和第二區(qū)域，第一區(qū)域和第二區(qū)域在核酸擴(kuò)增區(qū)的上部和下部連通。

優(yōu)選地，所述插片下端與管體底部之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)高度的1/2；更優(yōu)選地，所述插片下端與管體底部之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)高度的1/3；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述插片下端與管體底部之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于等于4mm。

優(yōu)選地，所述插片上端與核酸擴(kuò)增區(qū)上端之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)高度的1/2；更優(yōu)選地，所述插片上端與核酸擴(kuò)增區(qū)上端之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)高度的1/3；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述插片上端與核酸擴(kuò)增區(qū)上端之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于等于3mm。

優(yōu)選地，所述管體的底部通過與管體相互配合的底塞實(shí)現(xiàn)一端封閉。優(yōu)選地，所述管體與底塞之間通過旋轉(zhuǎn)螺紋結(jié)構(gòu)，或環(huán)狀卡口結(jié)構(gòu)，或凸點(diǎn)鎖扣結(jié)構(gòu)相互密閉連接，也可以采用現(xiàn)有技術(shù)中其它的密閉連接方式。

優(yōu)選地，所述管體還包括與其配合的管蓋。優(yōu)選地，所述管體與管蓋之間通過旋轉(zhuǎn)螺紋結(jié)構(gòu)，或環(huán)狀卡口結(jié)構(gòu)，或凸點(diǎn)鎖扣結(jié)構(gòu)相互 密閉連接，當(dāng)然也可以采用現(xiàn)有技術(shù)中其它的密閉連接方式。

優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)的高度/內(nèi)徑的比值為3～12，更優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)的高度/內(nèi)徑的比值為6～9。

優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)的容積為30～200μl，更優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)的容積為40～150μl。

優(yōu)選地，所述管體和插片由耐熱材料制成，所述耐熱材料例如選自玻璃、聚碳酸酯、聚丙烯、聚醚砜和聚砜。

此外，優(yōu)選地，所述管體的內(nèi)壁可通過牛血清白蛋白(BSA)或硅烷化試劑等做鈍化處理，從而降低對(duì)核酸及反應(yīng)試劑中某些成分的吸附。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)的內(nèi)腔為上下內(nèi)徑相等的柱狀中空結(jié)構(gòu)，也可以為橫截面上寬下窄的錐狀中空結(jié)構(gòu)或多層梯形中空結(jié)構(gòu)，核酸的擴(kuò)增、RNA的轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)檢測(cè)信號(hào)的采集均位于此區(qū)域。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增區(qū)上可設(shè)有可見的體積刻度標(biāo)識(shí)。

本發(fā)明的另一方面提供一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置，其包括本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的反應(yīng)管和一個(gè)或多個(gè)可提供或移走熱量的溫度控制裝置，所述溫度控制裝置設(shè)置于所述反應(yīng)管的外部或內(nèi)部。

本發(fā)明的還一方面提供一種試劑盒，其包含本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的反應(yīng)管。

本發(fā)明的還一方面提供一種擴(kuò)增樣品中目的核酸的方法，其包括使用本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的反應(yīng)管或本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置，

優(yōu)選地，所述核酸是DNA或RNA；

優(yōu)選地，所述擴(kuò)增是PCR反應(yīng)或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

1)將核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑注入本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的反應(yīng)管中；

2)通過震動(dòng)、離心或其他方式，使反應(yīng)試劑完全填充核酸擴(kuò)增區(qū)；任選地，還包括用不易揮發(fā)的物質(zhì)(例如石蠟油或低熔點(diǎn)的蠟)覆蓋 于試劑表面或用管蓋封閉反應(yīng)管的步驟；

3)用溫度控制裝置對(duì)所述反應(yīng)管的特定部位提供或移走熱量，以完成RNA逆轉(zhuǎn)錄和/或DNA擴(kuò)增反應(yīng)；

4)任選地，在進(jìn)行核酸擴(kuò)增的同時(shí)或擴(kuò)增結(jié)束后，還包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的步驟。

本發(fā)明還提供本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的反應(yīng)管或本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置用于核酸擴(kuò)增的用途。

本發(fā)明還提供本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的反應(yīng)管用于制備試劑盒的用途，所述試劑盒用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明通過插片的物理阻隔，使得管內(nèi)試劑在外力或內(nèi)力驅(qū)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)中，僅能從插片的下方及上方經(jīng)過，并通過一個(gè)或多個(gè)設(shè)于所述反應(yīng)管的外部或內(nèi)部的溫度控制裝置，對(duì)反應(yīng)管的特定區(qū)域進(jìn)行加熱，使得環(huán)流從插片下方一定區(qū)域經(jīng)過時(shí)，均可發(fā)生變性反應(yīng)，環(huán)流從插片上方區(qū)域經(jīng)過時(shí)，均可發(fā)生退火反應(yīng)。該種環(huán)流運(yùn)動(dòng)路徑及溫度控制方式對(duì)PCR反應(yīng)帶來的好處是：

1.提高擴(kuò)增效率：(a)提高變性的效率：如圖1b所示，受到插片2的物理阻隔，環(huán)流運(yùn)動(dòng)到反應(yīng)管下端時(shí)，僅能從插片2的下方的D1區(qū)經(jīng)過，而該區(qū)域在所述溫度控制裝置的作用下，可維持高于變性所需的溫度，因此，環(huán)流從反應(yīng)管插片2下方的D1區(qū)經(jīng)過時(shí)，均可發(fā)生有效的變性反應(yīng)；(b)提高退火的效率：如圖1b所示，受到插片2的物理阻隔，環(huán)流運(yùn)動(dòng)到反應(yīng)管上端時(shí)，僅能從插片2上方的A1區(qū)經(jīng)過，而該區(qū)域在所述溫度控制裝置的作用下，可維持滿足特定引物退火所需的溫度，因此，環(huán)流從反應(yīng)管插片2上方經(jīng)過時(shí)，均可發(fā)生有效的退火反應(yīng)。

2.保障擴(kuò)增的特異性：如圖1b所示，受到插片2的物理阻隔，環(huán)流運(yùn)動(dòng)到反應(yīng)管上端后，僅能從插片2上方的A1區(qū)經(jīng)過，而插片2上方區(qū)域在所述溫度控制裝置的作用下，可維持正好滿足特定引物退火所 需的溫度，而不會(huì)過低于特定引物的退火溫度，因此，環(huán)流從該區(qū)域經(jīng)過時(shí)，引物內(nèi)部或引物間或引物與模板(/擴(kuò)增子)之間不會(huì)形成非特異性的配對(duì)，并造成非特異性擴(kuò)增。

3.提高管間的一致性：

(a)通過提高特異性，保障擴(kuò)增的一致性：如上段第2點(diǎn)所述，因不會(huì)再隨機(jī)的形成非特異性產(chǎn)物，并與正確擴(kuò)增競(jìng)爭(zhēng)引物、酶、dNTP等反應(yīng)組分，因此，正確擴(kuò)增的效率不會(huì)受到非特異性擴(kuò)增的影響，因而可提高管間在單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增的一致性；(b)通過提高擴(kuò)增效率，保障擴(kuò)增的一致性：對(duì)流PCR反應(yīng)起始后，受到反應(yīng)管內(nèi)插片2的物理阻隔作用及所述溫度控制裝置控制，管內(nèi)的雙鏈模板均能經(jīng)過有效地變性區(qū)域發(fā)生解鏈反應(yīng)，且環(huán)流運(yùn)動(dòng)到反應(yīng)管上端時(shí)，單鏈模板和引物均能經(jīng)過有效地退火區(qū)域發(fā)生退火反應(yīng)，不會(huì)再因隨機(jī)的環(huán)流路徑而造成無效循環(huán)(即環(huán)流運(yùn)動(dòng)至下方時(shí)，未從滿足變性條件的溫度區(qū)域經(jīng)過，和(/或)環(huán)流運(yùn)動(dòng)至上方時(shí)，未從滿足退火條件的溫度區(qū)域經(jīng)過)，從而保障管間在單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增的一致性。(c)擴(kuò)增的一致性得到了保障，因而可提高平行反應(yīng)中，終點(diǎn)檢測(cè)時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的一致性；及平行反應(yīng)中，單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增的一致性，并進(jìn)而使得對(duì)流PCR擴(kuò)增也可通過實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量。

下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。

附圖說明

圖1a示意了自然對(duì)流狀態(tài)下的環(huán)流軌跡；

圖1b示意了通過本發(fā)明的反應(yīng)管控制后的液體環(huán)流軌跡；

圖2a所示為一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管的正視圖；

圖2b所示為一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管的側(cè)視圖；

圖2c所示為一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管的正視分解圖；

圖2d所示為一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管的俯視圖；

圖3示意了一種對(duì)可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管進(jìn)行加熱及熒光檢測(cè)的裝置圖；

圖4所示為應(yīng)用本發(fā)明的反應(yīng)管對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果；

圖5所示為應(yīng)用本發(fā)明的反應(yīng)管對(duì)RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果；

圖6a所示為使用一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管進(jìn)行核酸擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果；

圖6b所示為使用無環(huán)流控制功能反應(yīng)管進(jìn)行核酸擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果；

圖7a所示為不同擴(kuò)增時(shí)間下，使用一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管進(jìn)行核酸擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果；

圖7b所示為不同擴(kuò)增時(shí)間下，使用無環(huán)流控制功能反應(yīng)管進(jìn)行核酸擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果；

圖8a所示為使用一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管進(jìn)行核酸擴(kuò)增并同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的結(jié)果；

圖8b所示為使用無環(huán)流控制功能反應(yīng)管進(jìn)行核酸擴(kuò)增，并同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。

如本文中所使用的，術(shù)語“擴(kuò)增”應(yīng)從廣義上來理解，其包括從 RNA或DNA獲得DNA的過程，并且包括但不限于PCR反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以及其各種變型(例如實(shí)時(shí)PCR反應(yīng))。

如本文中所使用的，術(shù)語“核酸”包括核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(RNA)。

圖1a所示意的即為在自然對(duì)流狀態(tài)下，反應(yīng)管內(nèi)環(huán)流的運(yùn)動(dòng)軌跡。反應(yīng)管內(nèi)只需在特定區(qū)間內(nèi)形成一定的溫度差異，即可形成對(duì)流。因此，在反應(yīng)管的空間中，環(huán)流軌跡并非是單一的，而是呈現(xiàn)多層次、多方向的特點(diǎn)。那么，在這種多層環(huán)流中，(1)從不低于模板或擴(kuò)增子所需的變性溫度的D1區(qū)經(jīng)過的模板或擴(kuò)增子，可發(fā)生有效的變性；而從位置高于D1區(qū)的D2區(qū)經(jīng)過的模板或擴(kuò)增子，則無法發(fā)生有效的變性反應(yīng)，導(dǎo)致總體變性效率偏低；(2)從不高于模板或擴(kuò)增子所需的退火溫度的A1區(qū)經(jīng)過的單鏈模板及引物，才有可能發(fā)生有效的退火反應(yīng)；而從位置低于A1區(qū)的A2區(qū)經(jīng)過的單鏈模板及引物，則無法發(fā)生有效的退火反應(yīng)，導(dǎo)致總體退火效率偏低；(3)當(dāng)單鏈模板和(/或)引物在環(huán)流中經(jīng)過過低的溫度區(qū)域時(shí)，會(huì)導(dǎo)致退火的特異性降低，容易形成引物內(nèi)部或引物間或引物與模板(/擴(kuò)增子)之間的非特異性的配對(duì)，并進(jìn)而發(fā)生延伸反應(yīng)，形成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)上述非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性后，又會(huì)變成下一輪非特異性擴(kuò)增的模板，從而使得非特異性擴(kuò)增不斷放大，并與正確的擴(kuò)增競(jìng)爭(zhēng)引物、酶、dNTP等反應(yīng)組分，使得正確擴(kuò)增受到抑制，反應(yīng)效率降低。而這種非特異性反應(yīng)是否發(fā)生、發(fā)生的早晚、發(fā)生的比例都是不受控制的，即存在一定的隨機(jī)性，這就會(huì)導(dǎo)致發(fā)生了此類非特異性擴(kuò)增的反應(yīng)管的擴(kuò)增效率的不一致；(5)上述擴(kuò)增的不一致，在實(shí)時(shí)定量檢測(cè)中將表現(xiàn)為單位時(shí)間內(nèi)有效擴(kuò)增效率的差異，從而導(dǎo)致無法應(yīng)用傳統(tǒng)熒光定量PCR方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)核酸模板進(jìn)行相對(duì)定量。

圖1b所示的環(huán)流軌跡，為在自然對(duì)流的基礎(chǔ)之上，通過物理阻隔使環(huán)流路徑得到控制，而形成的單方向、相對(duì)集中、規(guī)則的環(huán)流軌跡。在該種可控制液體環(huán)流路徑的反應(yīng)管中，因反應(yīng)管內(nèi)的插片2的物理性 阻隔，環(huán)流運(yùn)動(dòng)到反應(yīng)管下端時(shí)，僅能從插片2的下方經(jīng)過，而該區(qū)域在溫度控制裝置的作用下，可維持高于變性所需的溫度，因此，環(huán)流從反應(yīng)管插片2下方經(jīng)過時(shí)，均可發(fā)生有效的變性反應(yīng)；同樣因反應(yīng)管內(nèi)的插片2的物理性阻隔，環(huán)流運(yùn)動(dòng)到反應(yīng)管上端時(shí)，僅能從插片2的上方經(jīng)過，而該區(qū)域在溫度控制裝置的作用下，可維持滿足特定引物退火所需的溫度，因此，環(huán)流從反應(yīng)管內(nèi)的插片2上方經(jīng)過時(shí)，均可發(fā)生有效的退火反應(yīng)。

參見圖2a、圖2b、圖2c、圖2d，為實(shí)踐上述方法，本發(fā)明首先提供一種可實(shí)踐的可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管的優(yōu)選實(shí)施例，包括一端封閉的管體1，所述管體1包括儲(chǔ)液區(qū)4以及位于儲(chǔ)液區(qū)下方的核酸擴(kuò)增區(qū)3；所述核酸擴(kuò)增區(qū)3內(nèi)設(shè)置有上下懸空的插片2，當(dāng)反應(yīng)管內(nèi)注入試劑時(shí)，通過插片2的物理阻隔，使得反應(yīng)管內(nèi)試劑在外力或內(nèi)力的作用下，形成圍繞插片上方及下方的環(huán)流路徑。

優(yōu)選地，所述插片2沿管體1的中軸線設(shè)置，并且插片的兩側(cè)a和b與核酸擴(kuò)增區(qū)3的內(nèi)壁連接；進(jìn)一步優(yōu)選地，插片的兩側(cè)a和b與核酸擴(kuò)增區(qū)3的內(nèi)壁密封連接。插片2沿管體1的中軸線方向?qū)⒑怂釘U(kuò)增區(qū)3分隔成第一區(qū)域3-1和第二區(qū)域3-2，第一區(qū)域3-1和第二區(qū)域3-2在核酸擴(kuò)增區(qū)3的上部3-A和下部3-B連通。

優(yōu)選地，所述插片2下端d與管體1底部之間的距離(即，核酸擴(kuò)增區(qū)3的下部3-B的高度)大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)3高度的1/2；更優(yōu)選地，所述插片2下端d與管體1底部之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)3高度的1/3；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述插片2下端d與管體1底部之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于等于4mm。

優(yōu)選地，所述插片2上端c與核酸擴(kuò)增區(qū)3上端之間的距離(即，核酸擴(kuò)增區(qū)3的上部3-A的高度)大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)3高度的1/2；更優(yōu)選地，所述插片2上端c與核酸擴(kuò)增區(qū)3上端之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)3高度的1/3；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述插片2上端c與核酸 擴(kuò)增區(qū)3上端之間的距離大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于等于3mm。

優(yōu)選地，所述管體1的底部通過與管體1相互配合的底塞1-1實(shí)現(xiàn)一端封閉。例如，所述管體與底塞之間通過旋轉(zhuǎn)螺紋結(jié)構(gòu)，或環(huán)狀卡口結(jié)構(gòu)，或凸點(diǎn)鎖扣結(jié)構(gòu)相互密閉連接，也可以采用現(xiàn)有技術(shù)中其它的密閉連接方式。

優(yōu)選地，所述管體1還包括與其配合的管蓋。所述管體1與管蓋之間通過旋轉(zhuǎn)螺紋結(jié)構(gòu)，或環(huán)狀卡口結(jié)構(gòu)，或凸點(diǎn)鎖扣結(jié)構(gòu)相互密閉連接，當(dāng)然也可以采用現(xiàn)有技術(shù)中其它的密閉連接方式。

優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的高度/內(nèi)徑的比值為3～12，更優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的高度/內(nèi)徑的比值為6～9，例如為7～8。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的內(nèi)徑小于等于10mm，例如小于等于5mm，且所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的內(nèi)徑小于所述儲(chǔ)液區(qū)4的內(nèi)徑。本發(fā)明的此種尺寸及比例結(jié)構(gòu)，能夠有效地保障和促進(jìn)反應(yīng)管的管內(nèi)液體自發(fā)地形成連續(xù)而穩(wěn)定的對(duì)流。在本發(fā)明中，管體1上方內(nèi)徑較大的區(qū)域作為儲(chǔ)液區(qū)4，因?yàn)楹怂釘U(kuò)增區(qū)3的內(nèi)徑相對(duì)較小，不方便將移液尖插入底部，也無法讓液體自流至底部，所以反應(yīng)試劑可先暫時(shí)貯存于儲(chǔ)液區(qū)4中，然后再通過離心、震蕩或其它方式使上方儲(chǔ)液區(qū)4的反應(yīng)試劑進(jìn)入下方的核酸擴(kuò)增區(qū)3，在核酸擴(kuò)增區(qū)3完成擴(kuò)增反應(yīng)或熒光信號(hào)采集等。且儲(chǔ)液區(qū)4相對(duì)于核酸擴(kuò)增區(qū)3具有較大的直徑，更容易握、拿，因此為操作者在配液中提供了極大的便利性。

優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的容積為30～200μl，更優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的容積為40～150μl。

進(jìn)一步地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的內(nèi)腔為橫截面上寬下窄的錐狀中空結(jié)構(gòu)或多層梯形中空結(jié)構(gòu)，核酸的擴(kuò)增、RNA的轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)檢測(cè)信號(hào)的采集均位于此區(qū)域。本發(fā)明核酸擴(kuò)增區(qū)3內(nèi)腔上寬下窄的內(nèi)徑設(shè)計(jì)優(yōu)點(diǎn)為：當(dāng)試劑因建立的上下溫度梯度而發(fā)生對(duì)流時(shí)，反應(yīng)管上方較寬內(nèi)徑的區(qū)域會(huì)增加試劑在該溫度區(qū)域的路徑，即相當(dāng)于增加PCR反應(yīng)中“延伸”步驟的時(shí)間，有利于長(zhǎng)片段的擴(kuò)增。當(dāng)然，為了制造方 便，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的內(nèi)腔也可以為上下內(nèi)徑相等的柱狀中空結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，所述管體1和插片2由耐熱材料制成，所述耐熱材料例如選自玻璃(glass)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PE)、聚醚砜(PES)和聚砜(PSF)。

此外，優(yōu)選地，所述管體1的內(nèi)壁可通過牛血清白蛋白(BSA)或硅烷化試劑等做鈍化處理，從而降低對(duì)核酸及反應(yīng)試劑中某些成分的吸附。

在上述的反應(yīng)管中可以含有：待檢樣本核酸、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、反應(yīng)緩沖液、二價(jià)鎂離子、非主要成分的PCR添加劑(如：甜菜堿、牛血清白蛋白、DMSO等)和至少兩條與待檢核酸序列特異互補(bǔ)的寡核苷酸引物，以及任選地與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料或特異性熒光探針等。其后，用低密度的不易揮發(fā)物質(zhì)(如石蠟油或者各種低熔點(diǎn)的蠟)覆蓋于試劑表面或采用管蓋封閉反應(yīng)管以防止蒸發(fā)。

同時(shí)本發(fā)明還提供一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置，其包括本發(fā)明任一項(xiàng)的反應(yīng)管和一個(gè)或多個(gè)可提供或移走熱量的溫度控制裝置，所述溫度控制裝置設(shè)置于所述反應(yīng)管的外部或內(nèi)部。該溫度控制裝置的作用是,基于雷諾本納德(Rayleigh-Benard)原理,建立反應(yīng)管內(nèi)試劑的溫度梯度及密度梯度，從而驅(qū)動(dòng)反應(yīng)試劑在反應(yīng)管內(nèi)的自發(fā)循環(huán)流動(dòng)；控制反應(yīng)管及管內(nèi)試劑特定部位的溫度；并進(jìn)而通過試劑的自發(fā)循環(huán)及溫度控制，實(shí)現(xiàn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等核酸擴(kuò)增反應(yīng)。能夠建立反應(yīng)管內(nèi)試劑的溫度梯度及密度梯度的溫度控制裝置為本領(lǐng)域所公知，例如可參考發(fā)明專利CN103173434A，CN1571849A，CN101983236A。

本發(fā)明溫度控制裝置的優(yōu)選實(shí)施例如圖3所示，優(yōu)選裝置含有上加熱模塊4和下加熱模塊5，分別用于對(duì)反應(yīng)管的底部與上部提供或移走熱量，并通過這種溫度控制，對(duì)上述可通過控制液體環(huán)流路徑實(shí)現(xiàn)PCR高效擴(kuò)增的反應(yīng)管的底部提供合適的變性溫度，以保障從插片下方的流經(jīng)的試劑可高效的發(fā)生變性反應(yīng)；對(duì)反應(yīng)管的上部提供合適的退火溫度， 以保障從插片上方流經(jīng)的試劑可高效的發(fā)生退火反應(yīng)。此外，在上、下兩個(gè)金屬加熱模塊中間，構(gòu)造一塊熱傳導(dǎo)系數(shù)較低的模塊6，用于包裹反應(yīng)管的非直接加熱區(qū)域，可避免該區(qū)域因暴露在外界空氣中而受到干擾，還可避免因多通量模塊中部與外部散熱能力差異較大而導(dǎo)致不同孔中反應(yīng)管內(nèi)溫度場(chǎng)分布的差異。

優(yōu)選地，本裝置還含有實(shí)時(shí)熒光信號(hào)檢測(cè)模組。該模組是由激發(fā)光源7、濾光片8及感光檢測(cè)裝置9組成的有機(jī)整體，能在毫秒級(jí)時(shí)間內(nèi)完成多個(gè)標(biāo)本快速均衡掃描檢測(cè)。

本發(fā)明不局限于圖2與圖3所描述的反應(yīng)管與檢測(cè)裝置，加熱方式的改變與容器形狀的改變皆屬本發(fā)明的范疇。

圖4出示了應(yīng)用本發(fā)明的一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管對(duì)DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用時(shí)，在反應(yīng)管中含有：待檢DNA模板、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、反應(yīng)緩沖液、二價(jià)鎂離子、非主要成分的PCR添加劑(如：甜菜堿、牛血清白蛋白、DMSO等)和至少兩條與待檢核酸序列特異互補(bǔ)的寡核苷酸引物。并用低密度的不易揮發(fā)物質(zhì)(如石蠟油或者各種低熔點(diǎn)的蠟)覆蓋于試劑表面或用管蓋封閉反應(yīng)管，以防止蒸發(fā)。擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)管置于加熱裝置中，位于反應(yīng)管底部的加熱模塊設(shè)置為95℃，位于反應(yīng)管上部的加熱模塊設(shè)置為60℃，反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為30分鐘。反應(yīng)管內(nèi)試劑將在該溫差的驅(qū)動(dòng)下連續(xù)流動(dòng)，并在反應(yīng)管中插片的物理阻隔下，僅從插片的底部與上方經(jīng)過，并在流經(jīng)插片底部時(shí)發(fā)生變性反應(yīng)，在流經(jīng)插片上方時(shí)，發(fā)生退火反應(yīng)，并在聚合酶活性溫度區(qū)間內(nèi)進(jìn)行延伸反應(yīng)。擴(kuò)增結(jié)束后，從管內(nèi)取5μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。泳道1與泳道2為陽性樣本擴(kuò)增結(jié)果，泳道3與泳道4為陰性對(duì)照(DEPC水)擴(kuò)增結(jié)果。從結(jié)果中可以看出，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA模板的擴(kuò)增。

圖5出示了應(yīng)用本發(fā)明的一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管對(duì)RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。與DNA擴(kuò) 增不同的是：反應(yīng)管內(nèi)除含有上述DNA擴(kuò)增所需試劑外，還含有反轉(zhuǎn)錄酶，用于實(shí)現(xiàn)以RNA為模板的cDNA合成。此外，反應(yīng)模塊的溫度設(shè)置也有所不同：位于反應(yīng)管底部的加熱模塊首先被設(shè)置為60℃，維持20分鐘后，再升溫至95℃，維持30分鐘；位于反應(yīng)管上部的加熱模塊仍設(shè)置為恒溫60℃，50分鐘。同樣的，擴(kuò)增結(jié)束后，從管內(nèi)取5μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。泳道1與泳道2為陽性樣本擴(kuò)增結(jié)果，泳道3與泳道4為陰性對(duì)照(DEPC水)擴(kuò)增結(jié)果。從電泳圖中可以看出，本發(fā)明還可實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA模板的擴(kuò)增。

圖6說明應(yīng)用本發(fā)明的一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管相對(duì)于先前對(duì)流PCR方法可提高不同管間擴(kuò)增的一致性與特異性。用相同加熱裝置分別在本發(fā)明的一種控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管與無環(huán)流控制功能反應(yīng)管中，對(duì)4管重復(fù)的巨細(xì)胞病毒(CMV)陽性樣本的提取模板(CMV DNA濃度為10³copies/tube)及4管CMV陰性的HBV陽性樣本的提取模板(HBV DNA濃度為10⁶copies/tube)進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用本發(fā)明的一種控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果如圖6a所示，應(yīng)用無環(huán)流控制功能反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果如圖6b所示。泳道1-4為4管相同CMV核酸陽性樣本的重復(fù)擴(kuò)增結(jié)果，泳道5-8為CMV核酸陰性HBV核酸陽性樣本的對(duì)照。結(jié)果顯示，應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行4組陽性樣本的平行檢測(cè)，其終點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果的一致性(圖6a，泳道1-4)明顯優(yōu)于應(yīng)用無環(huán)流控制功能反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果(圖6b，泳道1-4)。說明本發(fā)明的一種控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管可提高不同管間擴(kuò)增的一致性。此外，應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行4組陰性樣本的平行擴(kuò)增，其終點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果(圖6a，泳道5-8)中，非特異性擴(kuò)增(如引物二聚體)較無環(huán)流控制功能反應(yīng)管結(jié)果(圖6b，泳道5-8)有極大的改善，說明本發(fā)明的一種控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管可提高擴(kuò)增的特異性。

圖7說明應(yīng)用本發(fā)明的一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管相對(duì)于先前對(duì)流PCR方法可提高擴(kuò)增的速率。用相同加熱裝置分別在本發(fā)明的一種控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管與無環(huán)流控制功能反應(yīng)管中，對(duì)濃度為10³copies/ml的CMV DNA進(jìn)行3組擴(kuò)增(每組4 個(gè)重復(fù)樣本及1個(gè)模板為DEPC水的陰性對(duì)照)，3組擴(kuò)增時(shí)間分別設(shè)定為15分鐘，20分鐘，25分鐘。應(yīng)用本發(fā)明的一種控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果如圖7a所示，應(yīng)用無環(huán)流控制功能反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果如圖7b所示。結(jié)果顯示，應(yīng)用本發(fā)明的擴(kuò)增，在擴(kuò)增20分鐘后，陽性管即可觀察到弱條帶，在擴(kuò)增25分鐘后，陽性管即可觀察到強(qiáng)條帶；而應(yīng)用無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管，則需擴(kuò)增25分鐘，陽性反應(yīng)管才可觀察到弱條帶。該結(jié)果說明應(yīng)用本發(fā)明的一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管相對(duì)于先前對(duì)流PCR方法可提高擴(kuò)增的效率。

圖8說明應(yīng)用本發(fā)明的一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管相對(duì)于先前對(duì)流PCR方法可提高定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。用相同加熱裝置分別在本發(fā)明的一種控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管與無環(huán)流控制功能反應(yīng)管中，對(duì)濃度為10⁶copies/tube、10⁵copies/tube的人巨細(xì)胞病毒(CMV)DNA及陰性樣本(DEPC水)進(jìn)行擴(kuò)增，并用taqman水解探針對(duì)擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。結(jié)果顯示，應(yīng)用本發(fā)明的檢測(cè)，其相同濃度樣本的重復(fù)性明顯高于用無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管。

實(shí)施例

現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實(shí)施例來描述本發(fā)明。

除非特別指明，本發(fā)明中所使用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和免疫檢測(cè)法，基本上參照J(rèn).Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法進(jìn)行；酶的使用依照產(chǎn)品制造商推薦的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實(shí)施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：一種控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管

如圖2a、2b、2c、2d所示，本發(fā)明的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管包括一端封閉的管體1，所述管體1包括儲(chǔ)液區(qū)4以及位于儲(chǔ)液區(qū)下方的核酸擴(kuò)增區(qū)3，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3內(nèi)設(shè)置有上下懸空的插片2，當(dāng)反應(yīng)管內(nèi)注入試劑時(shí)，通過插片2的物理阻隔，使得反應(yīng)管內(nèi)試劑在外力或內(nèi)力的作用下，形成圍繞插片上方及下方的環(huán)流路徑。

優(yōu)選地，所述插片2沿管體1的中軸線設(shè)置，并且插片的兩側(cè)a和b與核酸擴(kuò)增區(qū)3的內(nèi)壁連接。插片2沿管體1的中軸線方向?qū)⒑怂釘U(kuò)增區(qū)3分隔成第一區(qū)域3-1和第二區(qū)域3-2，第一區(qū)域3-1和第二區(qū)域3-2在核酸擴(kuò)增區(qū)3的上部3-A和下部3-B連通。

優(yōu)選地，所述插片2下端d與管體1底部之間的距離(即，核酸擴(kuò)增區(qū)3的下部3-B的高度)大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)高度的1/2，例如小于1/3，例如小于等于4mm。

優(yōu)選地，所述插片2上端c與核酸擴(kuò)增區(qū)3上端之間的距離(即，核酸擴(kuò)增區(qū)3的上部3-A的高度)大于0mm(例如大于等于1mm)并且小于核酸擴(kuò)增區(qū)3高度的1/2，例如小于1/3，例如小于等于3mm。

優(yōu)選地，所述管體1的底部通過與管體1相互配合的底塞1-1實(shí)現(xiàn)一端封閉。所述管體與底塞之間可通過旋轉(zhuǎn)螺紋結(jié)構(gòu)，或環(huán)狀卡口結(jié)構(gòu)，或凸點(diǎn)鎖扣結(jié)構(gòu)相互密閉連接，也可以采用現(xiàn)有技術(shù)中其它的密閉連接方式。

優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的高度/內(nèi)徑的比值為3～12，進(jìn)一步優(yōu)選為6～9。

優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的容積為30～200μl，進(jìn)一步優(yōu)選為40～150μl。

優(yōu)選地，所述核酸擴(kuò)增區(qū)3的內(nèi)腔可以為橫截面上寬下窄的錐狀中空結(jié)構(gòu)或多層梯形中空結(jié)構(gòu)，也可以為上下內(nèi)徑基本相等的柱狀中空結(jié)構(gòu)。核酸的擴(kuò)增、RNA的轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)檢測(cè)信號(hào)的采集均位于此區(qū)域。

所述管體1和插片2可以由耐熱材料制成，所述耐熱材料例如選 自玻璃(glass)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PE)、聚醚砜(PES)和聚砜(PSF)。

此外，優(yōu)選地，所述管體1的內(nèi)壁可通過牛血清白蛋白(BSA)或硅烷化試劑等做鈍化處理，從而降低對(duì)核酸及反應(yīng)試劑中某些成分的吸附。

在上述反應(yīng)管中含有：待檢樣本核酸、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、反應(yīng)緩沖液、二價(jià)鎂離子、非主要成分的PCR添加劑(如：甜菜堿、牛血清白蛋白、DMSO等)和至少兩條與待檢核酸序列特異互補(bǔ)的寡核苷酸引物，以及任選地與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料或特異性熒光探針等。其后，用低密度的不易揮發(fā)物質(zhì)(如石蠟油或者各種低熔點(diǎn)的蠟)覆蓋于試劑表面或用管蓋封閉反應(yīng)管，以防止蒸發(fā)。

實(shí)施例2：應(yīng)用實(shí)施例1的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管進(jìn)行的、以DNA為模板的擴(kuò)增與檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)材料

化學(xué)試劑：SpeedSTAR HS DNA polymerase(TaKaRa)，10×Fast Buffer I(Mg²⁺plus)(TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，DEPC水，石蠟油，6×DNA上樣緩沖液(含Sybr Green)

儀器耗材：自制核酸擴(kuò)增儀(參見申請(qǐng)CN201110456811.9)；實(shí)施例1的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管、凝膠電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad)

引物：JxbUL54F1：GTGCGCCTTGACACTGTAC(SEQ ID NO.1)

JxbUL54R11：CGACAAGTACTTTGAGCAGG(SEQ ID NO.2)

檢測(cè)模板1：CMV病毒DNA提取物，濃度為10³copies/mL

檢測(cè)模板2：DEPC水

2、實(shí)驗(yàn)方法：

(1)擴(kuò)增試劑的配制：3.2mM dNTP，4μL 10×Fast Buffer I(Mg²⁺plus),1U SpeedSTAR HS DNA polymerase，0.4μL 10μM JxbUL54F1，0.4μL 10μM JxbUL54R11，5μl檢測(cè)模板，總體積40μl，剩余體積用DEPC水補(bǔ)足。

(2)核酸擴(kuò)增：a.將配制好的擴(kuò)增試劑注入本發(fā)明的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管，滴加10μl石蠟油，并通過離心、振動(dòng)或其他方式，使擴(kuò)增試劑充滿反應(yīng)容器；b.設(shè)置自制核酸擴(kuò)增儀底部溫度為95℃，上部溫度為60℃，擴(kuò)增時(shí)間設(shè)置為30分鐘。將裝有核酸擴(kuò)增試劑的反應(yīng)管插入核酸擴(kuò)增儀中，開啟程序，程序運(yùn)行結(jié)束后取出反應(yīng)管。

(3)擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測(cè)：從反應(yīng)管中取出5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，與1μl上樣緩沖液混合后，使用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖4所示，泳道1與泳道2為陽性樣本擴(kuò)增結(jié)果，泳道3與泳道4為陰性對(duì)照(DEPC水)擴(kuò)增結(jié)果。從結(jié)果中可以看出，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)以DNA為模板的擴(kuò)增，陰性對(duì)照正常說明無非特異性擴(kuò)增。

實(shí)施例3：應(yīng)用實(shí)施例1的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管進(jìn)行的、以RNA為模板的擴(kuò)增與檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)材料

化學(xué)試劑：SpeedSTAR HS DNA polymerase(TaKaRa)，反轉(zhuǎn)錄酶MMLV(Transgen)，10×Fast Buffer I(Mg²⁺plus)(TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，DEPC水，石蠟油，6×DNA上樣緩沖液(含Sybr Green)

儀器耗材：自制核酸擴(kuò)增儀(參見申請(qǐng)CN201110456811.9)；實(shí)施例1的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管、凝膠電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad)

引物：CA16-WJ-F6-1：CAAGTAYTACCYACRGCTGCCAA(SEQ ID NO.3)

CA16-WJ-R6-1：CAACACACAYCTMGTCTCAATGAG(SEQ ID NO.4)

檢測(cè)模板1：柯薩奇病毒A16型(CA16病毒)RNA提取物，濃度為10³copies/mL

檢測(cè)模板2：DEPC水

2、實(shí)驗(yàn)方法：

(1)擴(kuò)增試劑的配制：

3.2mM dNTP，4μL 10×Fast Buffer I(Mg2+plus),1U SpeedSTAR HS DNA polymerase，0.4U MMLV，0.4μL 10μM JxbUL54F1，0.4μL 10μM JxbUL54R11，5μl檢測(cè)模板，總體積40μl，剩余體積用DEPC水補(bǔ)足。

(2)核酸擴(kuò)增：a.將配制好的擴(kuò)增試劑注入本發(fā)明的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管，滴加10μl石蠟油，并通過離心、振動(dòng)或其他方式，使擴(kuò)增試劑充滿反應(yīng)容器；b.儀器底部加熱模塊程序?yàn)?0℃20分鐘，95℃30分鐘；儀器上部加熱模塊設(shè)置為恒溫60℃，50分鐘。將裝有核酸擴(kuò)增試劑的反應(yīng)管插入儀器中，開啟程序，程序運(yùn)行結(jié)束后取出反應(yīng)管。

(3)擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測(cè)：從反應(yīng)管中取出5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，與1μl上樣緩沖液混合后，使用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖5所示，泳道1與泳道2為陽性樣本擴(kuò)增結(jié)果，泳道3與泳道4為陰性對(duì)照(DEPC水)擴(kuò)增結(jié)果。從結(jié)果中可以看出，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)以RNA為模板的擴(kuò)增，陰性對(duì)照正常說明無非特異性擴(kuò)增。

實(shí)施例4：有、無環(huán)流控制功能反應(yīng)管的擴(kuò)增的均一性與特異性比較

1、實(shí)驗(yàn)材料

化學(xué)試劑：SpeedSTAR HS DNA polymerase(TaKaRa)，10×Fast Buffer I(Mg²⁺plus)(TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，DEPC水，石 蠟油，6×DNA上樣緩沖液(含Sybr Green)

儀器耗材：自制核酸擴(kuò)增儀；實(shí)施例1的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管、無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管(參見申請(qǐng)201110360350.5)、凝膠電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad)

引物：JxbUL54F1：GTGCGCCTTGACACTGTAC(SEQ ID NO.1)

JxbUL54R11：CGACAAGTACTTTGAGCAGG(SEQ ID NO.2)

檢測(cè)模板1：CMV病毒DNA提取物，濃度為10³copies/mL

檢測(cè)模板2：DEPC水

2、實(shí)驗(yàn)方法：

(1)擴(kuò)增試劑的配制：3.2mM dNTP，4μL 10×Fast Buffer I(Mg2+plus),1U SpeedSTAR HS DNA polymerase，0.4μL 10μM JxbUL54F1，0.4μL 10μM JxbUL54R11，5μl檢測(cè)模板，總體積40μl，剩余體積用DEPC水補(bǔ)足。

(2)核酸擴(kuò)增：a.將配制好的擴(kuò)增試劑分別注入本發(fā)明的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管、及無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管，滴加10μl石蠟油，并通過離心、振動(dòng)或其他方式，使擴(kuò)增試劑充滿反應(yīng)容器；b.設(shè)置自制核酸擴(kuò)增儀底部溫度為95℃，上部溫度為60℃，擴(kuò)增時(shí)間設(shè)置為30分鐘。將上述兩種裝有核酸擴(kuò)增試劑的反應(yīng)管插入儀器中，開啟程序，程序運(yùn)行結(jié)束后取出反應(yīng)管。

(3)擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測(cè)：從反應(yīng)管中取出5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，與1μl上樣緩沖液混合后，使用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：陽性擴(kuò)增如圖6泳道1-4所示，用本發(fā)明的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果(圖6a)，4管條帶的強(qiáng)度明顯優(yōu)于用無環(huán)流控制功能的反應(yīng)容器擴(kuò)增的結(jié)果(圖6b)。陰性擴(kuò)增如圖6泳道5-8所示，用本發(fā)明的一種可通過控制液體環(huán)流路徑實(shí)現(xiàn)PCR高效擴(kuò)增的反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果(圖6a)，背景干凈，沒有引物二聚體等非特異性擴(kuò)增，而用無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果(圖6b)，有明顯的引物二聚體。上述結(jié)果說明本發(fā)明的一種控制液體自發(fā)環(huán)流路 徑的反應(yīng)管具有提高不同管間擴(kuò)增的一致性與特異性的作用。

實(shí)施例5：有、無環(huán)流控制功能反應(yīng)管的擴(kuò)增效率比較

1、實(shí)驗(yàn)材料

化學(xué)試劑：SpeedSTAR HS DNA polymerase(TaKaRa)，10×Fast Buffer I(Mg²⁺plus)(TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，DEPC水，石蠟油，6×DNA上樣緩沖液(含Sybr Green)

儀器耗材：自制核酸擴(kuò)增儀；實(shí)施例1的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管、無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管(參見申請(qǐng)201110360350.5)、凝膠電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad)

引物：JxbUL54F1：GTGCGCCTTGACACTGTAC(SEQ ID NO.1)

JxbUL54R11：CGACAAGTACTTTGAGCAGG(SEQ ID NO.2)

檢測(cè)模板1：CMV病毒DNA提取模板，濃度為10³copies/ml

檢測(cè)模板2：DEPC水

2、實(shí)驗(yàn)方法：

(1)擴(kuò)增試劑的配制：3.2mM dNTP，4μL 10×Fast Buffer I(Mg²⁺plus),1U SpeedSTAR HS DNA polymerase，0.4μL 10μM JxbUL54F1，0.4μL 10μM JxbUL54R11，5μl檢測(cè)模板，總體積40μl，剩余體積用DEPC水補(bǔ)足。

(2)核酸擴(kuò)增：a.將配制好的擴(kuò)增試劑分別注入本發(fā)明的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管、及無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管，滴加10μl石蠟油，并通過離心、振動(dòng)或其他方式，使擴(kuò)增試劑充滿反應(yīng)管；b.設(shè)置自制核酸擴(kuò)增儀底部溫度為95℃，上部溫度為60℃，擴(kuò)增時(shí)間分別設(shè)定為15分鐘，20分鐘，25分鐘。將上述兩種裝有核酸擴(kuò)增試劑的反應(yīng)管插入儀器中，開啟程序，程序運(yùn)行結(jié)束后取出反應(yīng)管。

(3)擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測(cè)：從反應(yīng)管中取出5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，與1μl上樣緩沖液混合后，使用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

應(yīng)用本發(fā)明的一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果如圖7a所示，應(yīng)用無環(huán)流控制功能反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果如圖7b所示。結(jié)果顯示，應(yīng)用本發(fā)明的擴(kuò)增，在擴(kuò)增20分鐘后，陽性管即可觀察到弱條帶，在擴(kuò)增25分鐘后，陽性管即可觀察到強(qiáng)條帶；而應(yīng)用無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管，則需擴(kuò)增25分鐘，陽性反應(yīng)管才可觀察到弱條帶。該結(jié)果說明應(yīng)用本發(fā)明相對(duì)于先前對(duì)流PCR方法可提高擴(kuò)增的效率。

實(shí)施例6：有、無環(huán)流控制功能反應(yīng)管的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)比較

1、實(shí)驗(yàn)材料

化學(xué)試劑：SpeedSTAR HS DNA polymerase(TaKaRa)，10×Fast Buffer I(Mg²⁺plus)(TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，DEPC水，石蠟油

儀器耗材：自制核酸擴(kuò)增與實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀(參見申請(qǐng)CN201110456811.9)；實(shí)施例1的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管、無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管(參見申請(qǐng)201110360350.5)、

引物：JxbUL54F1：GTGCGCCTTGACACTGTAC(SEQ ID NO.1)

JxbUL54R11：CGACAAGTACTTTGAGCAGG(SEQ ID NO.2)

探針：JxbUL54P1：FAM-AGCCGGCTCCAAGTGCAAG-BHQ-1(SEQ ID NO.5)

檢測(cè)模板1：CMV病毒DNA提取模板，濃度為10⁶copies/ml

檢測(cè)模板2：CMV病毒DNA提取模板，濃度為10⁵copies/ml

檢測(cè)模板3：DEPC水

2、實(shí)驗(yàn)方法：

(1)擴(kuò)增試劑的配制：3.2mM dNTP，4μL 10×Fast Buffer I(Mg²⁺plus),1U SpeedSTAR HS DNA polymerase，0.4μL 10μM JxbUL54F1，0.4μL 10μM JxbUL54R11，0.2μL 10μM JxbUL54P1，5μl檢測(cè)模板，總體積40μl，剩余體積用DEPC水補(bǔ)足。

(2)核酸擴(kuò)增：a.將配制好的擴(kuò)增試劑分別注入本發(fā)明的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管、及無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管，滴加10μl石蠟油，并通過離心、振動(dòng)或其他方式，使擴(kuò)增試劑充滿反應(yīng)容器；b.設(shè)置自制核酸擴(kuò)增儀底部溫度為95℃，上部溫度為60℃，擴(kuò)增時(shí)間設(shè)定為30分鐘。將上述兩種裝有核酸擴(kuò)增試劑的反應(yīng)管插入自制核酸擴(kuò)增與實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀中，開啟程序，程序運(yùn)行結(jié)束后取出反應(yīng)管，并分析數(shù)據(jù)。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

應(yīng)用本發(fā)明的一種可控制液體自發(fā)環(huán)流路徑的反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果如圖8a所示，應(yīng)用無環(huán)流控制功能反應(yīng)管擴(kuò)增的結(jié)果如圖8b所示。結(jié)果顯示，應(yīng)用本發(fā)明的擴(kuò)增，其相同濃度樣本擴(kuò)增曲線的重復(fù)性明顯優(yōu)于無環(huán)流控制功能的反應(yīng)管，從而提示應(yīng)用本發(fā)明的一種可控制液體環(huán)流路徑的核酸擴(kuò)增反應(yīng)管可進(jìn)行核酸樣本的定量檢測(cè)。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。