本發(fā)明涉及疾病體外診斷領域，具體涉及一種同時檢測8種腦炎病毒的RT-PCR引物和探針組合及試劑盒。
背景技術：
：病毒感染引起的神經系統(tǒng)損傷已經逐漸成為臨床上最常見的中樞神經系統(tǒng)感染性疾病，烈性腦炎病毒類、腸道病毒等多重病毒感染均可以引發(fā)不同程度神經系統(tǒng)癥狀。80％以上的中樞神經系統(tǒng)病毒感染是由腸道病毒(enteroviruses)引起的，包括柯薩奇病毒(Coxsackievirus)、?？刹《?ECHOvirus)及脊髓灰質炎病毒(polio-virus)等。近幾年，一些新發(fā)現(xiàn)的腦炎病毒，尤其是一系列蟲媒性病毒和人畜共患性腦炎病毒以其癥狀復雜，診斷困難，死亡率高逐漸引起了人們的嚴重關注。目前的研究表明腦炎病毒感染的臨床癥狀包括發(fā)熱、頭疼，咳嗽、咽痛、軀體疼痛、頭痛、畏寒和疲勞等。有時還會出現(xiàn)腹瀉和嘔吐，病情可迅速進展，突然高熱、肺炎，重者可能出現(xiàn)意識模糊，抽搐，頸項強直，呼吸衰竭、多器官損傷，導致死亡。目前尚無特效的治療藥物以及相應疫苗。因此對于病毒性腦炎的早期快速診斷，對疾病的治療、控制以及預防都具有重要的現(xiàn)實意義。蟲媒病毒性腦炎是由嗜神經性蟲媒病毒引起中樞神經系統(tǒng)疾病。嗜神經性蟲媒病毒是一組以吸血昆蟲為傳播媒介的病毒，其中多種病毒可以造成急性腦炎，病死率高，造成嚴重的公共衛(wèi)生問題。嗜神經性蟲媒病毒主要包括：黃病毒屬(flavivirus)的日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)、森林腦炎病毒(tick-borneencephalitisvirus，TBE)、西尼羅病毒(WestNilevirus，WN)；甲病毒屬(alphavirus)的東方馬腦炎病毒(easternequineencephalomyelitisvirus，EEEV)、西方馬腦炎病毒(westernequineencephalomyelitisvirus，WEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelanequineencephalomyelitisvirus，VEEV)和布尼亞病毒科(Bunyaviridae)加利福尼亞腦炎病毒組(Californiaencephalitisvirusgroup，CEV)等，其引起的人類腦炎癥狀十分危急而兇險，臨床表現(xiàn)與乙型腦炎很相似，病死率約在35％以上。是目前國際社會列為防生物恐怖的主要種類之一，在國內屬一類管理的病毒種類，備受關注。以尼帕病毒(NipahVirus,NiV)和亨德拉病毒(HendraVirus，HeV)為代表的此類數(shù)種人畜共患性腦炎病毒，因為感染宿主多，病程猛烈迅速，致死率奇高，同樣引發(fā)嚴重的關注。病毒性腦炎癥狀復雜，發(fā)病急驟，致死率高，常見混合感染的病例，尤其是與其他疾病及其他病毒引發(fā)的腦炎在早期癥狀上難以區(qū)別，因此在感染早期，快速、準確的進行鑒別和診斷，是蟲媒病毒腦炎防控的重點。臨床上腦炎病毒的檢測和診斷，主要依靠流行病學資料，臨床表現(xiàn)、腦脊液實驗室檢查和病毒學分析。由于其癥狀與化膿性腦膜炎、結核性腦膜炎、真菌性腦膜炎以及腸道病毒引發(fā)的腦炎非常類似，因此常規(guī)的病毒學檢測，血清學檢測等，由于耗時長，疾病早期靈敏性不足，以及對操作的器械，環(huán)境，操作人員技術能力的要求較高，很難在疾病發(fā)生的早期進行大規(guī)模的篩查診斷以及提供準確及時的信息，影響行政及醫(yī)療部門對疾病流行的控制。目前，對于病毒性腦炎來說，核酸診斷是最靈敏快捷的檢測方法。目前應用于腦炎病毒的檢測方法有RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和生物芯片等?；赑CR反應的核酸診斷方法是目前最常用的實驗方法。但是PCR檢測不同的病原需要根據(jù)不同的特異性引物采用不同的反應體系和反應條件。因此如果要同時進行多種病原體的篩選則工作量巨大，耗時長久。高通量大樣本的快速篩選成為了臨床病原監(jiān)測和診斷的趨勢。多重PCR也是一種能夠通過在同一PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，同時進行多種基因檢測的技術。但是由于多重PCR技術存在多重引物相互影響，可能降低檢測的靈敏性和特異性。在應對多重病原感染時，容易出現(xiàn)結果混淆，而且檢測往往需要與電泳，測序，雜交等技術相聯(lián)系才能獲得較可信的結果，可能耗時更長，數(shù)據(jù)分析也比較復雜，目前市場上大多數(shù)的多重PCR檢測，往往局限在某一種病毒或者遺傳病的分型，而很少通用應用于新發(fā)突發(fā)傳染病的診斷，以及大規(guī)模的病原體篩查。生物芯片是目前最常使用的高通量的核酸檢測方法。其通過微電子技術將特異性的核酸和蛋白標記在硅片、玻片或者硝酸纖維膜上，通過分子雜交的方法來進行病原學檢測，具有靈敏性高，通量大的優(yōu)點。但是，生物芯片應用于現(xiàn)場和臨床還有許多的實際問題，例如研究成本高，標記技術復雜，一般實驗室難以承擔。方法標準化存在限制，各個實驗室的設備以及對樣本處理的方法不同，導致結果差異巨大，很難形成數(shù)據(jù)的可比性。假陽性和假陰性結果往往影響結果的判定，生物芯片的特異性有待提高。因此，一種具有廣泛適用性的，通量高，特異性，靈敏性強，可以用于大規(guī)模病原體篩查的檢測方法，幫助疾病控制人員了解疾病發(fā)生的情況，及早確定感染病原。對于蟲媒病毒的診斷，具有重要的現(xiàn)實意義。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供了一種同時檢測8種蟲媒腦炎病毒的RT-PCR引物和探針組合。本發(fā)明的另一個目的是提供一種同時檢測8種蟲媒腦炎病毒的RT-PCR陣列試劑盒。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的：一種同時檢測8種蟲媒腦炎病毒的RT-PCR引物和探針組合，所述引物和探針序列如SEQIDNO：1～24所示，所述8種蟲媒腦炎病毒為東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒、森林腦炎病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒。一種同時檢測8種蟲媒腦炎病毒的RT-PCR陣列試劑盒，所述試劑盒含有如上SEQIDNO：1～24所述的引物和探針組合，試劑盒還包含陽性質控品、陰性質控品和熒光定量檢測試劑。優(yōu)選地，所述引物和探針的濃度均為5～15pmol/μl。更優(yōu)選地，所述引物的濃度為10pmol/μl，所述探針的濃度為5pmol/μl。優(yōu)選地，所述陰性質控品為生理鹽水，所述陽性質控品為含有東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒、森林腦炎病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒等8種蟲媒腦炎病毒檢測靶標序列的重組假病毒。更優(yōu)選地，將需要檢測的8種蟲媒腦炎病毒的靶標序列按EEEV、WEEV、VEEV、TBEV、JEV、WNV、NiV、HeV排列順序全部組合在一條基因鏈上，將該基因鏈整合到假病毒中，得到陽性質控品。更優(yōu)選地，所述陽性質控品的濃度為1×106拷貝數(shù)/ml。制備陽性質控品中使用的假病毒是通過市售的逆轉錄病毒包裝系統(tǒng)構建而成。相對于利用質粒DNA作為陽性模版的標準品來說，由逆轉錄病毒構建的陽性指控品完全模擬了實際情況，為衣殼和包膜包裹的RNA片段，可以為實驗的全過程，包括病毒核酸的提取，RNA至DNA的逆轉錄，以及最后的核酸擴增進行陽性參照。優(yōu)選地，所述試劑盒由以下成分組成：一步法RT-PCR反應緩沖液，一步法RT-PCR反應酶混合液，SEQIDNO：1～24所述的引物和探針組合，96孔檢測板，DEPC水，陽性質控品，陰性質控品。優(yōu)選地，所述試劑盒的反應體系為：一步法RT-PCR反應緩沖液2.5μl，10pmol/μl的上游引物和下游引物各0.1μl，5pmol/μl的探針0.1μl，DEPC水14.2μl，一步法RT-PCR反應酶混合液3μl，模板5μl，共25μl；其中一步法RT-PCR反應酶混合液組成為：10U/μl的熱啟動Taq酶0.5μl，50U/μl逆轉錄酶0.5μl，25mM的dNTPs0.4μl，40U/μl的RNA酶抑制劑0.5μl，一步法酶稀釋液1.1μl。更優(yōu)選地，所述試劑盒反應體系中一步法RT-PCR反應緩沖液的鎂離子濃度為2.0mmol/L。最優(yōu)選地，所述一步法RT-PCR反應緩沖液包含10mmol/LTris-HCl(pH8.0)、150mmol/LKCl、2.0mmol/LMgCl2。優(yōu)選地，所述試劑盒的反應條件為:50℃逆轉錄15min，1個循環(huán)；94℃15min，1個循環(huán)；最后95℃15s，55～60℃45s，45個循環(huán)。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明通過設計獲得8種致病性腦炎病毒熒光實時定量PCR檢測引物和探針組合，所述引物和探針的序列如SEQIDNO：1～24所示。結合實時定量PCR技術靈敏可靠的優(yōu)勢以及微列陣技術同時檢測多種基因表達量的優(yōu)勢，經過優(yōu)化的實時定量PCR體系，在相同的PCR反應條件下保證陣列內不同反應管內的基因有相近的擴增效率，并且獲得與單個基因實時定量PCR反應相當?shù)撵`敏度，特異性和可重復性?；赥aqman的實時定量PCR陣列方法，極大的提升了檢測的靈敏性，穩(wěn)定性以及檢測的線性范圍，尤其是封閉的反應以及實時檢測不僅避免了操作誤差，環(huán)境污染，還極大的減少了擴增后鑒定需要的測序，雜交，電泳等繁瑣步驟。檢測方法簡單，省時省力，適用面廣，使用方便。建立針對烈性腦炎病毒的單板、多物種熒光實時定量PCR陣列檢測平臺，使一次PCR反應可以同時快速檢出8種致病性腦炎病毒，以實現(xiàn)熒光PCR檢測多種病原體的集成化和高通量。RT-PCR陣列技術應用將極大滿足蟲媒腦炎病毒快速檢測與監(jiān)測工作的需要，既保證PCR診斷高靈敏和特異性，又可以滿足突發(fā)性時間和傳染性疾病爆發(fā)時的快速高通量檢測的要求，也可以用于大規(guī)模病原體篩查，為致病性腦炎蟲媒病毒感染診斷和確定感染源提供技術支持。幫助疾病控制部門了解疾病發(fā)生的情況，對致病性腦炎臨床防控具有重要的現(xiàn)實意義。本發(fā)明提供的實時熒光RT-PCR陣列試劑盒可以檢測出蟲媒腦炎病毒的最低濃度為1.0×101拷貝/ml，說明本發(fā)明提供的試劑盒具有非常好的靈敏度，可為靈敏、快速早期診斷蟲媒腦炎病毒感染提供可靠的實驗證據(jù)。本發(fā)明的試劑盒在檢測腸道病毒71型、腸道病毒75型、卡薩奇病毒B型、脊髓灰質炎病毒、登革熱病毒Ⅰ～Ⅳ型、霍亂弧菌O1、霍亂弧菌O139、大腸桿菌O157毒株等具有腦膜腦炎癥候的病原體時，無假陽性反應。說明本發(fā)明提供的試劑盒具有非常好的特異性，可為早期診斷蟲媒腦炎病毒感染提供可靠的實驗證據(jù)。附圖說明圖1為8種蟲媒腦炎病毒96孔板一次性檢測結構示意圖，其中行1～8分別為東方馬腦炎病毒，西方馬腦炎病毒，委內瑞拉腦炎病毒，西尼羅病毒，日本腦炎病毒，森林腦炎病毒，尼帕病毒，亨德拉病毒檢測體系；第1列為陽性質控品檢測孔，第2列為陰性質控品檢測孔，第3～12列為樣品檢測孔；每個樣品按列加樣同時進行8個病原檢測。圖2為一步法熒光定量RT-PCR檢測RNA標準品的靈敏度試驗和標準曲線。具體實施方式下面結合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本
技術領域：
常規(guī)試劑、方法和設備。實施例11、標本和樣品的準備：以構建的含有目的擴增區(qū)域的重組假病毒作為腦炎病毒檢測的陽性質控品；以腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)、腸道病毒75型(Enterovirus75，EV75)、卡薩奇病毒B型(CoxsackievirusB，CBV)、脊髓灰質炎病毒(Poliovirus，PV)、登革熱病毒(Denguevirus，DENV)Ⅰ～Ⅳ型、霍亂弧菌O1(VibriocholeraeO1，VcO1)、霍亂弧菌O139(ibriocholeraeO139，VcO139)、大腸桿菌O157(E.coliO157)的核酸提取物(均由福建省疾病預防控制中心(CDC)提供)作為特異性參考品；以去離子水及健康人血清作為陰性質控品，分別提取上述陽性質控品與特異性參考品的RNA，陰性質控品待用。檢測樣品由臨床醫(yī)師根據(jù)實際情況進行標本采集，可檢測的標本包括，咽拭子、腦脊液、血清。采集方法如下：①咽拭子：取咽拭子浸取液，離心取上清，密封保存，低溫送檢；②腦脊液：采集時間為出現(xiàn)神經系統(tǒng)癥狀后3d內，采集量為1.0～2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃下送達實驗室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70℃以下冰箱。③血清：無菌采集靜脈血約1ml，分別于室溫和4℃靜置2小時和1小時后，離心(8,000rpm，5分鐘)分離并收集血清標本。標本可立即用于測試，也可以保存于-70℃待測，保存期為6個月。標本運送采用0℃冰壺。樣品RNA提取：樣品RNA提取參照RNA提取試劑盒說明書進行。提取后的RNA立刻進行檢測，或儲存于-70℃以下冰箱用于后續(xù)檢測。2、引物和探針的設計：通過對已報導的腦炎病毒的核酸序列進行序列比對分析，以腦炎病毒特征性基因為擴增靶位點，選擇無二級結構且高度保守的區(qū)段，根據(jù)引物探針設計的基本原則，結合軟件和人工設計多對引物和探針，通過比對工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的blast比對進行引物同源性檢索，進一步篩選特異性較高的引物和探針，熒光定量PCR的擴增片斷大小均在50～150bp，且所有引物和探針擁有類似的GC含量和Tm值。在探針序列5’端標記作為熒光發(fā)生基團(報告基團)的6-FAM亞磷酰胺，在探針序列3’端標記借助活性連接臂偶聯(lián)上作為熒光淬滅(抑制基團)的TAMARA。3、引物和探針的篩選：以上述步驟2中設計的多組引物和探針分別檢測陽性質控品與陰性參考品的RNA，經反復試驗，篩選出特異性、靈敏度和重復性好的最佳引物和探針組合。4、引物和探針濃度的優(yōu)化：在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從2pmol/μl至15pmol/μl濃度梯度的引物和從2pmol/μl至15pmol/μl濃度梯度的探針進行PCR反應，經多次重復試驗發(fā)現(xiàn)引物和探針濃度在5～15pmol/μl反應之間均可，其中最佳的引物濃度為10pmol/μl，最佳的探針濃度為5pmol/μl。5、鎂離子濃度的優(yōu)化：在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1mmol/L至2.5mmol/L濃度梯度的鎂離子進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的鎂離子濃度為2.0mmol/L。6、熱啟動Taq酶用量的優(yōu)化：在25μL反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1U(酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的熱啟動Taq酶用量為3～7U/反應。7、RT酶用量的優(yōu)化：在25μL反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1U(酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的RT酶用量為1.5～3.5U/反應。8、RNA酶抑制劑用量的優(yōu)化：在25μL反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從5U(酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的RNA酶抑制劑用量為15～25U/反應。9、dNTPs濃度的優(yōu)化：在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0.1mmol/L至0.25mmol/L濃度梯度的dNTPs進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的dNTPs濃度為0.20mmol/L。10、反應體系的優(yōu)化：本發(fā)明采用一步法RT-PCR體系，根據(jù)酶的活性和靶多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時間進行了優(yōu)化，經多次重復試驗，最終確定最佳的反應溫度和時間為：50℃逆轉錄15min，1個循環(huán)；94℃10min，1個循環(huán)；最后95℃15s，55～60℃45s，45個循環(huán)。11、陽性質控品的制備與優(yōu)化：除少數(shù)病原體可獲得核酸樣品外，大多數(shù)病原體由于屬于烈性傳染病病原體，未能獲得天然核酸樣品，通過人工合成的方法，將需要檢測的8種蟲媒腦炎病毒的靶標序列按EEEV、WEEV、VEEV、TBEV、JEV、WNV、NiV、HeV排列順序全部組合在一條基因鏈上，然后由Takara公司合成該基因全長，片段大小為2629bp，基因命名為EEPV，同時由Takara公司構建重組PLPCX逆轉錄病毒載體，重組質粒命名為PLPCX-EEPV。PLPCX-EEPV與PVSV-G包裝質粒共轉染GP2-293細胞包裝和制備包含靶標序列的假病毒。為去除轉染時質粒DNA或細胞裂解釋放出的基因組DNA污染，病毒上清經過DNA酶消化，經RT-PCR和PCR鑒定不含有DNA污染后，將離心獲得的病毒顆粒與新生牛血清混合，制備106copies/μl濃度假病毒懸液，分裝100μl/管，凍干后制備陽性標準品備用。使用時用DEPC水等比例稀釋即可使用，每反應5μl。陰性質控品的制備與優(yōu)化：陰性質控品為生理鹽水，每反應5μl。12、反應體系建立：一步法RT-PCR反應緩沖液(鎂離子濃度為2.0mmol/L)2.5μl，10pmol/μl的上游引物和下游引物各0.1μl，5pmol/μl的探針0.1μl，DEPC水14.2μl，一步法RT-PCR反應酶混合液3μl，模板5μl，共25μl；其中一步法RT-PCR反應酶混合液組成為：10U/μl的熱啟動Taq酶0.5μl，50U/μl逆轉錄酶0.5μl，25mM的dNTPs0.4μl，40U/μl的RNA酶抑制劑0.5μl，一步法酶稀釋液1.1μl。試劑盒的待檢樣品是咽拭子、腦脊液、血清等標本。結合優(yōu)化的RT-PCR反應條件和反應體系，試劑盒的結果判定如下：(1)如果檢測樣品的RT-PCR反應體系擴增曲線在FAM檢測通道無對數(shù)增長期或Ct值＞35，可判樣品為相應病毒感染陰性；(2)如果檢測樣品的RT-PCR反應體系擴增曲線在FAM檢測通道有對數(shù)增長期且FAM檢測通道Ct值≤32，可判定相應病毒感染陽性；(3)如果檢測樣品的RT-PCR反應體系的擴增曲線在FAM檢測通道32＜Ct值≤35，需要對樣品重新進行核酸提取和檢測操作，若再次實驗結果FAM檢測通道Ct值≤32，且曲線有明顯對數(shù)增長期，判樣品為陽性；若FAM檢測通道Ct值＞35，可判樣品為陰性；本發(fā)明提供的實時熒光RT-PCR陣列試劑盒可以檢測出蟲媒腦炎病毒的最低濃度為1.0×101拷貝數(shù)/ml，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。可為靈敏、快速早期診斷蟲媒腦炎病毒感染提供可靠的實驗證據(jù)。實施例2一種同時檢測8種蟲媒腦炎病毒的RT-PCR陣列試劑盒，試劑盒由以下試劑成分組成：一步法RT-PCR反應緩沖液(鎂離子濃度為2.0mmol/L)，SEQIDNO：1～24所示的引物和探針組合，DEPC水，10U/μl的熱啟動Taq酶，50U/μl逆轉錄酶，25mM的dNTPs，40U/μl的RNA酶抑制劑，一步法酶稀釋液，陽性質控品，陰性質控品。另外，試劑盒中還包括96孔檢測板和一份使用說明書。試劑盒的具體使用方法如下：96孔檢測板的裝配。先提前配制好引物和探針混合液，然后再平分加入八連管每孔中(方便加樣和減少孔之間的誤差)，-20℃?zhèn)溆?。每板每種病毒配制八個孔，板上分布如圖1。引物和探針混合液的成分如下：一步法RT-PCR反應緩沖液(含MgCl2)2.5μl，上游引物(10pmol/μl)0.1μl，下游引物(10pmol/μl)0.1μl，探針(5pmol/μl)0.1μl，DEPC水14.2μl，總體積17μl。配制96份量的一步法RT-PCR反應酶混合液(冰盒上操作)，-20℃?zhèn)溆谩Ｃ靠左w系如下：10U/μl的熱啟動Taq酶0.5μl，50U/μl逆轉錄酶0.5μl，25mM的dNTPs0.4μl，40U/μl的RNA酶抑制劑0.5μl，一步法酶稀釋液1.1μl，共3μl。熒光定量PCR總反應體系：根據(jù)RNA提取試劑盒要求提取病毒核酸作為檢測樣品，每個樣品按列加樣同時進行十二個病原檢測，均取60μl核酸提取物，混合36μl反應酶系，充分輕柔混合后，分別取8μl按照1～8的順序加入8個檢測孔中。每個96孔板為10人份檢測規(guī)格。第一列為陽性質控品檢測孔，第二列為陰性質控品檢測孔，其余10列為樣品檢測孔。檢測模式見示意圖1。加樣完成后，PCR反應管3000rpm離心30秒，放入PCR擴增儀。每孔反應體系如下：引物和探針混合液17μl，熒光定量PCR反應酶混合液3μl，模板5μl，總體積25μl。加完樣后，輕輕蓋好八連管至完全閉合，離心后，上機設定程序，反應條件如下：50℃逆轉錄15min，1個循環(huán)；94℃15min，1個循環(huán)；最后95℃15s，55℃45s，45個循環(huán)。在每個循環(huán)退火延伸結束時收集熒光信號，熒光模式設為FAM/TAMARA雙標記模式。結果分析：反應結束后自動保存結果，根據(jù)分析后圖像調節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用戶可根據(jù)實際情況自行調整，Start值可以在3～15、End值可設在5～20，調整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線)，點擊Analysis自動獲得分析結果，在Report界面察看結果。試劑盒的質量控制如下：陰性質控品：FAM檢測通路擴增曲線無對數(shù)增長期或Ct值＞35；陽性質控品：FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，且FAM檢測通道擴增曲線Ct值≤32；以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。確定本試劑盒的陽性樣本參考值為FAM檢測通道CT值≤32，陰性樣本參考值為FAM檢測通道Ct值＞35，F(xiàn)AM檢測通道32＜Ct值≤35為灰度區(qū)。實施例3試劑盒的性能評價靈敏度試驗：將標準品10倍倍比稀釋成模板，稀釋度為10-4～10-10，對應的拷貝數(shù)濃度為106、105、104、103、102、101、100拷貝/μl7個梯度，并設空白對照(體系中不加模板，以水代替)，按上述反應體系和反應條件進行一步法熒光定量RT-PCR反應，并繪制標準曲線，以檢測為陽性的最低檢測濃度確定為該方法的檢測靈敏度。標準曲線的建立：通過10倍倍比稀釋RNA標準品，以106～100拷貝數(shù)/μl7個稀釋度進行一步法熒光定量RT-PCR后，得到擴增曲線和標準曲線(圖2)；以起始模板的對數(shù)為X軸，Ct值為Y軸做回歸曲線，即得到以上12種病毒檢測的標準曲線，線性關系表達式見圖2右縱列內，從圖中的標準曲線方程可知曲線斜率處于理論值范圍-3.0～-3.5之間，由斜率得出的PCR擴增效率范圍在90％～110％，相關系數(shù)R2>0.98(表3)，表明不同梯度模板拷貝數(shù)的對數(shù)與Ct值之間呈良好的線性關系，其中，EEEV、WEEV、VEEV、JEV、WNV、NiV、HeV、TBEVRNA標準品均在106～101拷貝/μl的范圍之間具有良好的線性關系，空白對照均無熒光增加。將待測樣品的Ct值帶入表達式就可以計算出它們的初始拷貝數(shù)，也可直接從儀器上讀取。表3一步法熒光定量RT-PCR檢測RNA標準品的斜率、相關系數(shù)和擴增效率檢測對象斜率相關系數(shù)R2擴增效率E(％)EEEV-3.3370.997100.227WEEV-3.6490.99694.267VEEV-3.580.99995.668JEV-3.6430.99899.006WNV-3.4480.998100.843NiV-3.3680.99695.264HeV-3.4680.998100.421TBEV-3.7470.99697.504交叉試驗和特異性試驗：為了評價熒光定量PCR陣列檢測的特異性，用建立好的TaqMan一步法熒光定量RT-PCR陣列體系，在一塊板中一次性檢測EEEV、WEEV、VEEV、TBEV、JEV、WNV、NiV、HeV、病毒株以及參考樣品腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)、腸道病毒75型(Enterovirus75，EV75)、卡薩奇病毒B型(CoxsackievirusB，CBV)、脊髓灰質炎病毒(Poliovirus，PV)、登革熱病毒(Denguevirus，DENV)Ⅰ～Ⅳ型、霍亂弧菌O1(VibriocholeraeO1，VcO1)、霍亂弧菌O139(ibriocholeraeO139，VcO139)、大腸桿菌O157(E.coliO157)，每塊板均設陰性對照(H2O)和陽性對照(標準品RNA)，以確定反應特異性。結果顯示，其他參考樣品及陰性對照檢測結果為陰性，表明該方法具有良好的特異性，能抵抗常見合并感染和污染物的干擾。結果見表4。表4一步法熒光定量RT-PCR檢測的特異性分析SEQUENCELISTING<110>南方醫(yī)科大學<120>一種同時檢測8種蟲媒腦炎病毒的RT-PCR引物和探針組合及試劑盒<130><160>24<170>PatentInversion3.3<210>1<211>17<212>DNA<213>東方馬腦炎病毒<400>1acctgcacccggaccat17<210>2<211>22<212>DNA<213>東方馬腦炎病毒<400>2cattgtcgagttggatttgcat22<210>3<211>25<212>DNA<213>東方馬腦炎病毒<400>3ccttgctgacgaccaggtcacttgg25<210>4<211>17<212>DNA<213>西方馬腦炎病毒<400>4gtgcgcccgtcagacat17<210>5<211>19<212>DNA<213>西方馬腦炎病毒<400>5cgggtcttcagcgcttatg19<210>6<211>27<212>DNA<213>西方馬腦炎病毒<400>6caatcaccgctatcattgtatctgccc27<210>7<211>23<212>DNA<213>委內瑞拉腦炎病毒<400>7aacatgacgatgacaggagaagg23<210>8<211>24<212>DNA<213>委內瑞拉腦炎病毒<400>8catggccataactatgatggaagt24<210>9<211>24<212>DNA<213>委內瑞拉腦炎病毒<400>9aacacgctggaatcgagtgggaat24<210>10<211>21<212>DNA<213>森林腦炎病毒<400>10aaccacaccgagctgatacca21<210>11<211>23<212>DNA<213>森林腦炎病毒<400>11ggaatctgtgcagtgcttctatg23<210>12<211>26<212>DNA<213>森林腦炎病毒<400>12ttcyaaagtgctggctyccgtaccgc26<210>13<211>24<212>DNA<213>日本腦炎病毒<400>13caagggaatgaaatagtggatgtg24<210>14<211>21<212>DNA<213>日本腦炎病毒<400>14ggcactctgttcggtgacatc21<210>15<211>23<212>DNA<213>日本腦炎病毒<400>15tgccacgccactctgacccatag23<210>16<211>22<212>DNA<213>西尼羅腦炎病毒<400>16taacttcaaagcccaatgtcag22<210>17<211>21<212>DNA<213>西尼羅腦炎病毒<400>17gacgttggtttgcctttgtta21<210>18<211>24<212>DNA<213>西尼羅腦炎病毒<400>18ctacggcgtgctactctgcggaga24<210>19<211>26<212>DNA<213>尼帕腦炎病毒<400>19atggcakaatagactkggactaagtt26<210>20<211>25<212>DNA<213>尼帕腦炎病毒<400>20gcctctctmgcctgaamattactct25<210>21<211>27<212>DNA<213>尼帕腦炎病毒<400>21aactcgctgctgcmgttcargaaacat27<210>22<211>21<212>DNA<213>亨德拉腦炎病毒<400>22ggaatccaaggaagcttcgac21<210>23<211>19<212>DNA<213>亨德拉腦炎病毒<400>23cttcccagctcgtcggaca19<210>24<211>28<212>DNA<213>亨德拉腦炎病毒<400>24caaagtggcatctttcatgctccatctc28當前第1頁1 2 3