本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種通過靶向IQGAP1基因的siRNA在抗EB病毒相關(guān)性腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類致瘤病毒，與多種人類淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞起源的惡性腫瘤和疾病相關(guān)，包括鼻咽癌、胃癌、伯基特淋巴瘤、AIDS相關(guān)性淋巴瘤以及移植后淋巴組織增生性疾?。≒TLD）等。EBV感染后在細(xì)胞中處于潛伏感染狀態(tài)，能逃避宿主的免疫。EBV在腫瘤組織和血液中的載量與疾病的病程和預(yù)后呈正相關(guān)。EBV在細(xì)胞中保持一定的拷貝數(shù)，其編碼的核抗原EBNA1是EBV復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，隨著細(xì)胞的復(fù)制而復(fù)制，隨著細(xì)胞的分裂而分離進(jìn)入子代細(xì)胞。在這個過程中，會發(fā)生與宿主細(xì)胞的相互作用，以幫助病毒基因組穩(wěn)定地分配到子代細(xì)胞中。在對腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，EBV并不像在體內(nèi)一樣，而是隨著細(xì)胞的傳代逐漸丟失。我們的前期研究表明，這是EBV對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴性。細(xì)胞密度低，則EBV容易丟失。潛伏膜蛋白LMP1是EB病毒的主要癌蛋白，通過細(xì)胞的信號通路如NF-kB的異常等在細(xì)胞轉(zhuǎn)化致瘤中發(fā)揮作用。發(fā)明人團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，EBV病毒載量與EBNA1和LMP1的表達(dá)水平呈正相關(guān)，癌蛋白表達(dá)水平的下降，其致瘤作用也降低。

細(xì)胞骨架蛋白IQGAP1是一個180kD大小的分子，對維持細(xì)胞的極性、運(yùn)動性、細(xì)胞接觸抑制方面具有重要作用，在細(xì)胞分裂中也發(fā)揮作用。IQGAP1對應(yīng)的基因序列GenBank登錄號為NM_003870.3，ORF全長4974bp。IQGAP1可與EB病毒基因組復(fù)制和分離的關(guān)鍵病毒蛋白EBNA1發(fā)生相互作用，通過這種作用使EB病毒穩(wěn)定維持在細(xì)胞內(nèi)。IQGAP1主要的功能是在細(xì)胞分裂時使EB病毒穩(wěn)定傳代到子代細(xì)胞中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種通過靶向細(xì)胞蛋白IQGAP1的siRNA，所述siRNA-IQGAP1正義鏈序列為：5' CGACCUGGCUUUAGAACAA dTdT 3'，如SEQ ID No.1所示，反義鏈序列為：3' dTdT GCUGGACCGAAAUCUUGUU 5'，如SEQ ID No.2所示；或正義鏈：5' CAAUUGAGCAGUUCAGUUA dTdT 3，如SEQ ID No.3所示，反義鏈：3' dTdT GUUAACUCGUCAAGUCAAU 5' ，如SEQ ID No.4所示；或正義鏈：5' GAAAUAUACAGCAGCAAGA dTdT 3' ，如SEQ ID No.5所示，反義鏈：3' dTdT CUUUAUAUGUCGUCGUUCU 5'，如SEQ ID No.6所示。

其中，第一對siRNA對應(yīng)的靶序列為：CGACCTGGCTTTAGAACAA （位置：930-954，如SEQ ID No.7所示）；第二對siRNA對應(yīng)的靶序列為：CAATTGAGCAGTTCAGTTA （位置：1432-1450，如SEQ ID No.8所示）；第三對siRNA對應(yīng)的靶序列為：GAAATATACAGCAGCAAGA （位置：4683-4701，如SEQ ID No.9所示）。

上述3對siRNA均對干擾IQGAP1有效，第一對的效果最好。對于干擾后對EBV-LMP1的轉(zhuǎn)錄抑制的影響三對siRNA差異不大，而第一條對EBNA1的表達(dá)抑制影響的效果最明顯。

通過雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BiMC）和免疫共沉淀（IP）技術(shù)，發(fā)明人團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)IQGAP1與EBNA1發(fā)生直接的相互作用（見圖1和圖2），QGAP1直接與結(jié)合EBNA1結(jié)合并進(jìn)入胞核，促進(jìn)EBV的復(fù)制和胞漿分離，使病毒基因組穩(wěn)定地隨著細(xì)胞的傳代而傳代。應(yīng)用confocal顯微共聚焦技術(shù)，我們還觀察到它們在分裂細(xì)胞胞漿中的相互作用。IQGAP1是一種新發(fā)現(xiàn)的與EBV相關(guān)、幫助EBV發(fā)揮致瘤作用的癌蛋白，是EB病毒基因組穩(wěn)定維持在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮致瘤作用所必需的宿主蛋白。因此，IQGAP1可作為治療EBV相關(guān)性腫瘤的分子靶標(biāo)。

因此，本發(fā)明應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾IQGAP1的表達(dá)，在EBV陽性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中干擾IQGAP1的表達(dá)，可使EBV病毒潛伏基因和病毒載量表達(dá)下降，在EBV陽性的鼻咽癌細(xì)胞中同樣表現(xiàn)顯著下降，從而抑制EBV在細(xì)胞中的穩(wěn)定維持、減少病毒載量，達(dá)到治療EBV相關(guān)性腫瘤的應(yīng)用。

靶向IQGAP1的siRNA在制備抗EB病毒相關(guān)性腫瘤的藥物中具有應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是IQGAP1與EBNA1的BiMC(雙分子熒光互補(bǔ))實驗結(jié)果圖；

圖2是IQGAP1與EBNA1的IP-WB(免疫共沉淀+western blot)實驗結(jié)果圖；

圖3是IQGAP1與EBNA1的Confocal試驗圖，Confocal顯示細(xì)胞分離時內(nèi)源性IQGAP1與EBNA1的作用強(qiáng)烈（圖中右部分中的亮處）；

圖4是EBV陽性的鼻咽癌細(xì)胞系293-EBV中使用3條siRNA干擾IQGAP1的表達(dá)結(jié)果及EBNA1蛋白表達(dá)結(jié)果圖；

圖5是3條siRNA 對EBV陽性的鼻咽癌細(xì)胞系293-EBV干擾時LMP1的轉(zhuǎn)錄水平，其中** p<0.01; *** p<0.001；

圖6是EBV陽性的鼻咽癌細(xì)胞系293-1/NL中使用第1條siRNA干擾IQGAP1的表達(dá)結(jié)果圖；

圖7是第1條IQGAP1-siRNA對細(xì)胞系293-1/NL干擾時EBNA1的轉(zhuǎn)錄水平，其中** p<0.01; *** p<0.001；

圖8是第1條siRNA-IQGAP1對細(xì)胞系293-1/NL干擾時LMP1的轉(zhuǎn)錄水平，其中** p<0.01; *** p<0.001；

圖9是EBV陽性的鼻咽癌細(xì)胞系C666-1中使用第1條siRNA干擾IQGAP1的表達(dá)的熒光結(jié)果圖；

圖10是第1條siRNA-IQGAP1對細(xì)胞系C666-1干擾時EBNA1的轉(zhuǎn)錄水平，其中** p<0.01; *** p<0.001；

圖11是第1條siRNA-IQGAP1對細(xì)胞系C666-1干擾時LMP1的轉(zhuǎn)錄水平，其中** p<0.01; *** p<0.001。

具體實施方式

通過雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BiMC）和免疫共沉淀（IP）技術(shù)，發(fā)明人團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)IQGAP1與EBNA1發(fā)生直接的相互作用（見圖1和圖2），其中圖1是BiMC(雙分子熒光互補(bǔ))實驗結(jié)果圖，圖1證明IQGAP1與EBV核抗原（EBNA1）存在相互作用；圖1中A部分可以看出IQGAP1與EBNA1在胞核中發(fā)生相互作用（綠色熒光），圖1中B部分為單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的陰性對照。圖2是IP-WB(免疫共沉淀+western blot)實驗結(jié)果圖。QGAP1直接與結(jié)合EBNA1結(jié)合并進(jìn)入胞核，促進(jìn)EBV的復(fù)制和胞漿分離，使病毒基因組穩(wěn)定地隨著細(xì)胞的傳代而傳代。

應(yīng)用confocal顯微共聚焦技術(shù)，我們還觀察到它們在分裂細(xì)胞胞漿中的相互作用。圖3是IQGAP1與EBNA1的Confocal試驗圖，Confocal顯示細(xì)胞分離時內(nèi)源性IQGAP1與EBNA1的作用強(qiáng)烈（圖3中右部分中的亮處），IQGAP1是一種新發(fā)現(xiàn)的與EBV相關(guān)、幫助EBV發(fā)揮致瘤作用的癌蛋白，是EB病毒基因組穩(wěn)定維持在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮致瘤作用所必需的宿主蛋白。因此，IQGAP1可作為治療EBV相關(guān)性腫瘤的分子靶標(biāo)。

實施例1：靶向基因IQGAP1的siRNA（簡稱siRNA-IQGAP1）設(shè)計

檢索NCBI GeneBank得到IQGAP1全序列和RNA序列，利用現(xiàn)有的在線軟件對IQGAP1進(jìn)行生物學(xué)分析，選擇編碼區(qū)作為siRNA設(shè)計把序列。根據(jù)siRNA設(shè)計原則，在相關(guān)siRNA設(shè)計軟件上進(jìn)行初步設(shè)計和篩選。按選擇好的siRNA序列進(jìn)行合成。siRNA設(shè)計原則：（1）利用IQGAP1的mRNA序列，從起始密碼AUG開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)；（2）設(shè)計的siRNA序列GC含量在30%-50%之間；（3）避免二級結(jié)構(gòu)重復(fù)；（4）sence鏈的3’穩(wěn)定性比5’端低；（5）將潛在的序列與相應(yīng)基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列搜索，排除與其它編碼序列或EST同源的序列。排除aitisence鏈的5’端連續(xù)8個剪輯與其他基因配對的潛在siRNA；排除任何一段連續(xù)14個堿基與其它基因配對的潛在siRNA。

最終獲得3對IQGAP-1特異性siRNA（簡稱siRNA-IQGAP1），序列分別為：

第1號siRNA-IQGAP1正義鏈和反義鏈序列分別如SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2所示，即正義鏈序列為：5' CGACCUGGCUUUAGAACAA dTdT 3'，反義鏈序列為：3' dTdT GCUGGACCGAAAUCUUGUU 5' ；

第2號siRNA-IQGAP1正義鏈和反義鏈序列分別如SEQ ID No.3 和SEQ ID No.4所示，即正義鏈：5' CAAUUGAGCAGUUCAGUUA dTdT 3，反義鏈：3' dTdT GUUAACUCGUCAAGUCAAU 5' ；

第3號siRNA-IQGAP1正義鏈和反義鏈序列分別如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，即正義鏈：5' GAAAUAUACAGCAGCAAGA dTdT 3' ，反義鏈：3' dTdT CUUUAUAUGUCGUCGUUCU 5'。

實施例2：IQGAP-1特異性siRNA（siRNA-IQGAP1）的細(xì)胞轉(zhuǎn)染

合成三對siRNA-IQGAP1。用無菌無酶水將合成的粉末狀的siRNA-IQGAP1試劑稀釋為20uM溶液，使用終濃度則為5nM。

在六孔板中分別種上細(xì)胞C2089、293-EBV、C22和293-1/NL，每種細(xì)胞約為1.5x10⁵-6x10⁵個，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（37℃，5%CO₂）。以六孔板中一個孔的轉(zhuǎn)染為例。第二天，將稀釋好的siRNA-IQGAP1溶液5ul加入裝有200ul無血清DMEM培養(yǎng)基的無菌無酶的EP管中（siRNA-IQGAP1加入細(xì)胞中其終濃度為5nM）。再將6ul HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑（QIGEN，貨號：301705），混合均勻，室溫（15-25℃）放置5-10分鐘。將六孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基棄掉，換成新鮮的含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔1.8ml。把上述第三部室溫放置的混合物加入到準(zhǔn)備好的細(xì)胞中，輕輕晃動六孔板，使其均勻的溶解在培養(yǎng)基中。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)。36小時收取細(xì)胞蛋白以及總RNA。

實施例3：實時熒光定量PCR（real-time PCR）和蛋白免疫印跡法（western-blot）檢測四株細(xì)胞中IQGAP1蛋白的表達(dá)水平和mRNA水平的干擾后效果

對于在EBV拷貝數(shù)的細(xì)胞系C22和293-1/NL中，按照上述步驟實施干擾，36小時后分別收集細(xì)胞的總蛋白和總RNA。再運(yùn)用western-blot和real-time PCR分別檢測蛋白水平和mRNA水平的干擾后效果。

對于在高EBV拷貝數(shù)的細(xì)胞系C2089細(xì)胞和293-EBV細(xì)胞系中，需要轉(zhuǎn)染兩次才能看到效果。在轉(zhuǎn)染24小時后，傳代并重新進(jìn)行種板，將上述siRNA轉(zhuǎn)染步驟再實施一次，再收集細(xì)胞蛋白和總RNA。再運(yùn)用western-blot和real-time PCR分別檢測蛋白水平和mRNA水平的干擾后效果。

其中，熒光定量PCR的具體步驟為：

（1）組織樣本RNA提取（TRIZol）：

收取轉(zhuǎn)染36小時si-IQGAP1細(xì)胞以及對照細(xì)胞，加入1mlRNA TRIZol；室溫放置5-10分鐘，加入氯仿0.2ml于EP管中，冰上放置5分鐘，4℃離心，12000rpm，15分鐘；小心區(qū)分上層水相于新的EP管中，可重復(fù)氯仿抽提步驟；加入預(yù)冷的0.5ml異丙醇，混和均勻，放置冰上15分鐘，4℃，12000rpm離心，10分鐘后，棄去上層清液；加入75%乙醇，4℃離心，7600rpm， 5分鐘；室溫干燥5-10分鐘后，加入20ul-50ulDEPC水。在儀器NanoDrop 2000中，測定RNA濃度，OD260/280比值在1.9-2.0之間并進(jìn)行EB膠電泳檢測RNA質(zhì)量，-80℃保存。

（2）逆轉(zhuǎn)錄

對上述提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系參照Thermo Scientific Revertaid first strand cDNAsynthesis Kit說明書，進(jìn)行配置（20ul）：

Total RNA 2ug

dNTP(10mM) 2ul

RNasin 1ul

5x Buffer 4ul

M-MuLV Reversr Transcriptase(200U/uL) 1ul

Oligo (dT18) primer 1ul

Water,nuclease-free補(bǔ)至20ul總體系

程序：42℃，60分鐘；70℃，5分鐘；反應(yīng)結(jié)束。

（3）Realtime-PCR

將逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)物稀釋五倍后，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR反應(yīng)體系（25ul）：

LMP1引物：

正向：5'-TGAACACCACCACGATGACT-3'

反向：5'-GTGCGCCTAGGTTTTGAGAG-3'

所用內(nèi)參基因β-actin引物序列為：

正向：5'-TCACCAACTGGGACGACATG-3'

反向：5'-GTCACCGGAGTCCATCACGAT-3'

Realtime PCR反應(yīng)體系參照Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2x)說明書，進(jìn)行配置（25ul）:

2×SYBR Green qPCR Master Mix(2x) 12.5ul

上下游引物 2ul

模板cDNA 2ul

Water,nuclease-free補(bǔ)至25ul總體系。

PCR程序：95℃，10分鐘；①95℃，30秒；②58℃30秒；③72℃ 30秒；①②③進(jìn)行45個循環(huán),終止反應(yīng)。

蛋白免疫印跡法（Western Blot）的具體步驟為：

（1）總蛋白提?。菏杖?shù)期生長的細(xì)胞，用PBS洗兩次，加入適量的蛋白裂解液（含有1%PMSF），振蕩器上震蕩混勻置于冰上20-45分鐘，12000rpm，離心25分鐘，取上清移到干凈的EP 管中待用。按照BCA法測定提取蛋白的濃度。取總蛋白 30-50 ug，加入適量的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 度沸水浴10分鐘。

（2）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據(jù)待檢測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量選擇分離膠的濃度， 分離膠配制好以后， 用水覆蓋于分離膠上方。 待分離膠完全凝固以后再配制集成膠，并立即插好上樣梳子。待其凝固后拔出梳子倒入電泳液準(zhǔn)備電泳，準(zhǔn)備上樣。將準(zhǔn)備好的蛋白總量一致的蛋白樣品按照適當(dāng)?shù)捻樞蚣尤氲缴蠘涌字?，并在合適的位置加入預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker。起始電壓為70V，30分鐘；待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，電壓為80V，約2小時，在溴酚藍(lán)接近分離膠底部時停止電泳。

（3）轉(zhuǎn)膜：將合適大小的PVDF 膜用甲醇潤濕3-5分鐘。再PVDF 膜覆于電泳凝膠上，PVDF 膜和凝膠的非接觸面均覆蓋濾紙和海綿，置于裝有預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液的電泳槽中。轉(zhuǎn)膜條件：電壓80V，約90分鐘。

（4）封閉：將轉(zhuǎn)膜完成的PVDF 膜放入現(xiàn)配的封閉液（含5%脫脂奶的PBST）中，膜正面向上，置于搖床上，室溫1-2小時。

（5）孵抗體：封閉結(jié)束后，孵上用封閉液（含5%脫脂奶的PBST）配置的一抗，4℃過夜。將孵一抗過夜的PVDF膜用 PBST 置于搖板上漂洗3 次，每次20 分鐘，孵上二抗，37℃， 1 小時。再用 PBST漂洗 3 次，每次10-20分鐘。

（6）顯影：按照化學(xué)發(fā)光ECL試劑盒配置發(fā)光液，在BIO-RAD 化學(xué)發(fā)光成像儀器上成像，保存結(jié)果圖片。

在EBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，RNA干擾IQGAP1的表達(dá)，EB病毒潛伏蛋白表達(dá)下降（見圖4至圖8）。圖4和圖5在EBV陽性細(xì)胞293-EBV中，3條siRNA干擾IQGAP1的表達(dá)，其中圖4可以看出干擾效果及EBNA1的蛋白表達(dá)下降情況，圖5可以看出LMP1的轉(zhuǎn)錄水平下降顯著。圖6、圖7和圖8是在EBV陽性細(xì)胞293-1/NL中使用第1號siRNA干擾IQGAP1表達(dá)的結(jié)果，其中圖6顯示出干擾效果，從圖7可以看出EBNA1的轉(zhuǎn)錄水平下降顯著，從圖8可以看出LMP1的轉(zhuǎn)錄水平下降顯著。

實施例4：siRNA-IQGAP1在EBV陽性的鼻咽癌細(xì)胞系C666-1中使用效果

運(yùn)用如實施例3所述的方法，檢測siRNA-IQGAP1在EBV陽性的鼻咽癌細(xì)胞系C666-1中使用效果。本實施例采用的siRNA為第1號siRNA-IQGAP1，序列為：正義鏈：5' CGACCUGGCUUUAGAACAA dTdT 3'，反義鏈：3' dTdT GCUGGACCGAAAUCUUGUU 5' 。檢測結(jié)果如圖9至圖11所示。

如圖9至圖11所示，siRNA-IQGAP1干擾EBV陽性的鼻咽癌細(xì)胞系C666-1中的IQGAP1表達(dá)，EB病毒潛伏蛋白表達(dá)下降。其中圖9顯示出干擾效果；圖10顯示出干擾后EBNA1的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降；圖11顯示出干擾后LMP1轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大學(xué)

<120> siRNA-IQGAP1及其在制備EBV相關(guān)性腫瘤藥物中的用途

<130> CSU20161-3003

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cgaccuggcu uuagaacaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gcuggaccga aaucuuguu 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

caauugagca guucaguua 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

guuaacucgu caagucaau 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

gaaauauaca gcagcaaga 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

cuuuauaugu cgucguucu 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

cgacctggct ttagaacaa 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

caattgagca gttcagtta 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

gaaatataca gcagcaaga 19