本發(fā)明涉及生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種截短的輪狀病毒VP4蛋白，其編碼序列和制備方法，包含所述蛋白的藥物組合物和疫苗，所述蛋白、藥物組合物和疫苗可用于預(yù)防、減輕或治療輪狀病毒的感染及由輪狀病毒的感染所導(dǎo)致的疾病，例如輪狀病毒性胃腸炎和腹瀉等。本發(fā)明還涉及上述蛋白用于制備藥物組合物或疫苗的用途，所述藥物組合物或疫苗用于預(yù)防、減輕或治療輪狀病毒的感染及由輪狀病毒的感染所導(dǎo)致的疾病，例如輪狀病毒性胃腸炎和腹瀉等。
背景技術(shù)：
：：輪狀病毒(rotavirus,RV)屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體，在1973年由Bishop在胃腸炎病人的十二指腸中發(fā)現(xiàn)(Bishop,Davidson,Holmes,etal.Lancet,2(7841),1281-1283,1973)。研究表明，95％以上的兒童在5歲前至少感染過一次輪狀病毒。據(jù)WHO統(tǒng)計，每年因輪狀病毒感染而導(dǎo)致的死亡病例高達(dá)60萬，而腹瀉病例則高達(dá)2億；僅在美國，每年因輪狀病毒感染而造成的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)10億美元(Hsu,Staat,Roberts,etal.Pediatrics,115(1),78-82,2005；Tate,Burton,Boschi-Pinto,etal.TheLancetInfectiousDiseases,12(2),136-141,2011)，這造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會負(fù)擔(dān)。輪狀病毒為無包膜RNA病毒，其基因組由11條雙鏈RNA組成，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4，VP6和VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP6)(EstesandCohen.MicrobiolRev,53(4),410-449,1989)。輪狀病毒為二十面體對稱，其衣殼由三個同心層構(gòu)成，即由VP1、VP2和VP3構(gòu)成的核心層，由VP6構(gòu)成的內(nèi)衣殼，以及由VP4和VP7構(gòu)成的外衣殼。VP6蛋白是輪狀病毒中含量最高的衣殼蛋白。根據(jù)VP6的抗原性，可以將輪狀病毒分為A-G7個組，其中A組輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體。VP4和VP7為主要中和抗原，根據(jù)二者抗原性的不同可將A組輪狀病毒分為不同的P血清型和G血清型。G血清型和P血清型相互獨立又相互影響，常見的組合包括G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]和G4P[8]。近年來，G9P[8]和G9P[6]的流行顯著增加(Li,Liu,Yu,etal.Vaccine,27F40-F45,2009)。目前尚無針對輪狀病毒的特效藥。安全有效的疫苗是控制輪狀病毒感染的重要手段。經(jīng)過多年的研究，疫苗開發(fā)歷經(jīng)單價減毒疫苗，多價基因重配疫苗和基因工程疫苗三個階段。目前已有五種輪狀病毒疫苗相繼上市，包括惠氏的四價人-猿基因重配疫苗，蘭州所的單價減毒疫苗、默克的五價人-牛基因重配疫苗、葛蘭素史克的單價減毒疫苗和印度巴拉特的單價減毒疫苗。然而，這些疫苗均為減毒活疫苗，存在較大的安全隱患，其中：惠氏的疫苗由于腸套疊問題在上市半年后即被撤回(Murphy,Gargiullo,Massoudi,etal.344(8),564-572,2001)；默克和葛蘭素史克的疫苗盡管經(jīng)過大量的臨床實驗證實其安全性和有效性(Bernstein,Sack,Rothstein,etal.Lancet(Britishedition),354(9175),287-290,1999；Vesikari,Matson,Dennehy,etal.NewEnglandJournalofMedicine,354(1),23-33,2006；Linhares,Velázquez,Pérez-Schael,etal.Lancet,371(9619),1181-1189,2008；Vesikari,Itzler,Karvonen,etal.Vaccine,28(2),345-351,2009；Snelling,Andrews,Kirkwood,etal.ClinicalInfectiousDiseases,52(2),191-200,2011)，但其在亞洲和非洲等輪狀病毒死亡率較高的國家和地區(qū)的保護(hù)效率遠(yuǎn)低于歐美等發(fā)達(dá)國家(Armah,Sow,Breiman,etal.Lancet,376606-614,2010；Zaman,Anh,Victor,etal.Lancet,376568-570,2010；Madhi,Cunliffe,Steele,etal.NEnglJMed,362(4),289-298,2011)，并且越來越多的證據(jù)表明，二者接種后均產(chǎn)生排毒并可導(dǎo)致病毒的水平傳播(Anderson.LancetInfectDis,8(10),642-9,2008；Rivera,Pena,Stainier,etal.Vaccine,29(51),9508-9513,2011；Yen,Jakob,Esona,etal.Vaccine,29(24),4151-5,2011)，并且還有研究表明，免疫缺陷兒童接種疫苗后可產(chǎn)生嚴(yán)重的胃腸炎(Steele,Cunliffe,Tumbo,etal.JInfectDis,200Suppl1S57-62,2009；Patel,Hertel,Estes,etal.NEnglJMed,362(4),314-9,2010)；蘭州所的疫苗上市十多年，至今尚未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重問題，但僅能預(yù)防嚴(yán)重腹瀉，而不能預(yù)防輪狀病毒的感染(Fu,Wang,Liang,etal.Vaccine,25(52),8756-61,2007)。因此，盡管輪狀病毒減毒疫苗的研究取得了可喜的結(jié)果，但也還存在一定的問題，其安全性和有效性還有待進(jìn)一步提高；發(fā)展更加安全、有效的疫苗勢在必行。非復(fù)制型疫苗是目前輪狀病毒疫苗研究的主要方向，其中基因工程疫苗由于成本低，安全、有效等特點而備受關(guān)注。VP4和VP7蛋白作為輪狀病毒的中和抗原，均可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，從而抑制輪狀病毒的感染。因此，VP4和VP7均是輪狀病毒亞單位疫苗的主要候選抗原。VP7蛋白為糖基化蛋白，含有4對鏈內(nèi)二硫鍵，形成Ca2+依賴性的三聚體，重組表達(dá)的VP7蛋白刺激機體產(chǎn)生的中和抗體水平較低。VP4蛋白無糖基化修飾，重組表達(dá)的VP4蛋白則可以刺激機體產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答，并降低乳鼠腹瀉的水平(Mackow,Vo,Broome,etal.JVirol,64(4),1698-703,1990)。另一方面，常見的P血清型僅2種，而常見的G血清型有5種。因此，相比于VP7蛋白，VP4蛋白更適合作為輪狀病毒基因工程疫苗的候選抗原。VP4蛋白由776個氨基酸組成，可以被胰酶酶切形成VP8*(aa1-231)和VP5*(aa248-776)兩部分。VP4蛋白由頭部、頸部和基座三個部分構(gòu)成，其作為輪狀病毒的刺突蛋白，在輪狀病毒的感染中發(fā)揮著重要的作用。刺突的頭部由兩個分子的VP8蛋白組成，VP8蛋白可以與細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合，從而介導(dǎo)輪狀病毒的吸附過程。頸部由三個分子的VP5抗原區(qū)組成，其中兩個分子的VP5抗原區(qū)形成二聚體，另一個VP5抗原區(qū)以單體形式存在。在輪狀病毒感染過程中，VP4的結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，暴露出VP5膜融合位點并介導(dǎo)輪狀病毒的入胞過程；在此過程中，VP5抗原區(qū)由二聚體轉(zhuǎn)變?yōu)槿垠w?；糠钟扇齻€分子的VP5蛋白C端結(jié)構(gòu)域組成，并且通過該結(jié)構(gòu)域插入外衣殼和內(nèi)衣殼。VP8蛋白的N端25個氨基酸形成α螺旋，三個α螺旋形成螺旋束插入VP5基座部分，并通過一段柔性連接區(qū)與VP8頭部相連，該連接區(qū)的結(jié)構(gòu)目前尚未完全解析(Settembre,Chen,Dormitzer,etal.EMBOJ,30(2),408-16,2011)。研究表明，VP4蛋白的中和表位主要位于VP8頭部和VP5抗原區(qū)，針對VP8的中和抗體可以抑制輪狀病毒的吸附過程，針對VP5的中和抗體具有交叉中和活性，可以抑制輪狀病毒的入胞(Dormitzer,Nason,VenkataramPrasad,etal.Nature,430(7003),1053-1058,2004；Abdelhakim,Salgado,Fu,etal.PLoSPathog,10(9),e1004355,2014)。同時，合成肽掃描的結(jié)果表明，VP8蛋白的N端α螺旋區(qū)和連接區(qū)也存在中和表位(Kovacs-Nolan,YooandMine.BiochemJ,376(Pt1),269-75,2003)。大量研究結(jié)果表明，VP4蛋白可以刺激機體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答(Dunn,Fiore,Werner,etal.ArchVirol,140(11),1969-78,1995；Gil,DeSouza,Asensi,etal.ViralImmunology,13(2),187-200,2000)。然而，通過真核系統(tǒng)來表達(dá)VP4蛋白的周期長、成本高而且表達(dá)量低；并且，全長的VP4蛋白在原核系統(tǒng)中主要以包涵體形式表達(dá)，難以純化且無法維持其天然構(gòu)象。聞小波等人通過截短表達(dá)的方式解決了VP8蛋白在原核系統(tǒng)中以包涵體形式表達(dá)的問題，獲得了在大腸桿菌中能夠以可溶形式高效表達(dá)的截短VP8蛋白(△VP8*，aa65-223)(Wen,Cao,Jones,etal.Vaccine,30(43),6121-6,2012)；但是，該截短VP8蛋白的免疫原性顯著低于全長的VP8蛋白。為了解決截短VP8蛋白免疫原性較低的問題，我們實驗室在進(jìn)行了深入研究后，獲得了免疫原性更高的新的VP8截短蛋白，其在弗氏佐劑條件下免疫小鼠后，可以刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的中和抗體并可以降低子代乳鼠的腹瀉水平；并且，其可以與分子內(nèi)佐劑進(jìn)行融合表達(dá)，產(chǎn)生免疫原性和免疫保護(hù)性更高的融合蛋白(CN201510165746.2)。盡管該新的VP8截短蛋白及其融合蛋白已實現(xiàn)了顯著有利的技術(shù)效果，但其也仍然存在著不足。例如，針對VP8蛋白的抗體主要是血清型特異性抗體，因此，該新的VP8截短蛋白用作疫苗時對異型毒株的中和活性顯著低于同型毒株(Wen,Cao,Jones,etal.Vaccine,30(43),6121-6,2012)。此外，后續(xù)的研究還發(fā)現(xiàn)，該新的VP8截短蛋白在鋁佐劑條件下，免疫保護(hù)性不夠理想，有待進(jìn)一步提高。因此，本領(lǐng)域仍然需要開發(fā)新的針對輪狀病毒的疫苗，其能夠方便地、高表達(dá)量地產(chǎn)生(例如通過可溶性表達(dá)和純化的方法)，能夠比現(xiàn)有的疫苗(例如上述VP8截短蛋白)具有更強的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的針對輪狀病毒的中和抗體(特別是在鋁佐劑條件下)，從而使得能夠大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)高效的抗輪狀病毒疫苗。技術(shù)實現(xiàn)要素：本申請的發(fā)明人經(jīng)過大量研究后出人意料地發(fā)現(xiàn)：N端截短了1-64個氨基酸(例如，5-64個氨基酸)，且C端終止于氨基酸位置276-497之間的VP4蛋白能夠在大腸桿菌中以可溶形式表達(dá)，且能夠通過色譜層析容易地進(jìn)行純化；并且，由此所獲得的高純度截短蛋白(純度可達(dá)到至少50％或更高，例如60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％)具有良好的均一性和免疫原性，且能夠在鋁佐劑的條件下，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的針對輪狀病毒的中和抗體，從而有效地解決了上述技術(shù)問題。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及N端截短了1-64個氨基酸(例如5-64個氨基酸)，且C端終止于氨基酸位置276-497之間的輪狀病毒VP4蛋白或其變體。在一個方面，本發(fā)明涉及一種截短的輪狀病毒VP4蛋白或其變體，其與野生型輪狀病毒VP4蛋白相比，N端截短了1-64個氨基酸(例如5-64個氨基酸)，并且C端終止于野生型輪狀病毒VP4蛋白的下述位置：與SEQIDNO:40的氨基酸位置276-497中的任一位置相對應(yīng)的位置。在某些優(yōu)選的實施方案中，與野生型輪狀病毒VP4蛋白相比，該截短的輪狀病毒VP4蛋白的N端截短了1-64個氨基酸，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個或64個氨基酸(例如，1-5個，5-25個，5-21個，21-25個，21-64個，或25-64個氨基酸，例如1個、5個、21個、25個、或64個氨基酸)；并且C端終止于野生型輪狀病毒VP4蛋白的下述位置：與SEQIDNO:40的氨基酸位置276-497(例如氨基酸位置281-497、291-497、301-497、311-497、321-497、331-497、341-497、351-497、361-497、371-497、381-497、391-497、401-497、411-497、421-497、431-497、441-497、451-497、461-497、471-497、476-497、482-497、487-497、或492-497)中的任一位置相對應(yīng)的位置，例如C端終止于下述位置：與SEQIDNO:40的氨基酸位置276、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、476、482、487、492或497相對應(yīng)的位置(例如，與SEQIDNO:40的氨基酸位置331、351、381、411、441、461、471、476、482、487、492或497相對應(yīng)的位置)。在某些優(yōu)選的實施方案中，與野生型輪狀病毒VP4蛋白相比，該截短的輪狀病毒VP4蛋白的N端截短了1個、5個、21個、25個、或64個氨基酸，并且C端終止于野生型輪狀病毒VP4蛋白的下述位置：與SEQIDNO:40的氨基酸位置276、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、476、482、487、492或497相對應(yīng)的位置(例如，與SEQIDNO:40的氨基酸位置331、351、381、411、441、461、471、476、482、487、492或497相對應(yīng)的位置)。在某些優(yōu)選的實施方案中，與野生型輪狀病毒VP4蛋白相比，該截短的輪狀病毒VP4蛋白具有選自下列的一個特征：(1)N端截短了25個氨基酸且C端終止于下述位置：與SEQIDNO:40的氨基酸位置276、281、291、301、311、321、331、341、351、361、371、381、391、401、411、421、431、441、451、461、471、476、482、487、492或497相對應(yīng)的位置(優(yōu)選地，與SEQIDNO:40的氨基酸位置331、351、381、411、441、461、471、476、482、487、492或497相對應(yīng)的位置)；(2)N端截短了1個氨基酸且C端終止于與SEQIDNO:40的氨基酸位置476相對應(yīng)的位置；(3)N端截短了5個氨基酸且C端終止于與SEQIDNO:40的氨基酸位置476相對應(yīng)的位置；(4)N端截短了21個氨基酸且C端終止于與SEQIDNO:40的氨基酸位置476相對應(yīng)的位置；和(5)N端截短了64個氨基酸且C端終止于與SEQIDNO:40的氨基酸位置476相對應(yīng)的位置。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述野生型輪狀病毒VP4蛋白是來源于輪狀病毒LLR株、SA11株、EDIM株的VP4蛋白，或者是來源于P[4]、P[6]、或P[8]基因型輪狀病毒的VP4蛋白；在某些優(yōu)選的實施方案中，所述野生型輪狀病毒VP4蛋白具有選自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:40和87-91。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述截短的輪狀病毒VP4蛋白(以下也簡稱為截短蛋白)具有選自下列的氨基酸序列：SEQIDNO:2-5和10-39。在另一個方面，本發(fā)明涉及編碼上述截短蛋白或其變體的多核苷酸以及含有該多核苷酸的載體?？捎糜诓迦肽康亩嗪塑账岬妮d體是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于克隆載體和表達(dá)載體。在一個實施方案中，載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體等等。在另一個方面，本發(fā)明還涉及包含上述多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和動物細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞，例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等)。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以是細(xì)胞系，例如293T細(xì)胞。然而，特別優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞。在另一個方面，本發(fā)明還涉及一種多聚體，其包含上述截短蛋白或其變體或者由上述截短蛋白或其變體組成。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述多聚體為三聚體。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述多聚體為分子量至少600kDa的多聚體。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述多聚體包含截短的輪狀病毒VP4蛋白，其與野生型輪狀病毒VP4蛋白相比，N端截短了25個氨基酸，并且C端終止于野生型輪狀病毒VP4蛋白中的、與SEQIDNO:40的氨基酸位置476相對應(yīng)的位置。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述多聚體包含截短的輪狀病毒VP4蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:30所示。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述多聚體為三聚體或者分子量至少600kDa的多聚體，其包含如SEQIDNO:30所示的截短的輪狀病毒VP4蛋白。在另一個方面，本發(fā)明還涉及包含上述截短蛋白或其變體，或上述多核苷酸，或上述載體，或上述宿主細(xì)胞，或上述多聚體的組合物。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的截短蛋白或其變體。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的多聚體。在另一個方面，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物(例如疫苗)，其包含本發(fā)明的截短蛋白或其變體或者本發(fā)明的多聚體，任選地還包含藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物(例如疫苗)可以用于預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病例如輪狀病毒性胃腸炎或腹瀉等。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的截短蛋白或其變體或者本發(fā)明的多聚體以預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病的有效量存在。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物(例如疫苗)還包含另外的活性成分。優(yōu)選地，所述另外的活性成分能夠預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物(例如疫苗)還包含佐劑，例如鋁佐劑。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物還包含藥學(xué)可接受的載體，賦形劑，穩(wěn)定劑或能夠為所述藥物組合物的施用(例如施用給人受試者)提供有利性質(zhì)的其他試劑。合適的藥物載體包括例如，無菌水，鹽水，葡萄糖，蓖麻油和環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，液體酸，低級醇(例如C1-4醇)，油(例如玉米油，花生油，芝麻油；其任選還包含乳化劑例如脂肪酸的單-或二-甘油酯或磷脂例如卵磷脂)，乙二醇，聚亞烷基二醇，藻酸鈉，聚(乙烯基吡咯烷酮)等等。所述載體任選地還可包含佐劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，潤濕劑，乳化劑，滲透增強劑等。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物是無菌的。此外，所述藥物組合的粘度可通過選擇合適的溶劑或賦形劑來控制和維持。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物經(jīng)配制具有4.5-9.0，5.0-8.0，6.5-7.5，或6.5-7.0的pH。本發(fā)明的藥物組合物(例如疫苗)可通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行施用，例如但不限于通過口服或者注射進(jìn)行施用。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物(例如疫苗)以單位劑量形式進(jìn)行施用。預(yù)防或治療特定病況所需的本發(fā)明藥物組合物(例如疫苗)的量將取決于施用途徑、待治療的病況的嚴(yán)重程度、患者的性別、年齡、體重和總體健康情況等等，其可由醫(yī)生根據(jù)實際情況合理確定。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種制備上述截短蛋白或其變體的方法，其包括，在允許所述截短蛋白或其變體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；和，回收所表達(dá)的截短蛋白或其變體。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括，利用大腸桿菌來表達(dá)本發(fā)明的截短蛋白或其變體，然后將所述大腸桿菌裂解，并從裂解液中純化獲得該截短蛋白或其變體。在某些優(yōu)選的實施方案中，純化包括層析。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述純化包括，兩步層析法。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述兩步層析法包括：陰離子交換層析(例如，使用Q-sepharose-HP的陰離子交換層析)；和，隨后的疏水親和層析(例如，使用Phenylsepharose-HP的疏水親和層析)。在另一個方面，本發(fā)明還涉及一種制備疫苗的方法，其包括將本發(fā)明的截短蛋白或其變體或者本發(fā)明的多聚體與藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑混合，任選地還混合佐劑例如鋁佐劑，和/或另外的活性成分，例如能夠預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病的另外的活性成分。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述制備疫苗的方法包括下述步驟：將本發(fā)明的截短蛋白或其變體或者本發(fā)明的多聚體與佐劑(例如鋁佐劑)混合。如上所論述的，所獲得的疫苗可以用于預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病例如輪狀病毒性胃腸炎和腹瀉等。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種在受試者中預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病的方法，其包括將預(yù)防或治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的截短蛋白或其變體或者本發(fā)明的多聚體或者本發(fā)明的藥物組合物施用給所述受試者。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病包括但不限于，輪狀病毒性胃腸炎和腹瀉。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述受試者是哺乳動物，例如小鼠和人。在另一個方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的截短蛋白或其變體或者本發(fā)明的多聚體在制備藥物組合物(例如疫苗)中的用途，所述藥物組合物(例如疫苗)用于在受試者中預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病包括但不限于，輪狀病毒性胃腸炎和腹瀉。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述受試者是哺乳動物，例如小鼠和人。在另一個方面，本發(fā)明還涉及上述的截短蛋白或其變體或者上述的多聚體，其用于在受試者中預(yù)防或治療輪狀病毒感染或由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病包括但不限于，輪狀病毒性胃腸炎和腹瀉。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述受試者是哺乳動物，例如小鼠和人。本發(fā)明中相關(guān)術(shù)語的說明及解釋在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實驗室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。根據(jù)本發(fā)明，表述“N端截短了X個氨基酸”是指，用起始密碼子編碼的甲硫氨酸殘基替代蛋白質(zhì)N末端的第1-X位氨基酸殘基。例如，N端截短了25個氨基酸的輪狀病毒VP4蛋白是指，用起始密碼子編碼的甲硫氨酸殘基替代野生型輪狀病毒VP4蛋白N末端的第1-25位氨基酸殘基所獲得的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，表述“C端終止于氨基酸位置X”是指，氨基酸位置X之后(即，自氨基酸位置X+1開始)的氨基酸殘基全部被缺失。例如，C端終止于野生型輪狀病毒VP4蛋白的氨基酸位置441是指，在野生型輪狀病毒VP4蛋白的氨基酸位置441之后(即，自氨基酸位置442開始)的氨基酸殘基全部被缺失。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“變體”是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與本發(fā)明的截短的輪狀病毒VP4蛋白的氨基酸序列相比，具有一個或多個(例如1-10個或1-5個或1-3個)氨基酸不同(例如保守氨基酸置換)或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了所述截短蛋白的必要特性。此處術(shù)語“必要特性”可以是如下特性中的一個或者多個：(i)其能夠在大腸桿菌中可溶性表達(dá)；(ii)其能夠通過色譜層析容易地進(jìn)行純化；(iii)其在純化后擁有良好的均一性和穩(wěn)定性(不易于降解)；(iv)其能夠特異性結(jié)合抗VP4抗體，所述抗VP4抗體能夠體外抑制病毒對細(xì)胞的感染；(v)其能夠與輪狀病毒競爭性結(jié)合細(xì)胞受體，抑制病毒對細(xì)胞的感染；(vi)其能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的針對輪狀病毒的中和抗體；(vii)其能夠保護(hù)受試者(如人和小鼠)，抵抗輪狀病毒的感染。優(yōu)選地，本發(fā)明的“變體”保留了截短蛋白的所有上述特性。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當(dāng)兩個進(jìn)行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據(jù))，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置數(shù)目×100的函數(shù)。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個序列比對以產(chǎn)生最大同一性時進(jìn)行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地進(jìn)行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法來實現(xiàn)。還可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120權(quán)重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性。此外，可使用已整合入GCG軟件包(可在www.gcg.com上獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重來測定兩個氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性。如本文中使用的，術(shù)語“保守置換”意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物學(xué)活性的氨基酸置換。例如，可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學(xué)上或功能上與相應(yīng)的氨基酸殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進(jìn)行的置換。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應(yīng)的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通過引用并入本文)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成的表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場上可得到的菌株，例如但不限于：GI698、ER2566、BL21(DE3)、B834(DE3)、BLR(DE3)等等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“載體(vector)”是指，可將多核苷酸插入其中的一種核酸運載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸所編碼的蛋白獲得表達(dá)時，載體稱為表達(dá)載體。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒等等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“VP4蛋白”、“VP4全長蛋白”和“輪狀病毒VP4蛋白”可互換使用，其是指與VP7一起共同構(gòu)成RV病毒顆粒外衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白。VP4蛋白的氨基酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且見于各種公共數(shù)據(jù)庫(例如GenBank數(shù)據(jù)庫)。例如，VP4蛋白的示例性氨基酸序列可如SEQIDNO：40和87-91所示。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“截短的輪狀病毒VP4蛋白”是指，在野生型輪狀病毒VP4蛋白的N端和/或C端去掉一個或者多個氨基酸后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其中，野生型輪狀病毒VP4蛋白的具體氨基酸序列可從公共數(shù)據(jù)庫(例如GenBank數(shù)據(jù)庫)容易地獲得，例如GenBank登錄號AEV53329.1、BAA03850.1、AAB94758.2、AIS93087.1、ACJ06216.1和AAA66953.1。在本發(fā)明中，野生型輪狀病毒LLR的VP4蛋白的示例性氨基酸序列如SEQIDNO：40所示。因此，在本發(fā)明中，當(dāng)涉及VP4蛋白的序列時，其使用SEQIDNO:40所示的序列來進(jìn)行描述。例如，表述“VP4蛋白的氨基酸位置276-497”是指，SEQIDNO:40的氨基酸位置276-497。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可在SEQIDNO:40中天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異(包括但不限于，置換，缺失和/或添加)，而不影響VP4蛋白的生物學(xué)特性。例如，輪狀病毒的不同病毒株的VP4蛋白可在氨基酸序列上天然存在差異，但具有實質(zhì)上相同的生物學(xué)特性。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“VP4蛋白”意欲包括所有此類多肽和變體，包括SEQIDNO:40所示的多肽以及其天然或人工的變體，所述變體保留了VP4蛋白的生物學(xué)特性。并且，當(dāng)描述VP4蛋白的序列片段和氨基酸位置時，其不僅包括SEQIDNO:40所示的多肽的序列片段和氨基酸位置，還包括該多肽的天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段和氨基酸位置。例如，表述“VP4蛋白的氨基酸位置276-497”意欲包括，SEQIDNO:40的氨基酸位置276-497，以及SEQIDNO:40所示的多肽的變體(天然或人工)中的相應(yīng)氨基酸位置。在本發(fā)明中，野生型輪狀病毒SA11、EDIM、P[4]、P[6]、P[8]的VP4蛋白的示例性氨基酸序列分別如SEQIDNO：87-91所示。根據(jù)本發(fā)明，表述“相應(yīng)序列片段”或“相應(yīng)片段”是指，當(dāng)對序列進(jìn)行最優(yōu)比對時，即當(dāng)序列進(jìn)行比對以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性時，進(jìn)行比較的序列中位于等同位置的片段。根據(jù)本發(fā)明，表述“相應(yīng)氨基酸位置”是指，當(dāng)對序列進(jìn)行最優(yōu)比對時，即當(dāng)序列進(jìn)行比對以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性時，進(jìn)行比較的序列中位于等同位置的氨基酸位點/殘基。在本發(fā)明中，術(shù)語“截短的輪狀病毒VP4蛋白基因片段”是指這樣的基因片段，其與野生型輪狀病毒VP4蛋白基因相比，在5'端或3'端缺失編碼一個或多個氨基酸的核苷酸，其中野生型輪狀病毒VP4蛋白基因的全長序列從公共數(shù)據(jù)庫(例如GenBank數(shù)據(jù)庫)容易地獲得，例如GenBank登錄號JQ013506.1、D16346.1、AF039219.2、KJ940075.1、FJ183356.1和L34161.1。例如，野生型輪狀病毒LLR的VP4蛋白基因的核苷酸序列可如SEQIDNO：40所示。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“多聚體”是指，以多肽分子(例如，本發(fā)明的截短蛋白)為單體構(gòu)成的聚合體，其通常可包含至少2個(例如，3個，4個，5個或更多個)多肽單體(例如，本發(fā)明的截短蛋白)。在此類多聚體中，單體分子通過分子間相互作用(例如氫鍵、范德華力、疏水相互作用)而聚合形成多聚體。在本發(fā)明的某些實施方案中，多聚體是包含3個單體的三聚體。在本發(fā)明的某些實施方案中，多聚體是包含多個單體、且分子量為至少600kDa的多聚體(此類多聚體在本文中也被稱為高聚體)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學(xué)和/或生理學(xué)上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領(lǐng)域公知的(參見例如Remington'sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.Pennsylvania:MackPublishingCompany,1995)，并且包括但不限于：pH調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，pH調(diào)節(jié)劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80；佐劑包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)，弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑)；離子強度增強劑包括但不限于氯化鈉。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“佐劑”是指非特異性免疫增強劑，當(dāng)其與抗原一起或預(yù)先遞送入機體時，其可增強機體對抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。佐劑有很多種，包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)、弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)、短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子等。弗氏佐劑是目前動物試驗中最常用的佐劑。氫氧化鋁佐劑則在臨床實驗中使用較多。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選地，佐劑為鋁佐劑。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“有效量”是指能夠有效實現(xiàn)預(yù)期目的的量。例如，預(yù)防或治療疾病(例如輪狀病毒感染)有效量是指，能夠有效預(yù)防、阻止或延遲疾病(例如輪狀病毒感染)的發(fā)生、或緩解、減輕或治療已有的疾病(例如由輪狀病毒感染所導(dǎo)致的疾病)的嚴(yán)重程度的量。測定這樣的有效量在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，對于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴(yán)重度、患者自己的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“色譜層析”包括但不限于：離子交換色譜(例如陽離子交換色譜)、疏水相互作用色譜、吸附層析法(例如羥基磷灰石色譜)、凝膠過濾(凝膠排阻)層析、親和層析法。根據(jù)本發(fā)明，宿主細(xì)胞的裂解/破碎可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來實現(xiàn)，包括但不限于勻漿器破碎、均質(zhì)機破碎、超聲波處理、研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理等等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“免疫原性(immunogenicity)”是指，能夠刺激機體形成特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)如抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性，也指抗原刺激機體后，機體免疫系統(tǒng)能形成抗體或致敏T淋巴細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中，術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”具有相同的含義，可互換使用。并且在本發(fā)明中，氨基酸通常用本領(lǐng)域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。如本文中使用的，“受試者”是指動物，例如脊椎動物。優(yōu)選地，受試者為哺乳動物，例如人，?？苿游铮R科動物，貓科動物，犬科動物，嚙齒類動物或靈長類動物。特別優(yōu)選地，受試者為人。在本文中，該術(shù)語可以與“患者”互換使用。發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的截短的輪狀病毒VP4蛋白和其制備方法有效地解決了本領(lǐng)域中存在的技術(shù)問題。首先，本發(fā)明的截短蛋白或其變體能夠在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，實現(xiàn)了高產(chǎn)率。這為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了有利條件。其次，本發(fā)明的截短蛋白或其變體的純化方式相對簡單，易于操作。特別地，在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)后，可將所述大腸桿菌裂解，然后對裂解液進(jìn)行色譜層析處理(例如通過陰離子交換層析和疏水親和層析進(jìn)行處理)，由此可獲得高純度的截短蛋白(純度可達(dá)到至少50％或更高，例如60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％)。這為大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)提供了有利條件。第三，本發(fā)明所獲得的高純度截短蛋白具有良好的均一性和穩(wěn)定性。特別地，本發(fā)明的經(jīng)純化的截短蛋白能夠以均一的形式存在，且不易于降解。這為批量化生產(chǎn)提供了有利條件，避免了不同批次間的變異性，有利于精確用藥。第四，本發(fā)明的截短蛋白或其變體能夠在鋁佐劑條件下，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的針對輪狀病毒的中和抗體。由于臨床中通常使用鋁佐劑，而不使用弗氏佐劑，因此，本發(fā)明的截短蛋白或其變體可有利地用于臨床條件，用于保護(hù)受試者，抵抗輪狀病毒感染。綜合來說，本發(fā)明的截短蛋白或其變體不僅具有易于表達(dá)、易于純化等特點，而且具有高均一性和穩(wěn)定性。更重要的是，本發(fā)明的截短蛋白或其變體具有強免疫原性，能夠在鋁佐劑條件下誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度的中和抗體，從而在臨床條件下為受試者提供強的保護(hù)作用。因此，本發(fā)明的截短蛋白或其變體使得能夠大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)高效的抗輪狀病毒疫苗，從而為本領(lǐng)域中存在的技術(shù)問題提供了有效的解決方案。下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。附圖說明圖1A顯示了經(jīng)純化的VP8-5蛋白的SDS-PAGE結(jié)果。結(jié)果顯示，所獲得的經(jīng)純化的VP8-5蛋白的純度達(dá)到90％以上。圖1B顯示了VP8-5蛋白與用其免疫Balb/c小鼠而獲得的免疫血清的間接ELISA分析的結(jié)果，其中，橫坐標(biāo)表示實驗組(VP8-5)、陽性對照組(LLR)和陰性對照組(NC)，縱坐標(biāo)表示與VP8-5蛋白具有反應(yīng)性的免疫血清的最大稀釋倍數(shù)(即，抗體滴度)。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天，VP8-5能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)抗體的產(chǎn)生，但是效率低于滅活病毒LLR。這個結(jié)果表明，在使用鋁佐劑的條件下，VP8-5蛋白具有免疫原性，能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)抗體的產(chǎn)生，但是其在動物體內(nèi)誘發(fā)抗體產(chǎn)生的能力低于滅活病毒LLR。圖1C顯示了VP8-5在Balb/c小鼠中誘發(fā)的免疫血清的中和抗體滴度的分析結(jié)果，其中，橫坐標(biāo)表示實驗組(VP8-5)、陽性對照組(LLR)和陰性對照組(NC)，縱坐標(biāo)表示達(dá)到50％感染抑制率的免疫血清最大稀釋倍數(shù)的log值(log2NT50，中和抗體滴度)。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，VP8-5在免疫后第42天(三次免疫后)能夠在小鼠體內(nèi)誘發(fā)中和抗體，但是免疫血清的中和抗體滴度(NT50)低于滅活病毒LLR。免疫程序完成后，使用VP8-5蛋白誘發(fā)的免疫血清的中和抗體滴度(NT50)僅達(dá)到64左右。這個結(jié)果表明，在使用鋁佐劑的條件下，VP8-5能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，但是其所誘發(fā)的免疫血清的中和抗體滴度低于滅活病毒LLR。圖2A-2C顯示了保護(hù)性實驗中腹瀉的評分標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)乳鼠腹瀉的不同程度，評分分為3個等級：正常糞便計為1分(圖2C)，軟糞便計為2分(圖2B)，不成形水樣便計為3分(圖2A)。圖3顯示了攻毒后不同免疫組的乳鼠的腹瀉評分情況，其中，縱軸表示腹瀉評分；橫軸表示小鼠攻毒后天數(shù)。結(jié)果顯示，實驗組(VP8-5)乳鼠的腹瀉評分與陰性對照組(NC)無顯著差異。這說明，在使用鋁佐劑的條件下，VP8-5保護(hù)機體、抵抗輪狀病毒感染的能力較低(低于滅活病毒)，不能充分緩解輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉。圖4A-4D顯示了在大腸桿菌中表達(dá)的各個截短蛋白的SDS-PAGE結(jié)果。結(jié)果顯示，除了26-311，26-331和26-381的表達(dá)量相對較低以外，其他的截短蛋白均可在大腸桿菌中高表達(dá)。圖5A-5B顯示了經(jīng)純化的各種截短VP4蛋白的SDS-PAGE結(jié)果。在圖5A中，泳道從左到右依次為：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(Marker)，1-476，6-476，22-476，26-476，65-476，26-231，26-271，26-331和26-351。在圖5B中，泳道從左到右依次為：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(Marker)，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492和26-497。圖5A和5B的結(jié)果顯示，經(jīng)過上述純化步驟后，各截短蛋白的濃度均達(dá)到0.2mg/ml以上，且純度大于80％。圖6顯示了截短蛋白1-476、6-476、22-476、26-476、26-271、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497的經(jīng)G3000PWXL分子篩分析的結(jié)果。橫坐標(biāo)軸表示保留時間，縱坐標(biāo)軸表示在280nm處的吸光度值。結(jié)果顯示，在TB8.0條件下，截短蛋白1-476以高聚體的形式存在于樣品中(出峰時間為約10-11分鐘)；26-271呈單體狀態(tài)(出峰時間為約16分鐘)，含量超過90％；其余的截短蛋白(6-476、22-476、26-476、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497)均為三聚體狀態(tài)(出峰時間為約13-14分鐘)，含量幾乎都在90％以上。在鹽存在的條件下(TB8.0+1MNaCl)，截短蛋白26-476、26-482、26-487、26-492和26-497轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w狀態(tài)(出峰時間由約13-14分鐘改變?yōu)榧s15-16分鐘)，含量均超過90％。這表明，在鹽存在的條件下，26-476、26-482、26-487、26-492和26-497的構(gòu)象受到鹽離子影響，導(dǎo)致三聚體發(fā)生解聚，形成單體。圖7顯示了截短蛋白26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461的經(jīng)G5000PWXL分子篩分析的結(jié)果。橫坐標(biāo)軸表示保留時間，縱坐標(biāo)軸表示在280nm處的吸光度值。結(jié)果顯示，在TB8.0條件下，這些截短蛋白均以高聚體的形式存在于樣品中(出峰時間為約10-11分鐘)。圖6和圖7的結(jié)果還顯示，所獲得的截短VP4蛋白的主要吸收峰所占比例幾乎都在80％或甚至90％以上；這說明，這些截短蛋白具有良好的均一性。圖8A顯示了在50mMTris-HCl(pH8.0)中37℃靜置12小時后的截短蛋白26-476的分子篩分析結(jié)果。橫坐標(biāo)軸表示保留時間，縱坐標(biāo)軸表示在280nm處的吸光度值。結(jié)果顯示，截短蛋白26-476在50mMTris-HCl(pH8.0)中37℃靜置12小時后能夠形成均一的高聚體(保留時間為12.4分鐘)，并且高聚體的比例高達(dá)97.2％。圖8B顯示了在50mMTris-HCl(pH8.0)中37℃靜置12小時后的截短蛋白26-476的電鏡觀察的結(jié)果。結(jié)果表明，截短蛋白26-476能夠在體外組裝成均一的高聚體。圖9顯示了經(jīng)酶切和未經(jīng)酶切的截短蛋白26-476，26-482，26-487，26-492，26-497的SDS-PAGE結(jié)果。泳道上的數(shù)字1表示，樣品未經(jīng)胰酶處理；數(shù)字2表示，樣品經(jīng)0.1mg/ml胰酶處理。結(jié)果顯示，上述截短蛋白均能被胰酶識別并發(fā)生酶切，其酶切位點是暴露的。圖10顯示了各種截短的VP4蛋白(1-476、6-476、22-476、65-476、26-271、26-441、26-461、26-471、26-476，26-482，26-487，26-492，26-497)與中和抗體A3(圖10A)、B1(圖10B)、B5(圖10C)、B6(圖10D)、D6(圖10E)、E2(圖10F)、E5(圖10G)、8F6(圖10H)的間接ELISA分析的結(jié)果，其中橫坐標(biāo)表示各截短蛋白，縱坐標(biāo)表示與各截短蛋白具有反應(yīng)性的一抗(A3、B1、B5、B6、D6、E2、E5、8F6)的最低抗體濃度。結(jié)果顯示，各截短蛋白均具有良好的抗原性(即，抗體反應(yīng)性)。圖11A-11D顯示了截短蛋白26-476與用各待測樣品(1-476、6-476、22-476、65-476、26-271、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461、26-471、26-476、26-482、26-487、26-492、26-497、26-476的三聚體、26-476的高聚體、滅活病毒)免疫Balb/c小鼠而獲得的免疫血清的間接ELISA分析的結(jié)果，其中，橫坐標(biāo)表示用于制備免疫血清的蛋白樣品；縱坐標(biāo)表示與26-476具有反應(yīng)性的免疫血清的最大稀釋倍數(shù)(即，抗體滴度)；RV：滅活的輪狀病毒；NC：陰性對照(PBS)；三聚體：26-476的三聚體；高聚體：26-476的高聚體。圖11A、11B、11C和11D顯示了來自不同免疫批次的結(jié)果。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天，各蛋白樣品均能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)抗體(免疫血清中的抗體滴度(GMT)均可達(dá)到102-105或更高)；并且，除了26-271外，其他蛋白樣品所誘發(fā)的抗體滴度均高于RV誘發(fā)的抗體滴度(1-476、6-476、22-476、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461、26-471、26-476、26-487、26-492、26-476的三聚體和26-476的高聚體)，或至少與RV誘發(fā)的抗體滴度相當(dāng)(65-476、26-482和26-497)。圖12A-12D顯示了各蛋白樣品(1-476、6-476、22-476、65-476、26-271、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461、26-471、26-476、26-482、26-487、26-492、26-497、26-476的三聚體、26-476的高聚體、滅活病毒)在Balb/c小鼠中誘發(fā)的免疫血清的中和抗體滴度的分析結(jié)果，其中，橫坐標(biāo)表示用于制備免疫血清的蛋白樣品；縱坐標(biāo)表示達(dá)到50％感染抑制率的免疫血清最大稀釋倍數(shù)(NT50，中和抗體滴度)；RV：滅活的輪狀病毒；NC：陰性對照(PBS)；三聚體：26-476的三聚體；高聚體：26-476的高聚體。圖12A、12B、12C和12D顯示了來自不同免疫批次的結(jié)果。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天(三次免疫后)，各蛋白樣品均能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)中和抗體，中和抗體滴度(NT50)均可達(dá)到28-214或更高的水平；并且，除了26-271外，其他蛋白樣品所誘發(fā)的中和抗體滴度均與RV誘發(fā)的中和抗體滴度相當(dāng)(6-476、22-476、26-476、65-476、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497和26-476的三聚體)，或甚至高于RV誘發(fā)的中和抗體滴度(1-476、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461和26-476的高聚體)。圖13A-13D顯示了攻毒后1-7天來自不同免疫組(用22-476，26-476，65-476，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492，26-497，26-476的三聚體，26-476的高聚體，滅活的輪狀病毒(RV，陽性對照)或PBS(NC，陰性對照)進(jìn)行免疫)的乳鼠的腹瀉評分情況，其中，縱軸表示平均腹瀉評分；橫軸表示小鼠攻毒后天數(shù)；RV：滅活的輪狀病毒；NC：陰性對照(PBS)；三聚體：26-476的三聚體；高聚體：26-476的高聚體。圖14A-14D顯示不同免疫組(用22-476，26-476，65-476，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492，26-497，26-476的三聚體，26-476的高聚體，滅活的輪狀病毒(RV，陽性對照)或PBS(NC，陰性對照)進(jìn)行免疫)的乳鼠在攻毒后的平均腹瀉持續(xù)時間和攻毒后48小時的平均腹瀉評分，其中，平均腹瀉天數(shù)以柱形圖表示，平均腹瀉評分以曲線圖表示，左縱軸表示平均腹瀉天數(shù)；右縱軸表示腹瀉評分；橫軸表示各蛋白樣品所對應(yīng)的免疫組；RV：滅活的輪狀病毒；NC：陰性對照(PBS)；三聚體：26-476的三聚體；高聚體：26-476的高聚體。圖13-14的結(jié)果顯示，在平均腹瀉評分和平均腹瀉天數(shù)方面，各蛋白樣品所對應(yīng)的免疫組均顯著優(yōu)于NC組。這表明，各蛋白樣品均具有顯著的保護(hù)性，能夠幫助小鼠抵抗輪狀病毒感染和由輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉。此外，圖13-14的結(jié)果還顯示，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-476，26-476的三聚體，以及26-476的高聚體的保護(hù)性與RV相當(dāng)，或甚至優(yōu)于RV。結(jié)合實施例1的實驗結(jié)果可知，在使用鋁佐劑的條件下，這些蛋白樣品在動物中的保護(hù)性均顯著優(yōu)于VP8-5。此外，圖13D和圖14D的實驗結(jié)果還表明，截短蛋白26-476的高聚體在動物中的保護(hù)能力顯著高于26-476的三聚體，可用于制備具有更高效力的疫苗。圖15顯示了來源于不同病毒株的26-476蛋白的SDS-PAGE結(jié)果，其中，泳道從左到右依次為：來源于輪狀病毒LLR的截短蛋白26-476；來源于輪狀病毒SA11的截短蛋白26-476-SA11；來源于輪狀病毒EDIM的26-476-EDIM；來源于輪狀病毒P[8]的截短蛋白26-476-P[8]；來源于輪狀病毒P[6]的截短蛋白26-476-P[6]；來源于輪狀病毒P[4]的截短蛋白26-476-P[4]；和，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(Marker)。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法適用于不同的輪狀病毒株；來源于不同病毒株的截短VP4蛋白(26-476)均可在大腸桿菌中有效表達(dá)，且經(jīng)色譜法純化后，其純度均可達(dá)到80％以上。圖16顯示了來源于不同毒株的的截短VP4蛋白26-476的分子篩分析結(jié)果。橫坐標(biāo)軸表示保留時間，縱坐標(biāo)軸表示在280nm處的吸光度值。結(jié)果顯示，在TB8.0條件下，來源于不同毒株的26-476蛋白均主要以三聚體的形式存在(出峰時間為約13-14分鐘)，其含量均在80％以上。這表明，在TB8.0條件下，來源于不同毒株的26-476蛋白都具有良好的均一性。圖17顯示各截短蛋白(26-476-P[4]、26-476-P[6]、26-476-P[8]、26-476-EDIM、26-476-SA11和來源于LLR的26-476)與用相應(yīng)截短蛋白免疫Balb/c小鼠而獲得的免疫血清的間接ELISA分析的結(jié)果，其中，橫坐標(biāo)表示用于制備免疫血清的截短蛋白所源自的病毒株，縱坐標(biāo)表示與相應(yīng)截短蛋白具有反應(yīng)性的免疫血清的最大稀釋倍數(shù)(即抗體滴度)；P[4]：26-476-P[4]；P[6]：26-476-P[6]；P[8]：26-476-P[8]；SA11：26-476-SA11；EDIM：26-476-EDIM；LLR：實施例4中制備的26-476。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天，來源于不同病毒株的26-476蛋白均能在小鼠體內(nèi)有效誘發(fā)抗體的產(chǎn)生，且所誘發(fā)的免疫血清中的抗體滴度(GMT)基本上相當(dāng)(抗體滴度均可達(dá)到104-105或更高，顯著高于陰性對照組)。這些結(jié)果表明，在使用鋁佐劑的條件下，來源于不同病毒株的26-476蛋白均具有良好的免疫原性，能夠在動物體內(nèi)有效誘發(fā)抗體的產(chǎn)生；并且，來源于不同病毒株的26-476蛋白的免疫原性基本上相當(dāng)，且均顯著高于VP8-5。圖18顯示了來源于不同病毒株的26-476蛋白(26-476-SA11、26-476-EDIM、來源于LLR的26-476)在Balb/c小鼠中誘發(fā)的免疫血清的中和抗體滴度的分析結(jié)果，其中，橫坐標(biāo)表示用于制備免疫血清的蛋白樣品所源自的病毒株；縱坐標(biāo)表示達(dá)到50％感染抑制率的免疫血清最大稀釋倍數(shù)(NT50，中和抗體滴度)；SA11：26-476-SA11；EDIM：26-476-EDIM；LLR：實施例4中制備的26-476。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天(三次免疫后)，SA11、EDIM和LLR毒株的26-476蛋白均能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)高滴度的中和抗體，中和抗體滴度(NT50)均可達(dá)到210-214或更高的水平；并且，26-476-SA11和26-476-EDIM所誘發(fā)的中和抗體滴度甚至高于來源于LLR的26-476。圖19A顯示了不同免疫組(用26-476-SA11或PBS(NC，陰性對照)進(jìn)行免疫)的乳鼠在用SA11病毒攻毒后1-7天的腹瀉評分；圖19B顯示了不同免疫組(用26-476-EDIM或PBS(NC，陰性對照)進(jìn)行免疫)的乳鼠用EDIM病毒攻毒后1-12天的腹瀉評分；其中，橫坐標(biāo)表示攻毒后天數(shù)，縱坐標(biāo)表示平均腹瀉評分。結(jié)果顯示，與來源于LLR的26-476類似，來源于SA11和EDIM的26-476蛋白均具有顯著的保護(hù)性，能夠幫助小鼠抵抗輪狀病毒感染和由輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉。圖19C顯示了在用EDIM攻毒后1-7天，經(jīng)26-476-EDIM或PBS(NC，陰性對照)免疫的小鼠的糞便懸液樣本中的病毒量，其中，橫坐標(biāo)表示攻毒后天數(shù)，縱坐標(biāo)表示每ml糞便懸液樣品中所含的EDIM基因組的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，在攻毒后，在用PBS免疫的小鼠的糞便中檢測到明顯的排毒，而在用26-476-EDIM免疫的小鼠的糞便中，則未檢測到排毒。圖19A-19C的結(jié)果表明，26-476-EDIM不僅能夠使小鼠抵抗輪狀病毒感染以及由輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉，而且能夠抑制病毒在小鼠糞便中的排放(即，排毒)。序列信息本發(fā)明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。表1：序列的描述序列1(SEQIDNO:1)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTR序列2(SEQIDNO:2)：MASLIYRQLLTNSYTVNLSDEIQLIGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPS序列3(SEQIDNO:3)：MYRQLLTNSYTVNLSDEIQLIGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPS序列4(SEQIDNO:4)：MIQLIGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPS序列5(SEQIDNO:5)：MLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPS序列6(SEQIDNO:6)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARR序列7(SEQIDNO:7)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVN序列8(SEQIDNO:8)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSL序列9(SEQIDNO:9)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDI序列10(SEQIDNO:10)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSI序列11(SEQIDNO:11)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKW序列12(SEQIDNO:12)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANY序列13(SEQIDNO:13)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEE序列14(SEQIDNO:14)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVN序列15(SEQIDNO:15)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGG序列16(SEQIDNO:16)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISR序列17(SEQIDNO:17)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYV序列18(SEQIDNO:18)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQA序列19(SEQIDNO:19)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSL序列20(SEQIDNO:20)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCA序列21(SEQIDNO:21)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPV序列22(SEQIDNO:22)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGS序列23(SEQIDNO:23)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTL序列24(SEQIDNO:24)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSL序列25(SEQIDNO:25)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLA序列26(SEQIDNO:26)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISR序列27(SEQIDNO:27)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLP序列28(SEQIDNO:28)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDF序列29(SEQIDNO:29)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLI序列30(SEQIDNO:30)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPS序列31(SEQIDNO:31)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPSNDDYQT序列32(SEQIDNO:32)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPSNDDYQTPIMNS序列33(SEQIDNO:33)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPSNDDYQTPIMNSVTVRQ序列34(SEQIDNO:34)：MGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPSNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQ序列35(SEQIDNO:35)：MGSEKTQNVTVNPGPFAQTRYAPVNWGHGEINDSTTVEPVLDGPYQPTTFKPPNDYWLLISSNTDGVVYESTNNSDFWTAVIAVEPHVSQTNRQYVLFGENKQFNIENSSDKWKFLEMFRGSGQSDFSNRRTLTSNNRLVGMLKYGGRVWTFHGETPRATTDSSNTADLNNISIIIHSEFYIIPRSQESKCNEYINNGLPPIQNTRNVVPLSLSSRSIQYRRAQVNEDITISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFGNSVIKLGGLGYKWSEISYKAANYQYSYSRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNGGSLPTDFSISRYEVIKENSYVYIDYWDDSKAFRNMVYVRSLAANLNSVKCVGGSYDFRLPVGEWPIMNGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVDEPSFSIIRTRTMNLYGLPAANPNNGNEYYEVSGRFSLISLVPTN序列36(SEQIDNO：36)MGSEKSQNVTINPGPFAQTNYAPVTWSHGEVNDSTTIEPVLDGPYQPTNFKPPNDYWILLNPTNQQVVLEGTNKTDIWVALLLVEPNVTNQSRQYTLFGETKQITVENNTNKWKFFEMFRSNVSAEFQHKRTLTSDTKLAGFMKFYNSVWTFHGETPHATTDYSSTSNLSEVETVIHVEFYIIPRSQESKCSEYINTGLPPMQNTRNIVPVALSSRSVTYQRAQVNEDIIISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFNNSIVKLGGLGYKWSEISFKAANYQYSYLRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNGGSLPTDFSVSRYEVIKENSYVYVDYWDDSQAFRNMVYVRSLAANLNSVKCSGGNYNFQIPVGAWPVMSGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVEEPPFSILRTRVSGLYGLPAFNPNNGHEYYEIAGRFSLISLVPSN序列37(SEQIDNO:37)：MGSEKTQNVTINPSPFAQTRYAPVNWGHGEINDSTTVEPMLDGPYQPTTFTPPNDYWILINSNTNGVVYESTNNSDFWTAVVAIEPHVNPVDRQYTIFGESKQFNVSNDSNKWKFLEMFRSSSQNEFYNRRTLTSDTRFVGILKYGGRVWTFHGETPRATTDSSSTANLNNISITIHSEFYIIPRSQESKCNEYINNGLPPIQNTRNVVPLPLSSRSIQYKRAQVNEDIIVSKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFGNSIVKMGGLGYKWSEISYKAANYQYNYLRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNGGFLPTDFGISRYEVIKENSYVYVDYWDDSKAFRNMVYVRSLAANLNSVKCTGGSYNFSIPVGAWPVMNGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVDEPPFSILRTRTVNLYGLPAANPNNGNEYYEISGRFSLIYLVPTN序列38(SEQIDNO:38)：MGAEKTQNVTVNPGPFAQTGYAPANWGPGETNDSTTVEPVLDGPYQPIAFSPPPEYYILLSPTAPGVIAECTNTVNRWIAIIAIEPNVSPTNRTYTLFGITEQLTVENSSVDKWKFIDFMKTPTTGSYVRYNILLSSTKLCAVAKHTDNLYSYVGETPTAGQAYYSSFNIFNLTAHCDFYIIPWSQQSLCTQYVNNGLPPIQNTRNVVPRHLSARSIITQRAQANEDIVVSKTSLWKEMQFNRDITIRFKFANAIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYTRDGEEVTAHTTCSVNGVNNFDFFGGSLPTDFGISRYEVIKENSFVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNTVECTGGAYSFSLPVGQWPVMTGGAVSLRAAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFRLSVEEPSFSITRTRVSGLYGLPAADPNNGREYYEIAGRFSLISLVPSND序列39(SEQIDNO:39)：MGSTKSQNVTINPGPFAQTGYAPVNWGPGEINDSTTVEPLLDGPYQPTTFNPPVDYWMLLAPTTPGVIVEGTNNTDRWLATILIEPNVQSENRTYTIFGIQEQLTVSNTSQDQWKFIDVVKTTANGSIGQYGSLLSSPKLYAVMKHNEKLYTYEGQTPNARTGHYSTTNYDSVNMTAFCDFYIIPRSEESKCTEYINNGLPPIQNTRNVVPLSLTARDVIHYRAQANEDIVISKTSLWKEMQYNRDITIRFKFANTIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYTRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFSFNGGSLPTDFVVSKFEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNVVYVRSLAANLNSVMCTGGSYNFSLPVGQWPVLTGGAVSLHSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFRLAVEEPHFKLTRTRLDRLYGLPAADPNNGKEYYEIAGRFSLISLVPS序列40(SEQIDNO:40)：MASLIYRQLLTNSYTVNLSDEIQLIGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLNGPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVANPSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYDSVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNYNGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVGQWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGRDFYEIAGRFSLILLVPSNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQLGELREEFNALSQEIAMSQLIDLALLPLDMFSMFSGIKTTIDAAKSMATNVMKKFKSSGLATSVSTLTDSLSDAASAVSRNSSIRSIGSTASAWTDISSQIVDTQASVNTLATQTSTISKRLRLKEIATQTEGMNFDDISAAVLKTKIDKSSQIGPSTLPDIVTEASEKFIPNRTYRVIDDDTVFEAGTDGRFYAYRVETFEEVPFDVQKFADLVTDSPVISAIIDFKTLKNLNDNYGITRSQALNLIRSDPRVLREFINQDNPIIRNRIEQLILQCRL序列41(SEQIDNO:41)：ATGGCTTCGCTCATTTACAGACAATTACTTACGAATTCATATACAGTGAATCTTTCAGATGAAATACAGTTAATTGGATCAGAAAAAACGCAGAGAACTACAGTAAATCCAGGTCCATTTGCACAAACTGGTTATGCACCAGTGAATTGGGGGCCTGGGGAAACGAGTGATTCCACTACTGTTGAGCCAGTGTTGAATGGACCATATCAGCCGACGACTTTCAATCCACCAGTAGAATATTGGATGCTTCTAGCACCAACATCAGAAGGGGTAGTTGTTGAAGGTACTAATGGTACGGATAGATGGCTAGCTACAATACTTATAGAACCAAATGTGCCTGAGACGACTAGAAATTACACATTATTTGGGGAAACAGCGAGTATATCAGTAGCAAACCCATCACAAAGTAAATGGCGTTTTGTTGACGTAGCTAAGACCACTGCAAATGGAACATATTCACAATATGGACCATTACTATCAGATACAAAACTGTATGGAGTAATGAAATACAACGGGAAGTTGTATACGTATAATGGTGAAACTCCGAATGCTACAACAAATTATTATTCAACTACAAATTATGACTCAGTGAATATGACATCTTATTGCGATTTTTACATTATACCAAGAGCACAAGAATCAAAGTGCACAGAATACGTAAATAATGGATTACCACCAATACAAAACACCAGAAATGTCGTACCATTAGCTTTATCTTCACGATCAATAGTTGCTAGAAGAGCTGCAGTGAACGAAGACATAGTTATATCGAAAACGTCATTGTGGAAAGAAATGCAATATAATCGAGATATCATAATAAGATTTAAGTTTGCAAACTCAATTATTAAATCAGGTGGACTAGGGTATAAATGGTCAGAGATTTCATTCAAACCAGCAAACTATCAATATACATATATACGTGATGGAGAGGAAGTAACTGCACATACAACATGTTCAGTGAATGGAGTGAACGACTTCAACTATAACGGAGGATCATTACCAACTGACTTTGTAATATCACGTTATGAAGTTATAAAAGAGAACTCTTATGTATATATAGATTATTGGGATGATTCACAAGCATTCAGAAACATGGTATATGTGAGATCATTAGCTGCGGACTTAAATGAAGTGACATGTGCAGGGGGTACTTATAATTTCCAACTACCAGTTGGACAATGGCCTGTGATGAGTGGTGGCTCAGTATCATTGCGTTCAGCTGGAGTAACGTTATCAACTCAATTTACAGACTTTGTGTCATTAAATTCGTTAAGATTTAGGTTCAGTTTAGCAGTAGAAGAACCGCCATTCTCTATTTCAAGGACACGGATATCAGGGTTATATGGGTTACCGGCAGCCAATCCAAATAATGGAAGAGACTTCTATGAAATTGCGGGTAGATTTTCATTAATTTTATTAGTACCATCAAATGATGATTATCAAACTCCTATAATGAACTCAGTGACGGTGAGACAGGACTTAGAGAGGCAGTTAGGAGAATTGAGAGAAGAATTTAACGCATTATCACAAGAGATAGCTATGTCACAATTGATAGATCTAGCTTTACTACCATTGGACATGTTCTCAATGTTTTCAGGAATTAAAACAACGATAGATGCAGCTAAATCAATGGCCACTAATGTAATGAAGAAGTTTAAAAGCTCAGGCTTGGCCACGTCTGTATCCACGTTGACAGACTCATTATCTGACGCCGCATCAGCGGTATCAAGGAACAGCTCAATAAGATCAATTGGATCAACAGCATCAGCTTGGACAGACATTTCTTCACAAATAGTGGATACGCAAGCATCAGTCAATACGTTGGCAACTCAAACGTCAACTATCAGCAAGAGATTAAGGTTAAAAGAAATTGCGACTCAAACAGAGGGAATGAATTTCGACGACATATCAGCAGCTGTGTTAAAAACTAAAATTGACAAATCATCACAAATAGGACCAAGTACTTTACCAGATATTGTTACTGAAGCGTCGGAGAAGTTTATACCAAATAGAACGTATAGAGTAATTGACGATGATACTGTGTTTGAAGCAGGAACAGATGGGAGATTTTACGCATATAGAGTCGAGACGTTTGAGGAAGTTCCATTTGATGTGCAAAAATTCGCAGATTTAGTAACTGACTCTCCAGTAATCTCGGCCATTATAGACTTTAAAACGCTTAAAAACTTGAATGATAACTATGGAATTACTCGTTCGCAAGCATTAAATCTAATTAGATCAGATCCAAGGGTTCTGCGAGAATTTATCAATCAAGATAATCCAATAATAAGAAACAGGATAGAGCAGTTAATTCTGCAATGTAGATTGTAA序列42(SEQIDNO:42)：GGATCCCATATGATGGCTTCGCTCATTTAC序列43(SEQIDNO:43)：GGATCCCATATGTACAGACAATTACTTACGAATTC序列44(SEQIDNO:44)：GGATCCCATATGATACAGTTAATTGGATCAGAAAA序列45(SEQIDNO:45)：GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACGCAG序列46(SEQIDNO:46)：GGATCCCATATGTTGAATGGACCA序列47(SEQIDNO:47)：AAGCTTAGGTGTTTTGTATTGGTGG序列48(SEQIDNO:48)：AAGCTTATCTTCTAGCAACTATTGATCGT序列49(SEQIDNO:49)：AAGCTTAGTTCACTGCAGCTCTTCTAGC序列50(SEQIDNO:50)：AAGCTTACAATGACGTTTTCGATATAACTA序列51(SEQIDNO:51)：AAGCTTAGATATCTCGATTATATTGCATTTC序列52(SEQIDNO:52)：AAGCTTAAATTGAGTTTGCAAACTTAAAT序列53(SEQIDNO:53)：AAGCTTACCATTTATACCCTAGTCCACC序列54(SEQIDNO:54)：AAGCTTAATAGTTTGCTGGTTTGAATGA序列55(SEQIDNO:55)：AAGCTTATTCCTCTCCATCACGTATATATG序列56(SEQIDNO:56)：AAGCTTAATTCACTGAACATGTTGTATGTG序列57(SEQIDNO:57)：AAGCTTATCCTCCGTTATAGTTGAAGTC序列58(SEQIDNO:58)：AAGCTTAACGTGATATTACAAAGTCAGTTG序列59(SEQIDNO:59)：AAGCTTATACATAAGAGTTCTCTTTTATAACTTC序列60(SEQIDNO:60)：AAGCTTATGCTTGTGAATCATCCCAA序列61(SEQIDNO:61)：AAGCTTATAATGATCTCACATATACCATGTTT序列62(SEQIDNO:62)：AAGCTTATGCACATGTCACTTCATTTAAG序列63(SEQIDNO:63)：AAGCTTAAACTGGTAGTTGGAAATTATAAGTA序列64(SEQIDNO:64)：AAGCTTATGAGCCACCACTCATCACA序列65(SEQIDNO:65)：AAGCTTATAACGTTACTCCAGCTGAAC序列66(SEQIDNO:66)：AAGCTTATAATGACACAAAGTCTGTAAATTG序列67(SEQIDNO:67)：AAGCTTATGCTAAACTGAACCTAAATCTTA序列68(SEQIDNO:68)：AAGCTTACCTTGAAATAGAGAATGGCG序列69(SEQIDNO:69)：AAGCTTACGGTAACCCATATAACCCT序列70(SEQIDNO:70)：AAGCTTAGAAGTCTCTTCCATTATTTGGA序列71(SEQIDNO:71)：AAGCTTAAATTAATGAAAATCTACCCGC序列72(SEQIDNO:72)：AGATCTAAGCTTATGATGGTACTAATAAAATTAATGAAAATC序列73(SEQIDNO:73)：AGATCTAAGCTTAAGTTTGATAATCATCATTTGATGGTACTA序列74(SEQIDNO:74)：AGATCTAAGCTTATGAGTTCATTATAGGAGTTTGATAATCAT序列75(SEQIDNO:75)：AGATCTAAGCTTATGTCTCACCGTCACTGAGTTCA序列76(SEQIDNO:76)：AGATCTAAGCTTACTGCCTCTCTAAGTCCTGTCTCA序列77(SEQIDNO:77)：GGATCCCATATGGGATCGGAGAAAACTCAA序列78(SEQIDNO:78)：AAGCTTAATTAGTTGGAACTAAAGAAATAAGT序列79(SEQIDNO:79)GGATCCCATATGGGATCAGAGAAAAGTCAAAAT序列80(SEQIDNO:80)AAGCTTAATTAGACGGTACTAATGAAA序列81(SEQIDNO:81)：GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACTCAAAATG序列82(SEQIDNO:82)：AAGCTTAGTTGGTTGGAACTAAAGAAA序列83(SEQIDNO:83)：GGATCCCATATGGGAGCAGAGAAGACACA序列84(SEQIDNO:84)：AAGCTTAATCGTTGGACGGCAC序列85(SEQIDNO:85)：GGATCCCATATGGGATCAACTAAATCACAAAATG序列86(SEQIDNO:86)：AAGCTTATGATGGCACTAATGATATAAGT序列87(SEQIDNO:87)：MASLIYRQLLTNSYTVDLSDEIQEIGSTKSQNVTINPGPFAQTGYAPVNWGPGEINDSTTVEPLLDGPYQPMTFNPPVDYWMLLAPTTPGVIVEGTNNTDRWLATILIEPNVQSENRTYTIFGIQEQLTVSNTSQDQWKFIDVVKTTANGSIGQYGSLLSSPKLYAVMKHNEKLYTYEGQTPNARTGHYSTTNYDSVNMTAFCDFYIIPRSEESKCTEYINNGLPPIQNTRNVVPLSLTARDVIHYRAQANEDIVISKTSLWKEMQYNRDITIRFKFANTIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYTRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFSFNGGSLPTDFVVSKFEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNVMYVRSLAANLNSVMCTGGSYNFSLPVGQWPVLTGGAVSLHSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFRLAVEEPHFKLTRTRLDRLYGLPAADPNNGKEYYEIAGRFSLISLVPSNDDYQTPIANSVTVRQDLERQLGELREEFNALSQEIAMSQLIDLALLPLDMFSMFSGIKSTIDAAKSMATNVMKKFKKSGLANSVSTLTDSLSDAASSISRGSSIRSIGSSASAWTDVSTQITDISSSVSSVSTQTSTISRRLRLKEMATQTEGMNFDDISAAVLKTKIDKSTQISPNTIPDIVTEASEKFIPNRAYRVINNDDVFEAGIDGKFFAYKVDTFEEIPFDVQKFADLVTDSPVISAIIDFKTLKNLNDNYGITKQQAFNLLRSDPRVLREFINQDNPIIRNRIEQLIMQCRL序列88(SEQIDNO:88)：MASLIYRQLLTNSFTVDISDEIETIGAEKTQNVTVNPGPFAQTGYAPANWGPGETNDSTTVEPVLDGPYQPIAFSPPPEYYILLSPTAPGVIAECTNTVNRWIAIIAIEPNVSPTNRTYTLFGITEQLTVENSSVDKWKFIDFMKTPTTGSYVRYNILLSSTKLCAVAKHTDNLYSYVGETPTAGQAYYSSFNIFNLTAHCDFYIIPWSQQSLCTQYVNNGLPPIQNTRNVVPRHLSARSIITQRAQANEDIVVSKTSLWKEMQFNRDITIRFKFANAIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYTRDGEEVTAHTTCSVNGVNNFDFFGGSLPTDFGISRYEVIKENSFVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNTVECTGGAYSFSLPVGQWPVMTGGAVSLRAAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFRLSVEEPSFSITRTRVSGLYGLPAADPNNGREYYEIAGRFSLISLVPSNDNYQTPIMNSVTVRQDLERQLGELREEFNALSQEIALSQLVDLALLPLDMFSMFSGIKATLDVAKSMATNVMKKFKKSGLATSISAMTESLSDAASSVSRSGAIRSVSSTSSAWTDVSSRVANVENAASTVSTQTATISRRLRLKEITTQTEGMNFDDISAAVLKTKLDKSVRIAPNTLPDIVTEASEKFIPNRSYRVINNNEAFETGTDGRFFAYRVDTLEELPFDVQKFADLVAESPVISAIIDFKTLKNLNDNYGISKEQAFSLLRSDPRVLREFINQGNPIIRNRIEQLIMQCRL序列89(SEQIDNO:89)：MASLIYRQLLTNSYSVDLHDEIEQIGSEKTQNVTVNPGPFAQTRYAPVNWGHGEINDSTTVEPVLDGPYQPTTFKPPNDYWLLISSNTDGVVYESTNNSDFWTAVIAVEPHVSQTNRQYVLFGENKQFNIENSSDKWKFLEMFRGSGQSDFSNRRTLTSNNRLVGMLKYGGRVWTFHGETPRATTDSSNTADLNNISIIIHSEFYIIPRSQESKCNEYINNGLPPIQNTRNVVPLSLSSRSIQYRRAQVNEDITISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFGNSVIKLGGLGYKWSEISYKAANYQYSYSRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNGGSLPTDFSISRYEVIKENSYVYIDYWDDSKAFRNMVYVRSLAANLNSVKCVGGSYDFRLPVGEWPIMNGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVDEPSFSIIRTRTMNLYGLPAANPNNGNEYYEVSGRFSLISLVPTNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQLNDLREEFNSLSQEIAMSQLIDLALLPLDMFSMFSGIKSTIDLTKSMATSVMKKFRKSKLATSISEMTNSLSDAASSASRSASIRSNLSTISNWSDASKSVLNVTDSVNDVSTQTSTISKKLRLREMITQTEGISFDDISAAVLKTKIDMSTQIGKNTLPDIVTEASEKFIPKRSYRVLKDDEVMEVNTEGKFFAYKVDTLNEIPFDINKFAELVTDSPVISAIIDFKTLKNLNDNYGITRIEALNLIKSNPNVLRNFINQNNPIIRNRIEQLILQCKL序列90(SEQIDNO:90)：MASLIYRQLLTNSYTVELSDEINTIGSEKSQNVTINPGPFAQTNYAPVTWSHGEVNDSTTIEPVLDGPYQPTNFKPPNDYWILLNPTNQQVVLEGTNKTDIWVALLLVEPNVTNQSRQYTLFGETKQITVENNTNKWKFFEMFRSNVNAEFQHKRTLTSDTKLAGFMKFYNSVWTFHGETPHATTDYSSTSNLSEVETVIHVEFYIIPRSQESKCSEYINTGLPPMQNTRNIVPVALSSRSVTYQRAQVNEDIIISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFNNSIVKLGGLGYKWSEISFKAANYQYSYLRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNGGSLPTDFSVSRYEVIKENSYVYVDYWDDSQAFRNMVYVRSLAANLNSVKCSGGNYNFQIPVGAWPVMSGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVEEPPFSILRTRVSGLYGLPAFNPNNGHEYYEIAGRFSLISLVPSNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQLGDLREEFNSLSQEIAMTQLIDLALLPLDMFSMFSGIKSTIDVAKSMVTKVMKKFKKSGLATSISELTGSLSNAASSVSRSSSIRSNISSISVWTDVSEQIAGSSDSVRNISTQTSAISKRLRLREITTQTEGMNFDDISAAVLKTKIDRSTHISPDTLPDIITESSEKFIPKRAYRVLKDDEVMEADVDGKFFAYKVGTFEEVPFDVDKFVDLVTDSPVISAIIDFKTLKNLNDNYGITRSQALDLIRSDPRVLRDFINQNNPIIKNRIEQLILQCRL序列91(SEQIDNO:91)：MASLIYRQLLTNSYSVDLHDEIEQIGSEKTQNVTINPSPFAQTRYAPVNWGHGEINDSTTVEPMLDGPYQPTTFTPPNDYWILINSNTNGVVYESTNNSDFWTAVVAIEPHVNPVDRQYTIFGESKQFNVSNDSNKWKFLEMFRSSSQNEFYNRRTLTSDTRFVGILKYGGRVWTFHGETPRATTDSSSTANLNNISITIHSEFYIIPRSQESKCNEYINNGLPPIQNTRNVVPLPLSSRSIQYKRAQVNEDIIVSKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFGNSIVKMGGLGYKWSEISYKAANYQYNYLRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNGGFLPTDFGISRYEVIKENSYVYVDYWDDSKAFRNMVYVRSLAANLNSVKCTGGSYNFSIPVGAWPVMNGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVDEPPFSILRTRTVNLYGLPAANPNNGNEYYEISGRFSLIYLVPTNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQLTDLREEFNSLSQEIAMAQLIDLALLPLDMFSMFSGIKSTIDLTKSMATSVMKKFRKSKLATSISEMTNSLSDAASSASRNVSIRSNLSAISNWTNVSNDVSNVTNSLNDISTQTSTISKKFRLKEMITQTEGMSFDDISAAVLKTKIDMSTQIGKNTLPDIVTEASEKFIPKRSYRILKDDEVMEINTEGKFFAYKINTFDEVPFDVNKFAELVTDSPVISAIIDFKTLKNLNDNYGITRTEALNLIKSNPNMLRNFINQNNPIIRNRIEQLILQCKL具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。除非特別指明，否則本發(fā)明中所使用的分子生物學(xué)實驗方法和免疫檢測法，基本上參照J(rèn).Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕?版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精編分子生物學(xué)實驗指南，第3版，JohnWiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法進(jìn)行或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。在不背離本發(fā)明的精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。實施例中使用的生物材料和試劑的來源：輪狀病毒LLR株由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司饋贈；輪狀病毒SA11株購自中國獸醫(yī)保藏中心；輪狀病毒W(wǎng)a和DS-1株購自ATCC；輪狀病毒EDIM株為病原生物學(xué)研究所饋贈；原核表達(dá)載體PTO-T7為實驗室自主構(gòu)建；大腸桿菌(E.coli)ER2566和BL21(DE3)購自新英格蘭生物實驗室公司；所使用的引物均由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。實施例1：截短的VP8蛋白(VP8-5)的免疫原性和免疫保護(hù)性的研究按照中國專利申請CN201510165746.2中描述的方法表達(dá)并純化截短的輪狀病毒VP8蛋白VP8-5(其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)。簡言之，從輪狀病毒LLR株的培養(yǎng)物中提取輪狀病毒的基因組RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄獲得編碼VP4蛋白的cDNA。隨后，以獲得的cDNA為模板，通過PCR反應(yīng)，擴增獲得編碼VP8-5的基因片段。然后，使用獲得的基因片段構(gòu)建VP8-5表達(dá)質(zhì)粒，并將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。在37℃下培養(yǎng)含有VP8-5表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌至OD600＝0.6左右，然后將溫度降低至25℃，并加入終濃度為0.8mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)6h。培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心收集菌體，并進(jìn)行超聲破碎，收集可溶性級分。隨后，通過陰離子交換層析來收集可溶性級分中的VP8-5蛋白，其中所使用的儀器系統(tǒng)為GEHealthcare公司生產(chǎn)的AKTAexplorer100型制備型液相色譜系統(tǒng)；所使用的層析介質(zhì)為Q-sepharose-HP(GEHealthcare公司)；所使用的緩沖液為50mMTris-HClpH8.0和50mMTris-HClpH8.0，2MNaCl；洗脫程序為：1000mMNaCl洗脫雜蛋白，50mMNaCl洗脫目的蛋白，收集50mMNaCl洗脫產(chǎn)物。通過13.5％的SDS-PAGE來鑒定所獲得的洗脫產(chǎn)物，結(jié)果示于圖1中。圖1的結(jié)果顯示，所獲得的經(jīng)純化的VP8-5蛋白的純度達(dá)到90％以上。中國專利申請CN201510165746.2已利用小鼠模型證實，在使用弗氏佐劑的條件下，經(jīng)純化的VP8-5蛋白具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性(參見，該申請的實施例5-8和圖4-9)。為了進(jìn)一步考察VP8-5蛋白在使用鋁佐劑的條件下的免疫保護(hù)效果，通過小鼠模型來評價經(jīng)純化的VP8-5蛋白+鋁佐劑的免疫原性和免疫保護(hù)性。具體方案如下：將5-6周齡的雌性Balb/c小鼠隨機分為3組，每組7只小鼠，其中2組為對照組，1組為實驗組。將純化的VP8-5蛋白、等劑量的滅活病毒LLR株和PBS分別與磷酸鋁佐劑按照1:1的比例混合，然后通過肌肉注射的方式免疫小鼠，免疫劑量為10μg/只，其中，實驗組小鼠用VP8-5進(jìn)行免疫，陽性對照組小鼠用滅活病毒LLR進(jìn)行免疫，陰性對照組小鼠用PBS進(jìn)行免疫。各組小鼠分別進(jìn)行三次免疫，每次免疫間隔兩周。在免疫程序的第0、14、28和42天分別采集小鼠的眼球血，用于抗體滴度和中和抗體滴度的檢測?？贵w滴度的檢測將免疫血清梯度稀釋，然后分別與包被于平板上的VP8-5進(jìn)行間接ELISA分析(其中所使用的二抗為山羊抗小鼠抗體(萬域美瀾))，以測定與VP8-5具有反應(yīng)性的免疫血清的最大稀釋倍數(shù)。免疫血清的最大稀釋倍數(shù)越大，免疫血清中的抗VP8-5抗體的滴度就越高，用于產(chǎn)生免疫血清的蛋白的免疫原性也越高。間接ELISA的結(jié)果如圖1B所示，其中，縱坐標(biāo)表示與VP8-5具有反應(yīng)性的免疫血清的最大稀釋倍數(shù)(即，抗體滴度)。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天，VP8-5能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)抗體的產(chǎn)生，但是效率低于滅活病毒LLR。上述結(jié)果表明，在使用鋁佐劑的條件下，VP8-5蛋白具有免疫原性，能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)抗體的產(chǎn)生，但是其在動物體內(nèi)誘發(fā)抗體產(chǎn)生的能力低于滅活病毒LLR。中和抗體滴度的檢測將MA104細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(1.9*104個細(xì)胞/孔)。20小時后，通過ELISPOT檢測免疫血清的中和抗體滴度(Li,Lin,Yu,etal.JVirolMethods,2097-14,2014)。具體方案如下：將待測的免疫血清樣品(含待測中和抗體)分別用加入胰酶的DMEM進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋；然后取100μL各個經(jīng)稀釋的樣品分別與稀釋于DMEM中的輪狀病毒液混合(TCID50＝1.5*105)；在37℃下孵育1h后，將混合物分別加入預(yù)鋪有MA104細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在37℃培養(yǎng)14h；然后，如下計算各個免疫血清樣品對病毒的感染抑制率。感染抑制率＝(未加入血清的孔的病毒點計數(shù)-加入血清的孔的病毒點計數(shù))/未加入血清的孔的病毒點計數(shù)*100％。免疫血清中的中和抗體滴度定義為：達(dá)到50％感染抑制率的免疫血清最大稀釋倍數(shù)。經(jīng)50倍稀釋后仍能達(dá)到50％以上感染抑制率的免疫血清樣品被視為具有中和能力。免疫血清的中和抗體滴度的分析結(jié)果如圖1C所示，其中，縱坐標(biāo)表示達(dá)到50％感染抑制率的免疫血清最大稀釋倍數(shù)(NT50，中和抗體滴度)。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，VP8-5在免疫后第42天(三次免疫后)能夠在小鼠體內(nèi)誘發(fā)中和抗體，但是免疫血清的中和抗體滴度(NT50)低于滅活病毒LLR。免疫程序完成后，使用VP8-5蛋白誘發(fā)的免疫血清的中和抗體滴度(NT50)僅達(dá)到64左右。上述結(jié)果表明，在使用鋁佐劑的條件下，VP8-5能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，但是其所誘發(fā)的免疫血清的中和抗體滴度低于滅活病毒LLR。在動物中的保護(hù)性的分析在免疫程序完成后(免疫42天以后)，將各組小鼠按每兩只母鼠配一只公鼠的比例進(jìn)行交配。交配后20日左右，母鼠產(chǎn)下乳鼠，飼養(yǎng)7日。用LLR病毒株對7日齡乳鼠進(jìn)行灌胃攻毒，攻毒劑量為5＊106TCID50/只。攻毒后，每天觀察并記錄乳鼠的腹瀉情況，連續(xù)觀察7天，并根據(jù)糞便的形態(tài)進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)如圖2所示。根據(jù)乳鼠腹瀉的不同程度，評分分為3個等級：正常糞便計為1分(圖2C)，軟糞便計為2分(圖2B)，不成形水樣便計為3分(圖2A)。圖3顯示了攻毒后不同免疫組的乳鼠的腹瀉評分情況，其中，縱軸表示腹瀉評分；橫軸表示小鼠攻毒后天數(shù)。結(jié)果顯示，實驗組(VP8-5)乳鼠的腹瀉評分與陰性對照組(NC)無顯著差異。這說明，在使用鋁佐劑的條件下，VP8-5保護(hù)機體、抵抗輪狀病毒感染的能力較低(低于滅活病毒)，不能充分緩解輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉。實施例2：編碼截短的VP4蛋白的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建輪狀病毒LLR和SA11株用羅猴胚腎細(xì)胞系(MA-104)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基為DMEM，其補充有2μg/ml的胰酶，0.5mg/ml的氨芐青霉素和0.4mg/ml的鏈霉素，3.7mg/ml的碳酸氫鈉，0.34mg/ml的L-谷氨酰胺。根據(jù)制造商的說明書，采用北京金麥格生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的病毒DNA/RNA提取試劑盒，提取輪狀病毒的基因組RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄獲得編碼LLR株VP4蛋白的cDNA。以獲得的cDNA為模板，通過PCR反應(yīng)，擴增獲得編碼截短的輪狀病毒LLR株VP4蛋白的基因片段。所使用的PCR引物如下：上游引物：5'-GGATCCCATATGATGGCTTCGCTCATTTAC-3'(SEQIDNO:42)5'-GGATCCCATATGTACAGACAATTACTTACGAATTC-3'(SEQIDNO:43)5'-GGATCCCATATGATACAGTTAATTGGATCAGAAAA-3'(SEQIDNO:44)5'-GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACGCAG-3'(SEQIDNO:45)5'-GGATCCCATATGTTGAATGGACCA-3'(SEQIDNO:46)下游引物：5'-AAGCGGTGTTTTGTATTGGTGG-3'(SEQIDNO:47)5'-AAGCTCTTCTAGCAACTATTGATCGT-3'(SEQIDNO:48)5'-AAGCGTTCACTGCAGCTCTTCTAGC-3'(SEQIDNO:49)5'-AAGCCAATGACGTTTTCGATATAACTA-3'(SEQIDNO:50)5'-AAGCGATATCTCGATTATATTGCATTTC-3'(SEQIDNO:51)5'-AAGCAATTGAGTTTGCAAACTTAAAT-3'(SEQIDNO:52)5'-AAGCCCATTTATACCCTAGTCCACC-3'(SEQIDNO:53)5'-AAGCATAGTTTGCTGGTTTGAATGA-3'(SEQIDNO:54)5'-AAGCTTCCTCTCCATCACGTATATATG-3'(SEQIDNO:55)5'-AAGCATTCACTGAACATGTTGTATGTG-3'(SEQIDNO:56)5'-AAGCTCCTCCGTTATAGTTGAAGTC-3'(SEQIDNO:57)5'-AAGCACGTGATATTACAAAGTCAGTTG-3'(SEQIDNO:58)5'-AAGCTACATAAGAGTTCTCTTTTATAACTTC-3'(SEQIDNO:59)5'-AAGCTGCTTGTGAATCATCCCAA-3'(SEQIDNO:60)5'-AAGCTAATGATCTCACATATACCATGTTT-3'(SEQIDNO:61)5'-AAGCTGCACATGTCACTTCATTTAAG-3'(SEQIDNO:62)5'-AAGCAACTGGTAGTTGGAAATTATAAGTA-3'(SEQIDNO:63)5'-AAGCTGAGCCACCACTCATCACA-3'(SEQIDNO:64)5'-AAGCTAACGTTACTCCAGCTGAAC-3'(SEQIDNO:65)5'-AAGCTAATGACACAAAGTCTGTAAATTG-3'(SEQIDNO:66)5'-AAGCTGCTAAACTGAACCTAAATCTTA-3'(SEQIDNO:67)5'-AAGCCCTTGAAATAGAGAATGGCG-3'(SEQIDNO:68)5'-CGGTAACCCATATAACCCT(SEQIDNO:69)5'-AAGCGAAGTCTCTTCCATTATTTGGA-3'(SEQIDNO:70)5'-AAGCAATTAATGAAAATCTACCCGC-3'(SEQIDNO:71)5'-AGATCTAAGCTGATGGTACTAATAAAATTAATGAAAATC-3'(SEQIDNO:72)5'-AGATCTAAGCAGTTTGATAATCATCATTTGATGGTACTA-3'(SEQIDNO:73)5'-AGATCTAAGCTGAGTTCATTATAGGAGTTTGATAATCAT-3'(SEQIDNO:74)5'-AGATCTAAGCTGTCTCACCGTCACTGAGTTCA-3'(SEQIDNO:75)5'-AGATCTAAGCCTGCCTCTCTAAGTCCTGTCTCA-3'(SEQIDNO:76)其中，以下劃線標(biāo)示出酶切位點，以斜體標(biāo)示出引入的終止密碼子。利用上述引物，通過PCR擴增編碼截短的VP4蛋白的基因，所使用的PCR反應(yīng)體系如下：用于擴增編碼截短的VP4蛋白的基因的引物對如表2所示：表2：VP4截短蛋白編碼基因擴增引物PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，35個循環(huán)的(95℃，40s；55℃，80s；72℃，1min)，72℃終延伸10min。所獲得的擴增產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將各個PCR擴增產(chǎn)物連接入pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。然后，篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)NdeI/HindIII酶切鑒定，得到插入目的基因片段的陽性克隆質(zhì)粒。對獲得的各個陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，上述陽性克隆質(zhì)粒中插入的目的片段的核苷酸序列與預(yù)期的一致，其所編碼的氨基酸序列如SEQIDNO：2-34所示。將上述陽性克隆質(zhì)粒分別通過NdeI/HindIII進(jìn)行酶切，獲得各個截短的VP4蛋白的編碼基因片段，并將其與經(jīng)NdeI/HindIII酶切的非融合表達(dá)載體pTO-T7(羅文新等，生物工程學(xué)報，2000，16：53-57)相連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。然后，篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)NdeI/HindIII酶切鑒定得到插入目的基因片段的陽性表達(dá)質(zhì)粒。取1μL陽性表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化40μL感受態(tài)大腸桿菌Bl21(DE3)(購自NEB公司)。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含卡那霉素(終濃度25mg/mL，下同)的固體LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化鈉，下同)，并37℃靜置培養(yǎng)10-12小時至單菌落清晰可辨。挑取單菌落至含4mL液體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，然后在37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)10小時。培養(yǎng)后，取1mL菌液，加入終濃度為10％的甘油，于-70℃保存。實施例3：截短的VP4蛋白的表達(dá)從-70℃取出實施例2制備的攜帶陽性表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌菌液，將其接種入50ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在180rpm，37℃下培養(yǎng)大約4小時；然后轉(zhuǎn)接入10瓶500ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中(每瓶接入500ul菌液)。當(dāng)培養(yǎng)物在600nm波長條件下的吸光值達(dá)0.5時，加入IPTG至終濃度為1mM，在180rpm，25℃下繼續(xù)培養(yǎng)6小時。取1ml上述菌液，進(jìn)行離心，并收集菌體沉淀。向菌體沉淀中加入100μL去離子水，將菌體重懸。然后，加入20μL6*上樣緩沖液，混勻，并在沸水浴中溫育10min，以裂解細(xì)胞。取10μL樣品，通過12％的SDS-PAGE進(jìn)行分析。SDS-PAGE結(jié)果如圖4A-4D所示。結(jié)果顯示，除了26-311，26-331和26-381的表達(dá)量相對較低以外，其他的截短蛋白均可在大腸桿菌中高表達(dá)。實施例4：截短的VP4蛋白的純化和表征離心實施例3獲得的大腸桿菌菌液，收集菌體沉淀。按照15ml/g濕菌的比例，用50mMTB8.0將表達(dá)截短的VP4蛋白的菌體重懸。然后，通過超聲破碎大腸桿菌細(xì)胞，超聲破碎條件為：超聲2s，間隔4s，每克菌體超聲破碎時間為4min。超聲破碎后，以25000g進(jìn)行離心，收集上清(即，含有重組表達(dá)的截短VP4蛋白的大腸桿菌裂解液可溶性級分)。可通過兩步層析法來純化大腸桿菌裂解液可溶性級分中的截短VP4蛋白。對于26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461而言，在進(jìn)行兩步層析法之前，先用40％的硫酸銨處理大腸桿菌裂解液可溶性級分，然后離心并收集蛋白質(zhì)沉淀；隨后，將獲得的蛋白質(zhì)沉淀溶解于50mMTris-HClpH8.0中，并應(yīng)用于兩步層析法。兩步層析法的方案如下。首先，通過Q-HP陰離子交換層析進(jìn)行初步純化，獲得純度約60％的截短的VP4蛋白，其具體純化條件如下：儀器系統(tǒng)：GEHealthcare公司(原AmershanPharmacia公司)生產(chǎn)的AKTAexplorer100型制備型液相色譜系統(tǒng)。層析介質(zhì)：Q-sepharose-HP(GEHealthcare公司)。柱體積：5.5cm＊20cm。緩沖液：A泵：50mMTris-HClpH8.0；B泵：50mMTris-HClpH8.0，2MNaCl流速：6mL/min。檢測器波長：280nm。樣品為之前制備的含有重組表達(dá)的截短的VP4蛋白的上清(即，大腸桿菌裂解液可溶性級分或溶解于50mMTris-HClpH8.0中的蛋白質(zhì)樣品)。洗脫程序為：50mMNaCl洗脫目的蛋白，1MNaCl洗脫雜蛋白。收集用50mMNaCl洗脫的級份，共獲得30mL的含有重組表達(dá)的截短蛋白的經(jīng)初步純化的樣品(注意：在上述初步純化過程中，截短蛋白1-476，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461不與層析柱結(jié)合，包含在穿透級份(flow-through)中。因此，收集含有這些截短蛋白的穿透級份作為經(jīng)初步純化的樣品)。將上述經(jīng)陰離子交換層析初步純化的樣品分別透析至含有2MNaCl的TB8.0緩沖液中，然后使用Phenylsepharose-HP疏水親和層析進(jìn)行第二次純化。層析介質(zhì)：Phenylsepharose-HP(GEHealthcare公司)。柱體積：5.5cm＊20cm。緩沖液：A泵：50mMTris-HClpH8.0，2MNaCl；B泵：50mMTris-HClpH8.0流速：6mL/min。檢測器波長：280nm。樣品為經(jīng)Q-HP層析柱純化且透析至2MNaCl溶液中的產(chǎn)物洗脫程序為：1.5MNaCl洗脫雜蛋白，1MNaCl洗脫目的蛋白，50mMNaCl洗脫雜蛋白。收集用1MNaCl洗脫的級份，共獲得30mL經(jīng)純化的重組表達(dá)的截短的VP4蛋白(注意：在上述第二次純化過程中，截短蛋白1-476，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461和26-471用50mMTB8.0進(jìn)行洗脫，收集用50mMTB8.0洗脫的級份)。取經(jīng)上述方案純化的樣品150μL，加入30μL6XLoadingBuffer，混勻并于100℃水浴中溫育10min；然后取10μl于13.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中以120V電壓電泳120min；然后通過考馬斯亮蘭染色來顯示電泳條帶。電泳結(jié)果示于圖5中。圖5A-5B顯示了經(jīng)純化的各種截短VP4蛋白的SDS-PAGE結(jié)果。在圖5A中，泳道從左到右依次為：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(Marker)，1-476，6-476，22-476，26-476，65-476，26-231，26-271，26-331和26-351。在圖5B中，泳道從左到右依次為：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(Marker)，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492和26-497。圖5A和5B的結(jié)果顯示，經(jīng)過上述純化步驟后，截短蛋白1-476，6-476，22-476，26-476，65-476，26-231，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492和26-497的濃度均達(dá)到0.2mg/ml以上，且純度大于80％。另外，還使用HPLC對上述經(jīng)純化的樣品在不同緩沖條件下的均一性進(jìn)行了分析。所使用的儀器為安捷倫1200高效液相色譜儀，層析柱為G3000PWXL或G5000PWXL，柱體積為7.8*300mm，流速為0.5ml/min，檢測波長為280nm；其中，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461的均一性用G5000PWXL來進(jìn)行檢測；其他蛋白使用G3000PWXL來進(jìn)行檢測。SEC-HPLC的分析結(jié)果示于圖6和圖7中。結(jié)果顯示：在TB8.0的條件下，截短蛋白1-476，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441和26-461的保留時間均在11min左右，其分子量超過600kDa；這說明，這些截短蛋白主要以高聚體的形式存在。截短蛋白26-271的保留時間為約16min；這說明，該蛋白主要以單體形式存在。其余蛋白(6-476、22-476、26-476、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497)的保留時間均為約13-14min，與IgG(150kDa)的保留時間相當(dāng)；這說明，這些蛋白主要以三聚體的形式存在。另外，在TB8.0+1MNaCl的條件下，截短的VP4蛋白26-476，26-482，26-487，26-492和26-497的保留時間均為約15min，與VP8二聚體(40kDa)相當(dāng)；這說明，這些截短蛋白在TB8.0+1MNaCl條件下主要以單體形式存在。這進(jìn)而表明，在鹽存在的條件下，26-476，26-482，26-487，26-492，26-497的構(gòu)象受到鹽離子影響，導(dǎo)致三聚體發(fā)生解聚，形成單體。此外，圖6和圖7的結(jié)果還顯示，所獲得的截短VP4蛋白的主要吸收峰所占比例幾乎都在80％或甚至90％以上；這說明，這些截短蛋白具有良好的均一性，適合于工業(yè)化批量生產(chǎn)，且有利于準(zhǔn)確確定用藥劑量。圖6和圖7的實驗結(jié)果還概述于下面的表3中。表3實施例5：截短的VP4蛋白的體外組裝及表征通過下述方案來進(jìn)行截短蛋白26-476的體外組裝。在室溫條件下，將截短蛋白26-476由TB8.0緩沖液透析至表4指定的透析緩沖液中，6小時后更換透析緩沖液一次。透析結(jié)束后，以12000rpm/min離心蛋白溶液10分鐘，留取上清液。隨后，將上清液在表4指定的溫度下靜置30分鐘到24小時。靜置后，將上清液迅速冰浴，并以12000rpm/min離心10分鐘。收集第二次離心后的上清液(其含有體外組裝的26-476)，用于下一步分析。通過HPLC來分析所獲得的上清液中由截短蛋白26-476體外組裝所形成的高聚體的均一性。HPLC分析所用儀器為安捷倫公司生產(chǎn)的1200高效液相色譜儀或Waters公司生產(chǎn)的E2695高效液相色譜儀，層析柱為G5000PWXL，柱體積為7.8*300mm，流速為0.5ml/min，檢測波長為280nm。SEC-HPLC的分析結(jié)果示于表4和圖8A中。表4：截短蛋白的體外組裝的條件及結(jié)果圖8A顯示了在50mMTris-HCl(pH8.0)中37℃靜置12小時后的截短蛋白26-476的分子篩分析結(jié)果。結(jié)果顯示，截短蛋白26-476在50mMTris-HCl(pH8.0)中37℃靜置12小時后能夠形成均一的高聚體(保留時間為12.4分鐘)，并且高聚體的比例高達(dá)97.2％。從表4和圖8A的結(jié)果可以看出，在pH7.4-9.6的范圍內(nèi)，截短蛋白26-476在37℃-50℃的溫度下靜置后，能夠組裝形成均一的高聚體，并且高聚體的比例可超過90％。此外，表4的結(jié)果還顯示，鹽離子(例如NaCl)的存在可抑制截短蛋白26-476形成高聚體。鹽離子(例如NaCl)的濃度越高，所形成的高聚體的比例就越低。此外，還使用電鏡來觀察由截短蛋白26-476體外組裝所形成的高聚體，所使用的儀器為FEI公司生產(chǎn)的G2Spirit電鏡。簡言之，將樣品固定于噴炭的銅網(wǎng)上，并用2％的磷鎢酸(pH7.4)負(fù)染30分鐘，隨后使用電鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果示于圖8B，其中可見大量不對稱結(jié)構(gòu)的顆粒，半徑為約10nm。這些結(jié)果表明，截短蛋白26-476能夠在體外組裝成均一的高聚體。實施例6：截短的VP4蛋白的酶切驗證將實施例4中獲得的經(jīng)純化的截短的VP4蛋白在37℃下用胰蛋白酶酶切1小時。取酶切后的組分100ul，加入20μL6XLoadingBuffer，混勻并于100℃水浴中溫育10min。隨后取10μl于13.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中以120V電壓電泳120min；然后通過考馬斯亮蘭染色來顯示電泳條帶。電泳結(jié)果示于圖9。圖9顯示了經(jīng)酶切和未經(jīng)酶切的截短蛋白26-476，26-482，26-487，26-492，26-497的SDS-PAGE結(jié)果。泳道上的數(shù)字1表示，樣品未經(jīng)胰酶處理；數(shù)字2表示，樣品經(jīng)0.1mg/ml胰酶處理。最右側(cè)的泳道所使用的樣品為VP8-5，用作對照。圖9的結(jié)果顯示，上述截短蛋白均能被胰酶識別并發(fā)生酶切，其酶切位點是暴露的。實施例7：截短的VP4蛋白的抗原性分析將實施例4中獲得的經(jīng)純化的截短VP4蛋白包被于平板上，獲得經(jīng)包被的平板。將中和抗體A3、B1、B5、B6、D6、E2、E5、8F6(本實驗室通過雜交瘤技術(shù)自制，濃度均為1mg/ml)梯度稀釋，然后按照實施例1中描述的間接ELISA方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果示于圖10中，其中橫坐標(biāo)表示各截短蛋白，縱坐標(biāo)表示與各截短蛋白發(fā)生反應(yīng)(OD450/620高于0.2)的最低抗體濃度。結(jié)果顯示，各截短的VP4蛋白均具有良好的抗原性(即，抗體反應(yīng)性)。實施例8：截短的VP4蛋白的免疫原性的分析將實施例4中獲得的經(jīng)純化的截短蛋白26-476包被于平板上，獲得經(jīng)包被的平板。按照實施例1中描述的方案，在使用鋁佐劑的條件下，用各待測樣品(實施例4中獲得的各種截短VP4蛋白、26-476的三聚體、實施例5中獲得的26-476的高聚體、滅活病毒(RV，用作陽性對照)和PBS(NC，陰性對照))來分別免疫Balb/c小鼠，并收集小鼠血清。隨后，按照實施例1中描述的方案，使用包被了26-476的平板通過間接ELISA來檢測小鼠血清中的抗體滴度。間接ELISA的結(jié)果如圖11A-11D所示，其中，橫坐標(biāo)表示用于制備免疫血清的蛋白樣品，縱坐標(biāo)表示與26-476具有反應(yīng)性的免疫血清的最大稀釋倍數(shù)(即，抗體滴度)；并且，圖11A、11B、11C和11D顯示了來自不同免疫批次的結(jié)果。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天，各蛋白樣品均能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)抗體(免疫血清中的抗體滴度(GMT)均可達(dá)到102-105或更高)；并且，除了26-271外，其他蛋白樣品所誘發(fā)的抗體滴度均高于RV誘發(fā)的抗體滴度(1-476、6-476、22-476、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461、26-471、26-476、26-487、26-492、26-476的三聚體和26-476的高聚體)，或至少與RV誘發(fā)的抗體滴度相當(dāng)(65-476、26-482和26-497)。結(jié)合實施例1的實驗結(jié)果可知，在使用鋁佐劑的條件下，各蛋白樣品(除了26-271外)均具有良好的免疫原性，能夠刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的抗體；其免疫原性顯著強于VP8-5，免疫血清中的抗體滴度顯著高于來自用VP8-5免疫的小鼠的血清。此外，圖11D的實驗結(jié)果還表明，截短蛋白26-476的高聚體的免疫原性顯著高于26-476的三聚體(p＝0.005)。實施例9：截短的VP4蛋白的免疫中和活性的分析使用實施例1中描述的方案，用各待測樣品(實施例4中獲得的各種截短VP4蛋白、26-476的三聚體、實施例5中獲得的26-476的高聚體、滅活病毒(RV，用作陽性對照)和PBS(NC，陰性對照))來免疫實驗組Balb/c小鼠(每組7只小鼠)，并收集免疫血清。隨后，按照實施例1中描述的檢測方法，評價所收集的各個免疫血清樣品中的中和抗體滴度。免疫血清的中和抗體滴度的分析結(jié)果如圖12A-12D所示，其中，橫坐標(biāo)表示用于制備免疫血清的蛋白樣品，縱坐標(biāo)表示達(dá)到50％感染抑制率的免疫血清最大稀釋倍數(shù)(NT50，中和抗體滴度)。圖12A、12B、12C和12D顯示了來自不同免疫批次的結(jié)果。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天(三次免疫后)，各蛋白樣品均能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)中和抗體，中和抗體滴度(NT50)均可達(dá)到28-214或更高的水平；并且，除了26-271外，其他蛋白樣品所誘發(fā)的中和抗體滴度均與RV誘發(fā)的中和抗體滴度相當(dāng)(6-476、22-476、26-476、65-476、26-471、26-482、26-487、26-492、26-497和26-476的三聚體)，或甚至高于RV誘發(fā)的中和抗體滴度(1-476、26-331、26-351、26-381、26-411、26-441、26-461和26-476的高聚體)。結(jié)合實施例1的實驗結(jié)果可知，在使用鋁佐劑的條件下，各蛋白樣品(除了26-271外)均具有強的誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的能力，能夠在動物體內(nèi)誘發(fā)具有高中和抗體滴度的免疫血清，所述免疫血清能夠有效抑制輪狀病毒的感染。各蛋白樣品(除了26-271外)誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的能力均顯著優(yōu)于VP8-5，從而具有更強的抵抗/預(yù)防RV感染的能力。此外，圖12D的實驗結(jié)果還表明，截短蛋白26-476的高聚體誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的能力顯著高于26-476的三聚體(p<0.001)，具有顯著更強的抵抗/預(yù)防RV感染的能力。實施例10：截短的VP4蛋白在動物中的保護(hù)性的評價使用實施例1中所述的方案，用各待測樣品(實施例4中獲得的截短VP4蛋白、26-476的三聚體、實施例5中獲得的26-476的高聚體、滅活病毒(RV，用作陽性對照)和PBS(NC，陰性對照))免疫Balb/c小鼠(每組7只小鼠)，并收集血清。按照實施例1中所述的方案來評價各蛋白樣品在動物中的保護(hù)性。除1-476和6-476免疫組(這兩組的動物未交配成功)之外，其余免疫組的實驗結(jié)果如圖13-14所示。圖13A-13D顯示了攻毒后1-7天來自不同免疫組(用22-476，26-476，65-476，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492，26-497，26-476的三聚體，26-476的高聚體，滅活的輪狀病毒(RV，陽性對照)或PBS(NC，陰性對照)進(jìn)行免疫)的乳鼠的腹瀉評分情況，其中，縱軸表示平均腹瀉評分；橫軸表示小鼠攻毒后天數(shù)；RV：滅活的輪狀病毒；NC：陰性對照(PBS)；三聚體：26-476的三聚體；高聚體：26-476的高聚體。圖14A-14D顯示了不同免疫組(用22-476，26-476，65-476，26-271，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-471，26-482，26-487，26-492，26-497，26-476的三聚體，26-476的高聚體，滅活的輪狀病毒(RV，陽性對照)或PBS(NC，陰性對照)進(jìn)行免疫)的乳鼠在攻毒后的平均腹瀉持續(xù)時間和攻毒后48小時的平均腹瀉評分，其中，平均腹瀉天數(shù)以柱形圖表示，平均腹瀉評分以曲線圖表示，左縱軸表示平均腹瀉天數(shù)；右縱軸表示腹瀉評分；橫軸表示各蛋白樣品所對應(yīng)的免疫組。結(jié)果顯示，在平均腹瀉評分和平均腹瀉天數(shù)方面，各蛋白樣品所對應(yīng)的免疫組均顯著優(yōu)于NC組。這表明，各蛋白樣品均具有顯著的保護(hù)性，能夠幫助小鼠抵抗輪狀病毒感染和由輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉。此外，結(jié)果還顯示，26-331，26-351，26-381，26-411，26-441，26-461，26-476，26-476的三聚體，以及26-476的高聚體的保護(hù)性與RV相當(dāng)，或甚至優(yōu)于RV。結(jié)合實施例1的實驗結(jié)果可知，在使用鋁佐劑的條件下，這些蛋白樣品在動物中的保護(hù)性均顯著優(yōu)于VP8-5。此外，圖13D和圖14D的實驗結(jié)果還表明，截短蛋白26-476的高聚體在動物中的保護(hù)能力顯著高于26-476的三聚體，可用于制備具有更高效力的疫苗。實施例11：來源于不同病毒株的截短VP4蛋白的表達(dá)、純化以及其免疫保護(hù)性的評價根據(jù)Genebank中提供的EDIM毒株的VP4基因序列(登錄號：AF039219.2)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成編碼來源于輪狀病毒EDIM株的26-476的基因片段。另外，根據(jù)Genebank中提供的輪狀病毒P[6]的VP4基因序列(登錄號：FJ183356.1)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成編碼來源于輪狀病毒P[6]的26-476的基因片段。隨后，以合成的基因片段為模板，通過PCR反應(yīng)，擴增獲得編碼來源于輪狀病毒P[6]和EDIM的截短蛋白26-476的基因片段。另外，如實施例2中所述，用羅猴胚胎腎細(xì)胞系(MA-104)細(xì)胞培養(yǎng)輪狀病毒SA11株，獲得輪狀病毒SA11的病毒培養(yǎng)物。輪狀病毒P[4]和P[8]來源于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收集的腹瀉標(biāo)本，標(biāo)本編號為20131281(P[4])和編號20131028(P[8])。根據(jù)制造商的說明書，采用北京金麥格生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的病毒DNA/RNA提取試劑盒，從病毒培養(yǎng)物或病毒標(biāo)本中提取輪狀病毒SA11、P[4]、P[8]的基因組RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄獲得編碼來源于各個毒株的VP4蛋白的cDNA。以獲得的cDNA為模板，通過PCR反應(yīng)，擴增獲得編碼來源于毒株SA11、P[4]、P[8]的截短蛋白26-476的基因片段。按照實施例2中描述的方法構(gòu)建克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒，所使用的PCR引物如下：上游引物：5'-GGATCCCATATGGGATCGGAGAAAACTCAA-3'(SEQIDNO：77)5'-GGATCCCATATGGGATCAGAGAAAAGTCAAAAT-3'(SEQIDNO:79)5'-GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACTCAAAATG-3'(SEQIDNO：81)5'-GGATCCCATATGGGAGCAGAGAAGACACA-3'(SEQIDNO：83)5'-GGATCCCATATGGGATCAACTAAATCACAAAATG-3'(SEQIDNO：85)下游引物：5'-AAGCATTAGTTGGAACTAAAGAAATAAGT-3'(SEQIDNO:78)5'-AAGCATTAGACGGTACTAATGAAA-3'(SEQIDNO:80)5'-AAGCGTTGGTTGGAACTAAAGAAA-3'(SEQIDNO:82)5'-AAGCATCGTTGGACGGCAC-3'(SEQIDNO:84)5'-AAGCTGATGGCACTAATGATATAAGT-3'(SEQIDNO:86)其中，以下劃線標(biāo)示出酶切位點，以斜體標(biāo)示出引入的終止密碼子。用于擴增各基因片段的引物對如表5所示：表5：用于擴增來源于不同毒株的26-476的編碼基因的引物對截短蛋白26-476-P[4]、26-476-P[6]、26-476-P[8]、26-476-EDIM、26-476-SA11的氨基酸序列分別如SEQIDNO:35-39所示。按照實施例3-4中描述的方法，在大腸桿菌中表達(dá)來源于不同病毒株的截短蛋白26-476(即，26-476-P[4]、26-476-P[6]、26-476-P[8]、26-476-EDIM、26-476-SA11)，并通過兩步層析法進(jìn)行純化；然后通過SDS-PAGE鑒定所純化的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果如圖15所示，其中，泳道從左到右依次為：來源于輪狀病毒LLR的截短蛋白26-476；來源于輪狀病毒SA11的截短蛋白26-476-SA11；來源于輪狀病毒EDIM的26-476-EDIM；來源于輪狀病毒P[8]的截短蛋白26-476-P[8]；來源于輪狀病毒P[6]的截短蛋白26-476-P[6]；來源于輪狀病毒P[4]的截短蛋白26-476-P[4]；和，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(Marker)。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法適用于不同的病毒株。來源于不同病毒株的截短VP4蛋白(26-476)均可在大腸桿菌中有效表達(dá)，且經(jīng)色譜法純化后，其純度均可達(dá)到80％以上。另外，還按照實施例4描述的方法，使用HPLC對上述經(jīng)純化的截短蛋白26-476在50mMTB8.0條件下的均一性進(jìn)行了分析。SEC-HPLC的分析結(jié)果示于圖16中。結(jié)果顯示：在TB8.0的條件下，來源于不同毒株的截短VP4蛋白26-476的保留時間均在13-14min左右，與IgG(150kDa)的保留時間相當(dāng)；這說明這些蛋白主要以三聚體的形式存在。此外，圖16的結(jié)果還顯示，所獲得的截短蛋白26-476的主要吸收峰所占比例幾乎都在80％以上；這說明這些截短蛋白均具有較高的均一性，適合于工業(yè)化批量生產(chǎn)，且有利于準(zhǔn)確確定用藥劑量。進(jìn)一步，將來源于不同輪狀病毒毒株的截短蛋白26-476分別包被于平板上，獲得經(jīng)包被的平板。按照實施例1中描述的方案，使用如上獲得的經(jīng)純化的截短蛋白26-476(即，26-476-P[4]、26-476-P[6]、26-476-P[8]、26-476-EDIM、26-476-SA11，來源于LLR的26-476和PBS(陰性對照))來免疫Balb/c小鼠，并收集小鼠血清。隨后，按照實施例1中描述的方案，使用經(jīng)包被的平板通過間接ELISA來檢測小鼠血清中的抗體滴度。間接ELISA的結(jié)果如圖17所示，其中，橫坐標(biāo)表示用于制備免疫血清的截短蛋白所源自的病毒株，縱坐標(biāo)表示與相應(yīng)截短蛋白具有反應(yīng)性的免疫血清的最大稀釋倍數(shù)(即，抗體滴度)；P[4]：26-476-P[4]；P[6]：26-476-P[6]；P[8]：26-476-P[8]；SA11：26-476-SA11；EDIM：26-476-EDIM；LLR：實施例4中制備的26-476。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天，來源于不同病毒株的26-476蛋白均能在小鼠體內(nèi)有效誘發(fā)抗體的產(chǎn)生，且所誘發(fā)的免疫血清中的抗體滴度(GMT)基本上相當(dāng)(抗體滴度均可達(dá)到104-105或更高，顯著高于陰性對照組)。這些結(jié)果表明，在使用鋁佐劑的條件下，來源于不同病毒株的26-476蛋白均具有良好的免疫原性，能夠在動物體內(nèi)有效誘發(fā)抗體的產(chǎn)生；并且，來源于不同病毒株的26-476蛋白的免疫原性基本上相當(dāng)，且均顯著強于VP8-5。進(jìn)一步地，使用實施例1中描述的方案，用來源于不同病毒株的26-476蛋白(26-476-SA11；26-476-EDIM；來源于LLR的26-476)免疫實驗組Balb/c小鼠(每組7只小鼠)，并收集免疫血清。隨后，按照實施例1中描述的檢測方法，評價所收集的各個免疫血清樣品中的中和抗體滴度。免疫血清的中和抗體滴度的分析結(jié)果如圖18所示，其中，橫坐標(biāo)表示用于制備免疫血清的蛋白樣品所源自的病毒株；縱坐標(biāo)表示達(dá)到50％感染抑制率的免疫血清最大稀釋倍數(shù)(NT50，中和抗體滴度)；SA11：26-476-SA11；EDIM：26-476-EDIM；LLR：實施例4中制備的26-476。結(jié)果顯示，在使用鋁佐劑的條件下，在免疫后第42天(三次免疫后)，SA11、EDIM和LLR毒株的26-476蛋白均能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)高滴度的中和抗體，中和抗體滴度(NT50)均可達(dá)到210-214或更高的水平；并且，26-476-SA11和26-476-EDIM所誘發(fā)的中和抗體滴度甚至高于來源于LLR的26-476。由此可見，來源于SA11毒株和EDIM毒株的26-476蛋白的免疫中和活性甚至優(yōu)于來源于LLR的26-476蛋白。此外，通過類似的方法還可證實，來源于輪狀病毒P[4]、P[6]和P[8]的26-476蛋白具有良好的免疫中和活性，能夠在小鼠體內(nèi)誘發(fā)高滴度的中和抗體。這些結(jié)果表明，在使用鋁佐劑的條件下，來源于不同病毒株的26-476蛋白均具有強的誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的能力，能夠在動物體內(nèi)誘發(fā)具有高中和抗體滴度的免疫血清。進(jìn)一步地，使用實施例1中所述的方案，用來源于不同病毒株的26-476蛋白(26-476-SA11，26-476-EDIM和PBS(NC，陰性對照))免疫Balb/c小鼠(每組7只小鼠)，并收集血清。隨后，按照實施例1中所述的方案來評價各蛋白樣品在動物中的保護(hù)性。實驗結(jié)果如圖19A-19B所示。圖19A顯示了不同免疫組(用26-476-SA11或PBS(NC，陰性對照)進(jìn)行免疫)的乳鼠用SA11病毒攻毒后1-7天的腹瀉評分；圖19B顯示了不同免疫組(用26-476-EDIM或PBS(NC，陰性對照)進(jìn)行免疫)的乳鼠用EDIM病毒攻毒后1-12天的腹瀉評分；其中，橫坐標(biāo)表示攻毒后天數(shù)，縱坐標(biāo)表示平均腹瀉評分。結(jié)果顯示，與來源于LLR的26-476類似，來源于SA11和EDIM的26-476蛋白均具有顯著的保護(hù)性，能夠幫助小鼠抵抗輪狀病毒感染和由輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉。此外，還按照實施例1中描述的方案，用26-476-EDIM或PBS(NC，陰性對照)來對成年小鼠進(jìn)行免疫(共免疫三次)。免疫程序完成后，用500μL的EDIM病毒(2*107copies/ml)來攻擊這些小鼠，并在攻毒后1-7天，每天收集小鼠的糞便標(biāo)本，并用PBS重懸為1％的糞便懸液。隨后，通過熒光定量PCR法對各個糞便懸液樣本中的病毒進(jìn)行定量檢測。實驗結(jié)果如圖19C所示。圖19C顯示了在攻毒后1-7天，來自經(jīng)26-476-EDIM或PBS免疫的小鼠的糞便懸液樣本中的病毒量，其中，橫坐標(biāo)表示攻毒后天數(shù)，縱坐標(biāo)表示每ml糞便懸液樣品中所含的EDIM基因組的拷貝數(shù)。由于熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測下限為104copies/ml，因此，將陰性檢測結(jié)果定義為103copies/ml。結(jié)果顯示，在攻毒后，在用PBS免疫的小鼠的糞便中檢測到明顯的排毒，而在用26-476-EDIM免疫的小鼠的糞便中，則未檢測到排毒。圖19A-19C的結(jié)果表明，26-476-EDIM不僅能夠使小鼠抵抗輪狀病毒感染以及由輪狀病毒感染導(dǎo)致的腹瀉，而且能夠抑制病毒在小鼠糞便中的排放(即，排毒)。盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解：根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和變動，并且這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3