本發(fā)明一般涉及微生物學(xué)產(chǎn)業(yè)，并且具體來(lái)說(shuō)涉及通過(guò)腸肝菌科細(xì)菌的發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，所述腸肝菌科細(xì)菌以減弱gshA基因的表達(dá)的方式進(jìn)行了修飾，使得增強(qiáng)L-氨基酸的生產(chǎn)。

背景技術(shù)：

常規(guī)地，在產(chǎn)業(yè)上通過(guò)利用從天然來(lái)源獲得的微生物菌株或其突變體的發(fā)酵方法生產(chǎn)L-氨基酸。典型地，微生物經(jīng)修飾以提高L-氨基酸的生產(chǎn)產(chǎn)率。

已經(jīng)報(bào)道了許多提高L-氨基酸生產(chǎn)產(chǎn)率的技術(shù)，包括使用重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)4,278,765A)和改變表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)，如啟動(dòng)子，前導(dǎo)序列，和/或弱化子(attenuator)，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它調(diào)節(jié)區(qū)(見(jiàn)例如US20060216796 A1和WO9615246 A1)。用于提高生產(chǎn)產(chǎn)率的其它技術(shù)包括增加參與氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目標(biāo)酶對(duì)所得L-氨基酸的反饋抑制脫敏(見(jiàn)例如WO9516042 A1，EP068555 A1或美國(guó)專利號(hào)4,346,170A，5,661,012A和6,040,160A)。

用于提高L-氨基酸生產(chǎn)產(chǎn)率的另一種方法是減弱以下基因的表達(dá)：參與目標(biāo)L-氨基酸降解的一個(gè)基因或幾個(gè)基因，將目標(biāo)L-氨基酸的前體從該氨基酸生物合成途徑中轉(zhuǎn)移的基因，參與碳、氮和磷酸鹽通量再分配的基因，以及編碼毒素的基因等。

gshA基因編碼γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶，其催化從L-谷氨酸生物合成谷胱甘肽的途徑中的兩個(gè)步驟的第一個(gè)。該酶由谷胱甘肽反饋抑制(Apontoweil P.and Berends W.,Glutathione biosynthesis in Escherichia coli K 12.Properties of the enzymes and regulation,Biochim.Biophys.Acta,1975,399(1):1-9)。具有增加的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(SAT)活性和metC、tnaA、gshA和dfp基因缺失的大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株用于通過(guò)該細(xì)菌的發(fā)酵的L-半胱氨酸生產(chǎn)的方法(CN101831397A)。

然而，先前尚未報(bào)道下述數(shù)據(jù)，其描述減弱gshA基因的表達(dá)對(duì)通過(guò)發(fā)酵 腸桿菌科的產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌進(jìn)行L-氨基酸生產(chǎn)的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了使用屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法，如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-甲硫氨酸，L-鳥(niǎo)氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-纈氨酸，所述細(xì)菌可以屬于埃希氏菌屬(Escherichia)，并且更具體而言，屬于大腸桿菌物種，并且以減弱gshA基因的表達(dá)的方式進(jìn)行了修飾。

通過(guò)以下發(fā)現(xiàn)完成了這一目的：減弱屬于腸桿菌科的產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌的染色體上的gshA基因的表達(dá)對(duì)該細(xì)菌賦予了較高的L-氨基酸，更具體地支鏈L-氨基酸，且特別但不限于L-纈氨酸的生產(chǎn)率(productivity)，所述產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌可以屬于埃希氏菌屬，且更具體的是大腸桿菌物種。此外，可以增加通過(guò)發(fā)酵腸桿菌科的經(jīng)修飾的細(xì)菌的L-氨基酸(如例如支鏈L-氨基酸，包括L-纈氨酸)的生產(chǎn)產(chǎn)率?？梢詼p弱gshA基因，例如通過(guò)失活屬于腸桿菌科的細(xì)菌的染色體上的gshA基因的表達(dá)，所述細(xì)菌可以屬于埃希氏菌屬，且更具體的是大腸桿菌物種。這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致了本發(fā)明的以下非限制性的方面。

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括：

(i)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)腸肝菌科的產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌以在所述培養(yǎng)基中，或在細(xì)菌細(xì)胞中，或所述培養(yǎng)基和所述細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生L-氨基酸；及

(ii)從所述培養(yǎng)基中，或從所述細(xì)菌細(xì)胞中，或從所述培養(yǎng)基中和所述細(xì)菌細(xì)胞中收集L-氨基酸，

其中所述細(xì)菌以減弱gshA基因的表達(dá)的方式進(jìn)行了修飾。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述細(xì)菌屬于泛菌屬(Pantoea)。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述細(xì)菌是菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中g(shù)shA基因的表達(dá)由于gshA基因的失活而減弱。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中g(shù)shA基因是缺失的。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中g(shù)shA基因選自下組：

(A)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的DNA；

(B)包含由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性所致的SEQ ID NO:1的變體核苷酸序列的DNA；

(C)相對(duì)于SEQ ID NO:1的整個(gè)核苷酸序列具有不低于60％的同一性的DNA，且其中所述DNA編碼具有γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶活性的蛋白質(zhì)；

(D)編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；和

(E)編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，該氨基酸序列包括一個(gè)或多個(gè)突變，包括一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，且其中所述蛋白具有γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶的活性，

(F)編碼蛋白的DNA，所述蛋白相對(duì)于SEQ ID NO:2的完整氨基酸序列具有不低于65％的同一性，且其中所述蛋白具有γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶的活性。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸選自芳香族L-氨基酸和非芳香族L-氨基酸。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述芳香族L-氨基酸選自L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述非芳香族L-氨基酸選自L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-甲硫氨酸，L-鳥(niǎo)氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸和L-纈氨酸。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸是支鏈L-氨基酸。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述支鏈L-氨基酸選自L-異亮氨酸，L-亮氨酸和L-纈氨酸。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-纈氨酸。

發(fā)明詳述

本發(fā)明在下面詳細(xì)地描述。

1.細(xì)菌

可以使用任意屬于腸桿菌科并經(jīng)修飾以減弱gshA基因表達(dá)的產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌。短語(yǔ)“產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌”可以意指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)具有產(chǎn)生，排泄(excrete)或分泌L-氨基酸，和/或引起L-氨基酸在培養(yǎng)基和/或細(xì)菌細(xì)胞中積累的能力的腸桿菌科細(xì)菌。

短語(yǔ)“產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌”也可以意指與野生型或親本菌株，如大腸桿菌K-12相比能夠以更大的量產(chǎn)生，排泄或分泌L-氨基酸，和/或引起L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累的細(xì)菌。短語(yǔ)“產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌”也可以意指能夠引起例如不少于0.1g/L，不少于0.5g/L，或不少于1.0g/L量的目標(biāo)L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累的細(xì)菌。

此外，也可以使用屬于腸桿菌科并經(jīng)修飾以減弱gshA基因的表達(dá)的細(xì)菌，其具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力。細(xì)菌可以固有地具有產(chǎn)L-氨基酸的能力，或可以通過(guò)使用突變方法或DNA重組技術(shù)修飾而具有產(chǎn)L-氨基酸的能力?？梢酝ㄟ^(guò)在固有地具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細(xì)菌中，或已經(jīng)賦予了產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細(xì)菌中減弱gshA基因的表達(dá)獲得細(xì)菌?；蛘?，可以通過(guò)將產(chǎn)生L-氨基酸的能力賦予以減弱gshA基因的表達(dá)的方式進(jìn)行了修飾的細(xì)菌獲得細(xì)菌。還有，細(xì)菌也可以是通過(guò)減弱gshA基因的表達(dá)已經(jīng)獲得產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細(xì)菌。

短語(yǔ)“產(chǎn)L-氨基酸的能力”可以意指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)細(xì)菌以下述水平產(chǎn)生，排泄或分泌L-氨基酸，和/或引起L-氨基酸在培養(yǎng)基和/或細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)積累的能力，所述水平使得可以從培養(yǎng)基和/或細(xì)菌細(xì)胞中收集L-氨基酸。

細(xì)菌可以產(chǎn)生僅一種氨基酸，或兩種或更多種氨基酸的混合物。特別地，細(xì)菌可以產(chǎn)生僅一種L-氨基酸，或兩種或更多種氨基酸的混合物。

短語(yǔ)“氨基酸”可以意指含有至少一個(gè)氨基基團(tuán)(NH₂)和至少一個(gè)羧基基團(tuán)(COOH)的有機(jī)化合物。L-氨基酸是氨基酸的非限制性例子。

短語(yǔ)“L-氨基酸”可以意指L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-甲硫氨酸，L-鳥(niǎo)氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-纈氨酸。

短語(yǔ)“芳香族L-氨基酸”包括例如L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸。由于L-組氨酸具有芳香族部分，具體的是咪唑環(huán)，除了上述芳香族L-氨基酸之外，短語(yǔ)“芳香族L-氨基酸”也可以包括L-組氨酸。

短語(yǔ)“非芳香族L-氨基酸”包括例如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-甲硫氨酸，L-鳥(niǎo)氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸和L-纈氨酸。由于L-組氨酸的生物合成途徑與常見(jiàn)的芳香族氨基酸，如L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸的合成途徑不同，除了上述非芳香族L-氨基酸之外，短語(yǔ)“非芳香族L-氨基酸”也可以包括L-組氨酸。

也就是說(shuō)，L-組氨酸可以被包括在“芳香族L-氨基酸”和“非芳香族L-氨基酸”的任一種或兩者中。

L-氨基酸可以屬于一個(gè)或多個(gè)L-氨基酸家族。作為例子，谷氨酸家族包括L-精氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，和L-脯氨酸；絲氨酸家族包括L-半胱氨酸，甘氨酸，和L-絲氨酸；天冬氨酸家族包括L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-異亮氨酸，L-賴氨酸，L-甲硫氨酸，和L-蘇氨酸；丙酮酸家族包括L-丙氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸和L-纈氨酸；并且芳香族家族包括L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸。由于L-氨基酸可以是另一種L-氨基酸的生物合成途徑中的中間體，上述氨基酸家族也可以包括其它L-氨基酸，如例如非生蛋白性(non-proteinogenic)L-氨基酸。例如，L-瓜氨酸和L-鳥(niǎo)氨酸是來(lái)自L-精氨酸生物合成途徑的氨基酸。因此，谷氨酸家族可以包括L-瓜氨酸和L-鳥(niǎo)氨酸，以及L-精氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，和L-脯氨酸。

L-氨基酸也可以屬于一個(gè)或多個(gè)氨基酸組。例如，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，和L-纈氨酸可以屬于支鏈L-氨基酸(branched-chain L-amino acid)組。此外，L-高亮氨酸和L-高異亮氨酸也可以屬于支鏈氨基酸組。

L-丙氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-纈氨酸，L-高亮氨酸和L-高異亮 氨酸是L-氨基酸的具體例子。L-丙氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸和L-纈氨酸是L-氨基酸的具體例子。L-異亮氨酸，L-亮氨酸和L-纈氨酸是L-氨基酸的更具體的例子。L-纈氨酸是L-氨基酸的還更具體的例子。

短語(yǔ)“L-氨基酸”不僅可以指游離形式的氨基酸，而且還可以包括氨基酸的鹽或水合物，或由氨基酸和另一種有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物形成的加合物。氨基酸的鹽的例子包括，例如，硫酸鹽，氯化物，碳酸鹽，銨鹽，鈉鹽，鉀鹽，和鹽酸鹽。氨基酸的鹽的具體例子包括但不限于L-賴氨酸的單鹽酸鹽(monochlorhydrate salt of L-lysine)(L-賴氨酸·HCl)和L-精氨酸的單鹽酸鹽(monochlorhydrate salt of L-arginine)(L-精氨酸-HCl)。氨基酸的水合物的例子包括，例如，一水合物和二水合物。氨基酸的水合物的具體例子包括一水合L-半胱氨酸(L-cysteine monohydrate)(L-Cys·H₂O)。

屬于腸桿菌科的細(xì)菌可以來(lái)自腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文氏菌屬(Erwinia)，埃希氏菌屬，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，摩根氏菌屬(Morganella)，泛菌屬，發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)，普羅威登斯菌屬(Providencia)，沙門氏菌屬(Salmonella)，耶爾森氏菌屬(Yersinia)等等，并且可以具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力。特別地，可以使用根據(jù)NCBI(國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)中使用的分類系統(tǒng)歸入腸桿菌科的細(xì)菌?？梢孕揎椀膩?lái)自腸肝菌科的細(xì)菌的例子包括埃希氏菌屬，腸桿菌屬，或泛菌屬。

可以經(jīng)修飾以獲得依照本公開(kāi)的主題的埃希氏菌屬細(xì)菌的埃希氏菌屬細(xì)菌沒(méi)有具體限制，并且特別地，可以使用Neidhardt等的工作中描述的那些菌株(Bachmann,B.J.,Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E.coli K-12,p.2460-2488.In F.C.Neidhardt et al.(ed.),E.coli and Salmonella:cellular and molecular biology,2nd ed.ASM Press,Washington,D.C.,1996)。大腸桿菌物種是一個(gè)具體的例子。大腸桿菌的具體例子包括大腸桿菌W3110(ATCC 27325)，大腸桿菌MG1655(ATCC 47076)等等，其來(lái)源于原型野生型菌株，K-12菌株。這些菌株可以從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)獲得。也就是說(shuō)，對(duì)于每個(gè)菌株給出了登記號(hào)，并且可以通過(guò)使用這些登記號(hào)訂購(gòu)菌株(參見(jiàn)http://www.atcc.org)。菌株的登記號(hào)列在美國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心的目錄中。

腸桿菌屬細(xì)菌的例子包括成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等。泛菌屬細(xì)菌的例子包括菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)等等?；?6S rRNA的核苷酸序列分析等等，成團(tuán)腸桿菌的一些菌株最近重新分類為成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)，菠蘿泛菌，或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)?？梢允褂脤儆谀c桿菌屬或泛菌屬的細(xì)菌，只要它是分類為腸桿菌科的細(xì)菌。當(dāng)通過(guò)遺傳工程技術(shù)培育菠蘿泛菌時(shí)，可以使用菠蘿泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)及其衍生物。這些菌株當(dāng)它們被分離時(shí)鑒定為成團(tuán)腸桿菌，并且以成團(tuán)腸桿菌保藏。然而，如上文所述，基于16S RNA的核苷酸測(cè)序等，它們最近重新分類為成團(tuán)泛菌。

在下文，將具體舉例說(shuō)明產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌?？梢元?dú)立或以任意適合的組合使用產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌的任意特性和用于賦予或增強(qiáng)產(chǎn)L-氨基酸的能力的修飾，如下文舉例說(shuō)明的那些。

產(chǎn)L-精氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-精氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-精氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌237菌株(VKPM B-7925)(美國(guó)專利申請(qǐng)No.2002/058315A1)和其包含突變體N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄羅斯專利No.2215783 C2)，大腸桿菌382菌株(VKPM B-7926，EP1170358A1)，其是來(lái)源于237菌株并具有改進(jìn)的乙酸同化能力的菌株，大腸桿菌382ilvA+菌株，其是通過(guò)將來(lái)自大腸桿菌K-12菌株的ilvA基因的野生型等位基因引入382菌株自其獲得的菌株，等等。突變體N-乙酰谷氨酸合酶的例子包括例如通過(guò)取代對(duì)應(yīng)于野生型酶的位置15至19的氨基酸殘基針對(duì)L-精氨酸的反饋抑制脫敏的突變體N-乙酰谷氨酸合酶(EP1170361 A1)。

產(chǎn)L-精氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-精氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子也包括下述菌株，其中編碼L-精氨酸生物合成酶的一種或多種基因的表達(dá)得到增強(qiáng)。除編碼N-乙酰谷氨酸合酶(argA)的基因外，此類基因的例子包括編碼以下酶的基因：N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸還原酶(acetyl-γ-glutamylphosphate reductase,argC)、鳥(niǎo)氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(ornithine acetyltransferase,argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase,argB)、N-乙酰鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(N-acetylornithine aminotransferase,argD)、鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(ornithine carbamoyltransferase,argF)、精氨基琥珀酸合酶(argininosuccinate synthase,argG)、精氨基琥珀酸裂合酶(argininosuccinate lyase,argH)，和氨甲酰磷酸合成酶(carbamoyl phosphate synthetase,carAB)。

產(chǎn)L-精氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-精氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子也包括對(duì)氨基酸類似物具有抗性的菌株等等。這樣的菌株的例子包括對(duì)α-甲基甲硫氨酸、對(duì)氟代苯丙氨酸(p-fluorophenylalanine)、D-精氨酸、精氨酸異羥肟酸鹽(arginine hydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸、α-甲基絲氨酸、β-2-噻吩丙氨酸(β-2-thienylalanine)或磺胺胍(sulfaguanidine)具有抗性的大腸桿菌突變體菌株(參見(jiàn)日本專利公開(kāi)(Laid-open)(Kokai)No.56-106598)。

產(chǎn)L-瓜氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-瓜氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-瓜氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌237/pMADS11、237/pMADS12、和237/pMADS13菌株(RU2215783 C2，歐洲專利No.1170361B1，美國(guó)專利No.6,790,647B2)(其具有突變體N-乙酰谷氨酸合酶)，大腸桿菌333菌株(VKPM B-8084)和374菌株(VKPM B-8086)(兩者都具有突變體反饋抗性氨甲酰磷酸合成酶)(俄羅斯專利No.2264459 C2)，α-酮戊二酸合酶活性增加，并且鐵氧還原蛋白NADP⁺還原酶，丙酮酸合酶，和/或α-酮戊二酸脫氫酶活性另外修飾的大腸桿菌菌株(EP2133417 A1)，以及菠蘿泛菌NA1sucAsdhA菌株(其中琥珀酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶活性減少)(美國(guó)專利申請(qǐng)No.2009286290 A1)等。

由于L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途徑的中間體，產(chǎn)L-瓜氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-瓜氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括編碼L-精氨酸生物合成酶的一種或多種基因的表達(dá)增強(qiáng)的菌株。此類基因的例子包括但不限于編碼以下酶的基因：N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamate synthase,argA)、N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase,argB)、N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(N-acetylglutamyl phosphate reductase,argC)、N-乙酰鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(acetylornithine transaminase,argD)、乙酰鳥(niǎo)氨酸脫乙?；?acetylornithine deacetylase,argE)、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(ornithine carbamoyltransferase,argF/I)、和氨甲酰磷酸合成酶(carbamoyl phosphate synthetase,carAB)，及其組合。

可以通過(guò)失活由argG基因編碼的精氨基琥珀酸合酶容易地從任何產(chǎn)L- 精氨酸的細(xì)菌，如大腸桿菌382菌株(VKPM B-7926)獲得產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的細(xì)菌。

產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，如用編碼反饋抗性絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的不同cysE等位基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM15(美國(guó)專利No.6,218,168 B1，俄羅斯專利No.2279477 C2)，具有編碼適合于分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因過(guò)表達(dá)的大腸桿菌W3110(美國(guó)專利No.5,972,663A)，具有降低的半胱氨酸脫巰基酶活性的大腸桿菌菌株(JP11155571A2)，具有由cysB基因編碼的半胱氨酸調(diào)節(jié)子的正轉(zhuǎn)錄調(diào)控物的活性增加的大腸桿菌W3110(WO0127307A1)等。產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括大腸桿菌JM15菌株(ydeD)，其是大腸桿菌JM15(美國(guó)專利No.6,218,168 B1)的衍生物，并已經(jīng)用含有ydeD基因的DNA轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利No.5,972,663)。

產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌VL334thrC⁺(EP1172433 A1)。大腸桿菌VL334(VKPM B-1641)是一種具有thrC和ilvA基因中的突變的L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株(美國(guó)專利No.4,278,765)。通過(guò)使用在野生型大腸桿菌K-12菌株(VKPM B-7)細(xì)胞上培養(yǎng)的噬菌體P1進(jìn)行的通用轉(zhuǎn)導(dǎo)方法轉(zhuǎn)移thrC基因的野生型等位基因。因此，得到了L-異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株VL334thrC⁺(VKPM B-8961)，其能夠產(chǎn)生L-谷氨酸。

產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-半胱氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于編碼L-谷氨酸生物合成酶的一種或多種基因的表達(dá)得到增強(qiáng)的菌株。此類基因的例子包括編碼以下酶的基因：谷氨酸脫氫酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltBD)、異檸檬酸脫氫酶(icdA)、烏頭酸水合酶(acnA、acnB)、檸檬酸合酶(gltA)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脫氫酶(aceEF、lpdA)、丙酮酸激酶(pykA、pykK)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸變位酶(pgmA、pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapA)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpiA)、二磷酸果糖醛縮酶(fbp)和磷酸葡糖異構(gòu)酶(pgi)。

經(jīng)修飾使得檸檬酸合成酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨 酸脫氫酶基因的表達(dá)增強(qiáng)的菌株的例子包括EP 1078989 A2、EP955368 A2和EP952221 A2中公開(kāi)的那些菌株。

產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-谷氨酸細(xì)菌的親本菌株的例子還包括具有降低或消除的酶活性的菌株，所述酶催化通過(guò)從L-谷氨酸生物合成途徑分叉而合成與L-谷氨酸不同的化合物。此類酶的例子包括異檸檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脫氫酶(sucA)、乙酰乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(pfl)、乳酸脫氫酶(ldh)、谷氨酸脫羧酶(gadAB)和琥珀酸脫氫酶(sdhABCD)。在酶的名稱后面的括號(hào)中顯示的是編碼該酶的基因的例子(其應(yīng)當(dāng)適用于下文的相同情況)。在α-酮戊二酸脫氫酶活性中缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脫氫酶活性的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌和用于獲得它們的方法描述于美國(guó)專利No.5,378,616和5,573,945。特別地，這些菌株包括以下：

大腸桿菌W3110sucA::Km^R，

大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853)，

大腸桿菌AJ12628(FERM BP-3854)，

大腸桿菌AJ12949(FERM BP-4881)。

大腸桿菌W3110sucA::Km^R是一種通過(guò)破壞大腸桿菌W3110的α-酮戊二酸脫氫酶基因(此后稱為“sucA基因”)獲得的菌株。該菌株在α-酮戊二酸脫氫酶中完全缺陷。

產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌的親本菌株的其它例子包括屬于埃希氏菌屬并且對(duì)天冬氨酸抗代謝物(天冬氨酸類似物)具有抗性的菌株。這些菌株也可以在α-酮戊二酸脫氫酶活性中有缺陷，并且其例子包括例如大腸桿菌AJ13199(FERM BP-5807)(美國(guó)專利No.5,908,768)，大腸桿菌FFRM P-12379(其另外具有降低的L-谷氨酸分解能力)(美國(guó)專利No.5,393,671)，大腸桿菌AJ13138(FERM BP-5565)(美國(guó)專利No.6,110,714)等。

產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括泛菌屬細(xì)菌，如菠蘿泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、菠蘿泛菌SC17菌株(FERM BP-11091)和菠蘿泛菌SC17(0)菌株(VKPM B-9246)。AJ13355菌株是一種從Iwata-shi(Shizuoka-ken，日本)的土壤中分離的菌株，作為可以在含有L-谷氨酸和碳源的低pH培養(yǎng)基中增殖的菌株。SC17菌株是作為低粘液生產(chǎn)突變菌株(low phlegm-producing mutant strain)從AJ13355菌株選擇的菌株(美國(guó)專利No.6,596,517)。SC17菌株于2009年2月4日保藏在獨(dú) 立的管理機(jī)構(gòu)，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，International Patent Organism Depositary(目前為獨(dú)立的管理機(jī)構(gòu)，National Institute of Technology and Evaluation，International Patent Organism Depositary，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并且指定了FERM BP-11091的保藏號(hào)。AJ13355菌株于1998年2月19日保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology(目前為NITE IPOD，#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，日本)，并且指定了FERM P-16644的保藏號(hào)。然后，于1999年1月11日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將該保藏物轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物，并且指定了FERM BP-6614的保藏號(hào)。

產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括在α-酮戊二酸脫氫酶活性上有缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脫氫酶活性的屬于泛菌屬的突變體菌株，并且可以如上文所述獲得。這樣的菌株包括菠蘿泛菌AJ13356(美國(guó)專利No.6,331,419 B1)。菠蘿泛菌AJ13356于1998年2月19日以保藏號(hào)FERM P-16645保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industry(目前，NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)。然后，于1999年1月11日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將它轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物，并且接受了保藏號(hào)FERM BP-6615。由于αKGDH-E1亞基基因(sucA)的破壞，菠蘿泛菌AJ13356在α-酮戊二酸脫氫酶活性上有缺陷。上述菌株當(dāng)它被分離時(shí)鑒定為成團(tuán)腸桿菌，并且保藏為成團(tuán)腸桿菌AJ13356。然而，基于16S rRNA核苷酸測(cè)序等，它最近重新分類為菠蘿泛菌。雖然AJ13356在上述保藏單位作為成團(tuán)腸桿菌保藏，但是為了本說(shuō)明書的目的，將它們描述為菠蘿泛菌。

產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括屬于泛菌屬的菌株，例如菠蘿泛菌SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株、菠蘿泛菌AJ13601菌株、菠蘿泛菌NP106菌株、和菠蘿泛菌NA1菌株。通過(guò)將含有源自大腸桿菌的檸檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)和谷氨酸脫氫酶基因(gdhA)的質(zhì)粒RSFCPG以及含有源自乳酸發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)的檸檬酸合酶基因(gltA)的質(zhì)粒pSTVCB導(dǎo)入SC17sucA菌株中獲得SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。AJ13601菌株 是作為在低pH下對(duì)高濃度的L-谷氨酸有抗性的菌株從SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株選擇的菌株。通過(guò)消除(curing)RSFCPG和pSTYCB質(zhì)粒，從AJ13601菌株獲得NP106菌株。AJ13601菌株于1999年8月18日保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industry(目前，NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并且指定了保藏號(hào)FERM P-17516。然后，于2000年7月6日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將該保藏物轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物，并且指定了保藏號(hào)FERM BP-7207。

產(chǎn)L-組氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-組氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-組氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，例如大腸桿菌24菌株(VKPM B-5945，RU 2003677 C1)、大腸桿菌80菌株(VKPM B-7270,RU2119536 C1)、大腸桿菌NRRL B-12116-B-12121(美國(guó)專利No.4,388,405)、大腸桿菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美國(guó)專利No.6,344,347 B1)、大腸桿菌H-9341(FERM BP-6674)(EP 1085087 A2)、大腸桿菌AI80/pFM201(美國(guó)專利No.6,258,554 B1)等。

產(chǎn)L-組氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-組氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括編碼L-組氨酸生物合成酶的一種或多種基因的表達(dá)得到增強(qiáng)的菌株。這些基因的例子包括編碼以下酶的基因：ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP環(huán)水解酶(hisI)、磷酸核糖基-ATP環(huán)水解酶/磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(hisIE)、磷酸核糖基亞胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核苷酸異構(gòu)酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase,hisA)、酰胺轉(zhuǎn)移酶(amidotransferase,hisH)、組胺醇磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(histidinol phosphate aminotransferase,hisC)、組胺醇磷酸酶(histidinol phosphatase,hisB)和組胺醇脫氫酶(histidinol dehydrogenase,hisD)等。

已知由hisG和hisBHAFI編碼的L-組氨酸生物合成酶受到L-組氨酸的抑制，并且因此也可以通過(guò)將對(duì)反饋抑制賦予抗性的突變引入ATP磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶中有效增強(qiáng)產(chǎn)L-組氨酸的能力(俄羅斯專利No.2003677 C1和2119536C1)。

具有產(chǎn)L-組氨酸的能力的菌株的具體例子包括大腸桿菌FERM-P 5038和 5048(其已經(jīng)使用攜帶編碼L-組氨酸-生物合成酶的DNA的載體轉(zhuǎn)化)(JP56-005099A)，使用rht(一種用于氨基酸輸出的基因)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株(EP1016710A2)，大腸桿菌80菌株(其已經(jīng)賦予磺胺胍，DL-1,2,4-三唑-3-丙氨酸和鏈霉素抗性)(VKPM B-7270,RU2119536 C1)，大腸桿菌MG1655+hisGr hisL'_ΔΔpurR(RU2119536和Doroshenko V.G.et al.,The directed modification of Escherichia coli MG1655to obtain histidine-producing mutants,Prikl.Biochim.Mikrobiol.(Russian),2013,49(2):149-154)等。

產(chǎn)L-異亮氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-異亮氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-異亮氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于對(duì)6-二甲基氨基嘌呤具有抗性的突變體菌株(JP 5-304969A)，對(duì)異亮氨酸類似物，如硫代異亮氨酸和異亮氨酸異羥肟酸鹽具有抗性的突變體菌株，和另外對(duì)DL-乙硫氨酸和/或精氨酸異羥肟酸鹽(arginine hydroxamate)具有抗性的突變體菌株(JP 5-130882 A)。另外，用編碼參與L-異亮氨酸生物合成的蛋白，如蘇氨酸脫氨酶和乙酰醇酸合酶(acetohydroxate synthase)的基因轉(zhuǎn)化的重組菌株也可以用作產(chǎn)L-異亮氨酸的細(xì)菌或其親本菌株(JP 2-458 A,EP0356739 A1,和美國(guó)專利No.5,998,178)。

產(chǎn)L-亮氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-亮氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-亮氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，例如對(duì)亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌株(例如，57菌株(VKPM B-7386,美國(guó)專利No.6,124,121))；對(duì)亮氨酸類似物有抗性的大腸桿菌菌株(JP 62-34397 B和JP 8-70879 A)，包括β-2-噻吩丙氨酸(β-2-thienylalanine)、3-羥基亮氨酸(3-hydroxyleucine)、4-氮雜亮氨酸(4-azaleucine)和5,5,5-三氟亮氨酸(5,5,5-trifluoroleucine)；通過(guò)WO96/06926中所述的基因工程技術(shù)獲得的大腸桿菌菌株；大腸桿菌H-9068(JP 8-70879 A)等。

產(chǎn)L-亮氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-亮氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子也包括參與L-亮氨酸生物合成的一種或多種基因的表達(dá)得到增強(qiáng)的菌株。這些基因的例子包括leuABCD操縱子的基因，其可以以突變體leuA基因代表，所述突變體leuA基因編碼解除L-亮氨酸的反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶(α-isopropylmalate synthase)(美國(guó)專利No.6,403,342 B1)。另外，產(chǎn)L-亮氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-亮氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子也包括編碼蛋白 質(zhì)的一種或多種基因的表達(dá)得到增強(qiáng)的菌株，所述蛋白質(zhì)從細(xì)菌細(xì)胞分泌L-氨基酸。此類基因的例子包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。

產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括屬于埃希氏菌屬并且對(duì)L-賴氨酸類似物具有抗性的突變體菌株。L-賴氨酸類似物抑制屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的生長(zhǎng)，但是當(dāng)L-賴氨酸存在于培養(yǎng)基中時(shí)，此抑制被完全或部分脫敏。L-賴氨酸類似物的例子包括但不限于氧雜賴氨酸(oxalysine)、賴氨酸異羥肟酸鹽(lysine hydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基賴氨酸、α-氯己內(nèi)酰胺(α-chlorocaprolactam)等。可以通過(guò)將屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)的人工誘變處理，獲得對(duì)這些賴氨酸類似物具有抗性的突變體菌株?？捎糜谏a(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌菌株的具體例子包括大腸桿菌AJ11442(FERM BP-1543、NRRL B-12185；見(jiàn)美國(guó)專利No.4,346,170)和大腸桿菌VL611。在這些菌株中，L-賴氨酸對(duì)天冬氨酸激酶(aspartokinase)的反饋抑制是脫敏的。

產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括編碼L-賴氨酸生物合成酶的一種或多種基因的表達(dá)得到增強(qiáng)的菌株。此類基因的例子包括但不限于編碼以下酶的基因：二氫吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase,dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、二氨基庚二酸脫羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脫氫酶(ddh)(美國(guó)專利No.6,040,160)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)、和天冬氨酸酶(aspA)(EP 1253195A)。另外，產(chǎn)L-賴氨酸細(xì)菌或其親本菌株可以具有參與能量效率的基因(cyo)(EP1170376 A1)，編碼煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(nicotinamide nucleotide transhydrogenase)的基因(pntAB)(美國(guó)專利No.5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)，或其組合的表達(dá)水平升高。由于天冬氨酸激酶III受到L-賴氨酸的反饋抑制，編碼針對(duì)L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的天冬氨酸激酶III的突變體lysC基因(美國(guó)專利No.5,932,453)可以用于增強(qiáng)這種酶的活性。此外，由于二氫吡啶二羧酸合酶受到L-賴氨酸的反饋抑制，編碼針對(duì)L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的二氫吡啶二羧酸合酶的突變體dapA基因可以用于增強(qiáng)這種酶的活性。

產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌或可以用于衍生產(chǎn)L-賴氨酸細(xì)菌的親本菌株可以具有 降低的酶活性或無(wú)酶活性，所述酶催化引起從L-賴氨酸生物合成途徑分叉，并且導(dǎo)致另一種化合物的產(chǎn)生的反應(yīng)。另外，產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌或可以用于衍生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌的親本菌株可以具有降低的酶活性或無(wú)酶活性，所述酶負(fù)面作用于L-氨基酸合成或積累。參與L-氨基酸產(chǎn)生的此類酶的例子包括高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(cadA,ldcC)、蘋果酸酶等，并且其中這些酶的活性被減少或刪除的菌株公開(kāi)于WO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等。

為了減少或刪除賴氨酸脫羧酶活性，可以減少編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和ldcC基因兩者的表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)例如WO2006/078039中所述的方法減少這兩個(gè)基因的表達(dá)。

產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括大腸桿菌WC196菌株(美國(guó)專利No.5,827,698),大腸桿菌WC196ΔcadAΔldc菌株、和大腸桿菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2菌株(WO2006/078039)。

WC196菌株通過(guò)將AEC抗性賦予W3110菌株從W3110菌株(其衍生于大腸桿菌K-12)培育(美國(guó)專利No.5,827,698)。WC196菌株是指定的大腸桿菌AJ13069，并且于1994年12月6日保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industry(目前，NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并且指定了保藏號(hào)FERM P-14690。然后，于2000年7月6日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將該保藏轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，并且指定了保藏號(hào)FERM P-14690。然后，于1995年9月29日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，并且分配了保藏號(hào)FERM BP-5252(美國(guó)專利No.5,827,698)。

WC196ΔcadAΔldc菌株是通過(guò)破壞編碼賴氨酸脫羧酶的cadA和ldcC基因從WC196菌株構(gòu)建。WC196ΔcadAΔldc菌株指定為AJ110692，并于2008年10月7日以保藏號(hào)FERM BP-11027作為國(guó)際保藏物保藏在獨(dú)立的管理機(jī)構(gòu)，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,International Patent Organism Depositary(目前，NITE IPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)。

通過(guò)向WC196ΔcadAΔldc菌株中導(dǎo)入含有賴氨酸生物合成基因的質(zhì)粒 pCABD2(美國(guó)專利No.6,040,160)構(gòu)建了WC196ΔcadAΔldc/pCABD2菌株。該質(zhì)粒pCABD2含有源自大腸桿菌并編碼具有針對(duì)L-賴氨酸反饋抑制脫敏的突變(H118Y)的二氫吡啶二羧酸合酶(DDPS)的突變體dapA基因、源自大腸桿菌并編碼具有針對(duì)L-賴氨酸反饋抑制脫敏的突變(T352I)的天冬氨酸激酶III的突變體lysC基因、源自大腸桿菌并編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB基因，和源自乳發(fā)酵短桿菌并編碼二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因。

產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括大腸桿菌AJIK01菌株(NITE BP-01520)。該AJIK01菌株指定為大腸桿菌AJ111046，并且于2013年1月29日保藏于NITE IPOD(#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)。然后，它于2014年5月15日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物，并且指定保藏號(hào)為NITE BP-01520。

產(chǎn)L-甲硫氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-甲硫氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-甲硫氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌AJ11539菌株(NRRL B-12399)、AJ11540(NRRL B-12400)、AJ11541(NRRL B-12401)、AJ11542(NRRL B-12402)(專利GB2075055)；和對(duì)正亮氨酸(L-甲硫氨酸類似物)有抗性的大腸桿菌218菌株(VKPM B-8125)(RU2209248 C2)和73菌株(VKPM B-8126)(RU2215782)等。大腸桿菌73菌株于2001年5月14日在保藏號(hào)VKPM B-8126下保藏于俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM；FGUP GosNII Genetika,Russian Federation,117545Moscow,1stDorozhny proezd,1)。然后，它于2002年2月1日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物。此外，甲硫氨酸阻遏物缺陷菌株和使用編碼參與L-甲硫氨酸生物合成的蛋白質(zhì)如高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀?；?homoserine transsuccinylase)和胱硫醚γ-合酶的基因轉(zhuǎn)化的重組菌株(JP2000-139471A)也可以用作產(chǎn)L-甲硫氨酸的細(xì)菌或其親本菌株。

產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的細(xì)菌

由于L-鳥(niǎo)氨酸是L-精氨酸生物合成途徑的中間體，產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的細(xì)菌和可以用于衍生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括編碼L-精氨酸生物合成酶(如上文所述的那些)的一種或多種基因的表達(dá)增強(qiáng)的菌株。

可以通過(guò)由argF和argI基因兩者編碼的鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的失活， 從任意產(chǎn)L-精氨酸的細(xì)菌，例如大腸桿菌382菌株(VKPM B-7926)容易地得到產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的細(xì)菌。用于鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的失活的方法描述于本文。

產(chǎn)L-苯丙氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-苯丙氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-苯丙氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8179)，大腸桿菌HW1089(ATCC 55371)(其含有突變體pheA34基因)(美國(guó)專利No.5,354,672)，大腸桿菌MWEC101-b(KR8903681)，大腸桿菌NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146和NRRL B-12147(美國(guó)專利No.4,407,952)，大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)、大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-arpG4，pACMAB]，命名為AJ12604(FERM BP-3579)(EP488424B1)。此外，產(chǎn)L-苯丙氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-苯丙氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括屬于埃希氏菌屬并且具有提高的由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質(zhì)的活性的菌株(美國(guó)專利No.7,259,003和7,666,655)。

產(chǎn)L-脯氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-脯氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-脯氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌702ilvA(VKPM B-8012)，其在ilvA基因上是缺陷的且能夠產(chǎn)生L-脯氨酸(EP1172433 A1)。產(chǎn)L-脯氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-脯氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括參與L-脯氨酸生物合成的一種或多種基因的表達(dá)增強(qiáng)的菌株。可以用于產(chǎn)L-脯氨酸的細(xì)菌中的這些基因的例子包括編碼具有脫敏的L-脯氨酸反饋抑制的谷氨酸激酶的proB基因(DE3127361 A1)。另外，產(chǎn)L-脯氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-脯氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括編碼負(fù)責(zé)從細(xì)菌細(xì)胞分泌L-氨基酸的蛋白質(zhì)的一種或多種基因的表達(dá)增強(qiáng)的菌株。此類基因的例子包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。

具有產(chǎn)生L-脯氨酸的能力的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的例子包括以下大腸桿菌菌株：NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB專利No.2075056)、VKPMB-8012(俄羅斯專利No.2207371 C2)、DE312761 A1中描述的質(zhì)粒突變體、Bloom F.R.等在“The 15^th Miami winter symposium”，1983，p.34中描述質(zhì)粒突變體等。

產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，例如大腸桿菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美國(guó)專利No.5,175,107和5,705,371)、大腸桿菌472T23/pYN7(ATCC 98081)(美國(guó)專利No.5,631,157)、大腸桿菌NRRL B-21593(美國(guó)專利No.5,939,307)、大腸桿菌FERM BP-3756(美國(guó)專利No.5,474,918)、大腸桿菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美國(guó)專利No.5,376,538)、大腸桿菌MG442(Gusyatiner等，Genetika(Russian),1978,14:947-956)、大腸桿菌VL643和VL2055(EP 1149911A2)、大腸桿菌VKPM B-5318(EP 0593792 A1)等。

TDH-6菌株是thrC基因缺陷的，并為蔗糖-同化(sucrose-assimilative)的，并且其ilvA基因具有滲漏突變(leaky mutation)。該菌株在rhtA基因中也具有突變，該突變賦予對(duì)高濃度的蘇氨酸或高絲氨酸的抗性。VKPM B-3996菌株(其含有質(zhì)粒pVIC40)是通過(guò)將質(zhì)粒pVIC40導(dǎo)入TDH-6菌株獲得的。質(zhì)粒pVIC40是通過(guò)將thrA*BC操縱子插入RSF1010-衍生的載體中獲得，所述操縱子包括突變體thrA基因。該突變體thrA基因編碼具有實(shí)質(zhì)性脫敏的蘇氨酸反饋抑制的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I。該VKPM B-3996菌株于1987年11月19日在保藏號(hào)RIA 1867下保藏在All-Union Scientific Center of Antibiotics(Russian Federation,117105Moscow,Nagatinskaya Street 3-A)。該VKPM B-3996菌株還于1987年4月7日在保藏號(hào)VKPM B-3996下保藏在俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)。

B-5318菌株就異亮氨酸而言是原養(yǎng)型的；并含有質(zhì)粒pPRT614，其對(duì)應(yīng)蘇氨酸操縱子的調(diào)控區(qū)被溫度敏感型λ-噬菌體C1阻遏物和PR啟動(dòng)子替代的質(zhì)粒pVIC40。VKPM B-5318菌株于1990年5月3日在保藏號(hào)VKPM B-5318下保藏在俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)。

產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌的親本菌株可以經(jīng)修飾以增強(qiáng)一種或多種以下基因的表達(dá)：

-突變體thrA基因，其編碼對(duì)蘇氨酸反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I；

-thrB基因，其編碼高絲氨酸激酶；

-thrC基因，其編碼蘇氨酸合酶；

-rhtA基因，其編碼蘇氨酸和高絲氨酸流出系統(tǒng)的推定跨膜蛋白；

-asd基因，其編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶；和

-aspC基因，其編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)；

已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌的天冬氨酸激酶I和高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,entry No.b0002；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:337至2,799；Gene ID:945803)。該thrA基因位于大腸桿菌K-12的染色體上的thrL和thrB基因之間。

已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌的高絲氨酸激酶的thrB基因(KEGG,entry No.b0003；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:2,801至3,733；Gene ID:947498)。thrB基因位于大腸桿菌K-12染色體上的thrA和thrC基因之間。

已經(jīng)闡明編碼大腸桿菌的蘇氨酸合酶的thrC基因(KEGG,entry No.b0004；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:3,734至5,020；Gene ID:945198)。thrC基因位于大腸桿菌K-12染色體上的thrB基因和yaaX基因之間。全部三個(gè)基因作為單個(gè)的蘇氨酸操縱子thrABC發(fā)揮功能。為了增強(qiáng)該蘇氨酸操縱子的表達(dá)，期望從該操縱子除去影響轉(zhuǎn)錄的弱化子區(qū)(WO2005049808 A1,WO2003097839 A1)。

突變體thrA基因(其編碼對(duì)L-蘇氨酸反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶I和高絲氨酸脫氫酶I)以及thrB和thrC基因可以作為一個(gè)操作子從公知的質(zhì)粒pVIC4獲得，所述質(zhì)粒存在于產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株VKPM B-3996中。質(zhì)粒pVIC4詳細(xì)描述于美國(guó)專利5,705,371中。

已經(jīng)闡明了rhtA基因(其編碼大腸桿菌的蘇氨酸和高絲氨酸流出系統(tǒng)的蛋白(內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白))(KEGG,entry No.b0813；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:848,433至849,320,互補(bǔ)物；Gene ID:947045)。rhtA基因位于大腸桿菌K-12的染色體上的dps和ompX基因之間，與glnHPQ操縱子(其編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組分)接近。rhtA基因與ybiF基因(KEGG,entry No.b0813)相同。

已經(jīng)闡明了asd基因(其編碼大腸桿菌的天冬氨酸-β-半醛脫氫酶)(KEGG,entry No.b3433；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:3,571,798至3,572,901,互補(bǔ)物；Gene ID:947939)。asd基因位于在大腸桿菌K-12的染色體上的同一條鏈上的glgB和gntU基因(相反鏈上的yhgN基因)之間(The asd gene is located between the glgB and gntU gene on the same strand(yhgN gene on the opposite strand)on the chromosome of E.coli K-12)。

還有，已經(jīng)闡明了aspC基因(其編碼大腸桿菌的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)(KEGG,entry No.b0928；GenBank,accession No.NC_000913.2；核苷酸位置:983,742至984,932,互補(bǔ)物；Gene ID:945553)。aspC基因位于大腸桿菌K-12的染色體上相反鏈上的ycbL基因和同一條鏈上的ompF基因之間。

產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其具有突變體trpS基因，編碼的部分失活的色氨酰-tRNA合成酶(美國(guó)專利No.5,756,345)，大腸桿菌SV164(pGH5)，其具有編碼解除絲氨酸反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼解除色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美國(guó)專利No.6,180,373 B1)，酶色氨酸酶缺陷的大腸桿菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美國(guó)專利No.4,371,614)，大腸桿菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps，其具有增強(qiáng)的磷酸烯醇式丙酮酸生產(chǎn)能力(WO97/08333，美國(guó)專利No.6.319,696 B1)等。產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括屬于埃希氏菌屬并具有增強(qiáng)的由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質(zhì)的活性的菌株(美國(guó)專利申請(qǐng)No.2003148473 A1和2003157667 A1)。

產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括選自下組的酶的一種或多種活性增強(qiáng)的菌株：鄰氨基苯甲酸合酶，磷酸甘油酸脫氫酶和色氨酸合酶。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶兩者都受到L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，因此，可以將脫敏該反饋抑制的突變引入這些酶中。具有此類突變的菌株的具體例子包括大腸桿菌SV 164，其含有脫敏的鄰氨基苯甲酸合酶，和通過(guò)向所述大腸桿菌SV164導(dǎo)入質(zhì)粒pGH5獲得的轉(zhuǎn)化體菌株(WO94/08031 A1)，所述質(zhì)粒pGH5含有編碼反饋脫敏的磷酸甘油酸脫氫酶的突變體serA基因。

產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括其中已經(jīng)引入了色氨酸操縱子的菌株，所述色氨酸操縱子含有編碼脫敏的鄰氨基苯甲酸合酶的基因(JP 57-71397 A,JP 62-244382 A,美國(guó)專利No. 4,371,614)。此外，可以通過(guò)增強(qiáng)色氨酸操縱子中(trpBA)編碼色氨酸合酶的基因的表達(dá)，賦予產(chǎn)L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由分別由trpA和trpB基因編碼的α和β亞基組成。另外，可以通過(guò)增強(qiáng)異檸檬酸裂合酶-蘋果酸合酶操縱子的表達(dá)，改進(jìn)產(chǎn)L-色氨酸的能力(WO2005/103275)。

產(chǎn)L-纈氨酸的細(xì)菌

產(chǎn)L-纈氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-纈氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于已經(jīng)經(jīng)修飾以過(guò)表達(dá)ilvGMEDA操縱子的菌株(美國(guó)專利5,998,178)。期望除去ilvGMEDA操縱子中為弱化所要求的區(qū)域，使得該操縱子的表達(dá)不被產(chǎn)生的L-纈氨酸弱化。此外，期望地，該操縱子中的ilvA基因被破壞，使得蘇氨酸脫氨酶活性降低。

產(chǎn)L-纈氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-纈氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括氨基?；鵷-RNA合成酶中具有突變的突變體菌株(美國(guó)專利No.5,658,766)。此類菌株的例子包括大腸桿菌VL1970，其在編碼異亮氨酸t(yī)-RNA合成酶的ileS基因中具有突變。大腸桿菌VL1970于1988年6月24日在保藏號(hào)VKPM B-4411下保藏在俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1)。

此外，需要硫辛酸用于生長(zhǎng)和/或缺乏H⁺-ATP酶的突變體菌株也可以用作產(chǎn)L-纈氨酸的細(xì)菌或其親本菌株(WO96/06926 A1)。

產(chǎn)L-纈氨酸的細(xì)菌及可以用于衍生產(chǎn)L-纈氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子還包括大腸桿菌H81菌株(VKPM B-8066；見(jiàn)例如EP1942183 B1)，大腸桿菌NRRL B-12287和NRRL B-12288(美國(guó)專利No.4,391,907)，大腸桿菌VKPMB-4411(美國(guó)專利No.5,658,766)，大腸桿菌VKPM B-7707(EP1016710A2)等。

屬于腸桿菌科的本發(fā)明的細(xì)菌已經(jīng)經(jīng)修飾以減弱gshA基因的表達(dá)。

短語(yǔ)“gshA基因”可以表示編碼具有γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶活性的酶的基因。編碼具有γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶活性的酶的基因的具體例子包括編碼γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶的gshA基因。也就是說(shuō)，編碼具有γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶活性的酶的基因可以是gshA基因。對(duì)gshA基因的更具體的描述在下文給出。

gshA基因(同物異名：gsh-I)編碼γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶GshA(同物異名：γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，γGCS)[KEGG，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,entry No.b2688；Protein Knowledgebase,UniProtKB/Swiss-Prot, accession No.P0A6W9]。gshA基因(GenBank,accession No.NC_000913.3；核苷酸位置:2814883至2816439,互補(bǔ)物；Gene ID:944881)位于大腸桿菌K-12菌株的染色體上的相同鏈上的yqaA基因和相反鏈上的micA基因之間。大腸桿菌K-12菌株的gshA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和由大腸桿菌K-12菌株的gshA基因編碼的γGCS蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)是已知的。也就是說(shuō)，gshA基因可以具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，且由gshA基因編碼的γGCS蛋白可以具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。短語(yǔ)“基因或蛋白質(zhì)具有核苷酸或氨基酸序列”包含其中基因或蛋白質(zhì)包含核苷酸或氨基酸序列的情況，以及其中基因或蛋白由核苷酸或氨基酸序列組成的情況。

短語(yǔ)“細(xì)菌以減弱ghsA基因的表達(dá)的方式進(jìn)行了修飾”可以表示細(xì)菌以下述方式進(jìn)行了修飾，從而在經(jīng)修飾的細(xì)菌中g(shù)shA基因的表達(dá)被減弱。短語(yǔ)“細(xì)菌以減弱ghsA基因的表達(dá)的方式進(jìn)行了修飾”可以特別地表示細(xì)菌已經(jīng)以下述方式修飾，從而與非修飾的細(xì)菌相比，在經(jīng)修飾的細(xì)菌中g(shù)shA基因的表達(dá)被減弱。例示的是，gshA基因的表達(dá)可以由于gshA基因的失活而被減弱。

短語(yǔ)“gshA基因是失活的”可以表示該經(jīng)修飾的基因編碼完全無(wú)活性或非功能性的蛋白，即，完全無(wú)活性或非功能性的γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶。也可接受的是經(jīng)修飾的DNA區(qū)域不能天然表達(dá)該基因，由于基因的部分的缺失或整個(gè)基因的缺失，一個(gè)或多個(gè)堿基的替換而導(dǎo)致由基因編碼的蛋白中的氨基酸取代(錯(cuò)義突變)，終止密碼子的引入(無(wú)義突變)，一個(gè)或兩個(gè)堿基的缺失而導(dǎo)致基因的讀碼框移位，插入藥物抗性基因和/或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，或?qū)虻南噜弲^(qū)域的修飾，包括控制基因表達(dá)的序列，如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，弱化子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)等。也可以通過(guò)例如常規(guī)方法，如使用UV照射或亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍)的誘變處理，定點(diǎn)誘變，使用同源重組的基因破壞，和/或插入-缺失誘變進(jìn)行基因的失活(Yu D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(11):5978-5983；Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645；Zhang Y.et al.,Nature Genet.,1998,20:123-128)based on“Red/ET-driven integration”or“λRed/ET-mediated integration”)。

短語(yǔ)“gshA基因的表達(dá)被減弱”也可以表示該經(jīng)修飾的細(xì)菌含有可操作地連接到所述gshA基因的區(qū)域，包括控制基因表達(dá)的序列，如啟動(dòng)子，增強(qiáng) 子，弱化子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及其它表達(dá)控制元件，其經(jīng)修飾導(dǎo)致gshA基因的表達(dá)水平的降低；以及其它的例子(見(jiàn)，例如，WO95/34672；Carrier T.A.and Keasling J.D.,Biotechnol.Prog.,1999,15:58-64)。短語(yǔ)“可操作地連接到基因”可以表示調(diào)控區(qū)以允許核苷酸序列表達(dá)(例如，增強(qiáng)，增加，組成性，基礎(chǔ)，抗終止，減弱，失調(diào)(deregulated)，減少，或抑制的表達(dá))，特別地由核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物的表達(dá)的此類方式連接到核酸分子或基因的核苷酸序列。

短語(yǔ)“gshA基因的表達(dá)被減弱”也可以表示經(jīng)修飾的細(xì)菌中g(shù)shA基因的表達(dá)產(chǎn)物的量，如基因的mRNA的量或由基因編碼的γGCS蛋白的量，其中g(shù)shA基因的表達(dá)減弱，降低到例如未修飾的細(xì)菌中的量的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。

短語(yǔ)“細(xì)菌以減弱gshA基因的表達(dá)的方式進(jìn)行了修飾”也可以意指細(xì)菌以下述的方式進(jìn)行了修飾，從而與非修飾的細(xì)菌相比，在經(jīng)修飾的細(xì)菌中，gshA基因產(chǎn)物，如γGCS蛋白的總酶促活性是降低的?？梢孕揎椉?xì)菌，使得每個(gè)細(xì)胞的GCS蛋白活性降低到例如非修飾細(xì)菌中的量的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。

充當(dāng)參考用于以上比較的未修飾的細(xì)菌的例子可以包括屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的野生型菌株，如大腸桿菌MG1655菌株(ATCC 47076)和大腸桿菌W3110菌株(ATCC 27325)，或?qū)儆诜壕鷮俚募?xì)菌，如菠蘿泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)等。充當(dāng)參考用于以上比較的未修飾的細(xì)菌的例子也可以包括尚未修飾以減弱gshA基因的表達(dá)的親本菌株或gshA基因的表達(dá)沒(méi)有被減弱的細(xì)菌。

短語(yǔ)“γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶活性”可以表示催化以下反應(yīng)的酶促活性(EC編號(hào)：6.3.2.2)：其中ATP可以表示三磷酸腺苷而ADP可以表示二磷酸腺苷。

可以通過(guò)使用丙酮酸激酶-乳酸脫氫酶-偶聯(lián)的測(cè)定評(píng)價(jià)二磷酸腺苷(ADP)形成(Seelig G.F.and Meister A.,Glutathione biosynthesis；gamma-glutamylcysteine synthetase from rat kidney,Methods Enzymol.,1985；113:379-390)或使用L-α-[¹⁴C]氨基丁酸評(píng)價(jià)二肽形成(Griffith O.W.and Meister A.,Selective inhibition of gamma-glutamyl-cycle enzymes by substrate analogs, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74(8):3330-3334)確定γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶的酶促活性。也可以使用通過(guò)高效液相色譜法和電化學(xué)檢測(cè)對(duì)γ-谷氨酰半胱氨酸的直接測(cè)量(Gegg M.E.et al.,Determination of glutamate-cysteine ligase(gamma-glutamylcysteine synthetase)activity by high-performance liquid chromatography and electrochemical detection,Anal.Biochem.,2002,304(1):26-32)?？梢酝ㄟ^(guò)使用牛血清白蛋白作為標(biāo)注品的Bradford蛋白測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度(Bradford M.M.,Anal.Biochem.,1976,72:248-254)。

可以通過(guò)替換基因的表達(dá)控制序列，減弱ghsA基因的表達(dá)，如使用較弱的啟動(dòng)子替換染色體DNA上的啟動(dòng)子。通過(guò)RNA合成的起始作用的頻率確定啟動(dòng)子的強(qiáng)度。用于評(píng)價(jià)啟動(dòng)子和強(qiáng)啟動(dòng)子的強(qiáng)度的方法的例子描述于Goldstein M.A.et al.(Goldstein M.A.and Doi R.H.,Prokaryotic promoters in biotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1995,1:105-128)等。此外，也可能向基因的啟動(dòng)子區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代，從而修飾待弱化的啟動(dòng)子，如WO0018935 A1所公開(kāi)的。此外，已知取代Shine-Dalgarno(SD)序列中，和/或SD序列和起始密碼子之間的間隔區(qū)，和/或核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)中的起始密碼子直接上游或下游的序列中的幾個(gè)堿基極大地影響mRNA的翻譯效率。對(duì)這樣的區(qū)域的該修飾可以與降低gshA基因的轉(zhuǎn)錄組合。

也可以通過(guò)將轉(zhuǎn)座子或插入序列(IS)插入基因的編碼區(qū)(美國(guó)專利No.5,175,107)或控制基因表達(dá)的區(qū)域，或通過(guò)常規(guī)方法，如使用紫外線(UV)照射或亞硝基胍(N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍，NTG)誘變來(lái)減弱gshA基因的表達(dá)。此外，可以通過(guò)基于例如λRed/ET介導(dǎo)的重組的已知染色體編輯方法進(jìn)行位點(diǎn)特異性突變的摻入(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)。

可以測(cè)量gshA基因的拷貝數(shù)、存在或不存在，例如通過(guò)限制化處理染色體DNA，接著使用基于基因序列的探針的Southern印跡，熒光原位雜交(FISH)等進(jìn)行?？梢允褂枚喾N公知的方法，包括Northern印跡，定量RT-PCR等，通過(guò)測(cè)量從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量確定基因表達(dá)的水平?？梢酝ㄟ^(guò)已知的方法，包括SDS-PAGE，接著進(jìn)行免疫印跡測(cè)定(Western印跡分析)，或蛋白樣品的質(zhì)譜分析等，測(cè)量由基因編碼的蛋白的量。

用于操作重組DNA分子和分子克隆的方法，如制備質(zhì)粒DNA，消化，連接和轉(zhuǎn)化DNA，選擇寡核苷酸作為引物，摻入突變等可以是對(duì)于本領(lǐng)域的 技術(shù)人員公知的普通方法。這些方法描述于例如Sambrook J.,Fritsch E.F.and Maniatis T.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Green M.R.and Sambrook J.R.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)；Bernard R.Glick,Jack J.Pasternak and Cheryl L.Patten,“Molecular Biotechnology:principles and applications of recombinant DNA”,4th ed.,Washington,DC,ASM Press(2009)。

在腸肝菌科的屬，種或菌株之間DNA序列可能存在一些差異。因此，ghsA基因不限于SEQ ID NO:1中所示的基因，而可以包括作為SEQ ID NO:1的變體核苷酸序列并且編碼γGCS蛋白的基因。也就是說(shuō)，短語(yǔ)“ghsA基因”不限于SEQ ID NO:1中所示的ghsA基因，而可以正確地指代SEQ ID NO:1中所示的ghsA基因及其變體核苷酸序列。

相似地，短語(yǔ)“γGCS”或“γGCS蛋白”不限于SEQ ID NO:2中所示的γGCS蛋白，而可以正確地指代SEQ ID NO:2中所示的γGCS蛋白及其變體蛋白。

短語(yǔ)“變體蛋白”可以表示與SEQ ID NO:2相比序列中具有一個(gè)或多個(gè)突變的蛋白，不論它們是取代，缺失，插入和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基，但其仍然維持了與γGCS蛋白相似的活性或功能，如如上文所述的γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶活性，或相對(duì)于野生型蛋白，其三維結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著變化。變體蛋白中的變化數(shù)目取決于蛋白的三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸殘基的類型。其可以是但不嚴(yán)格限于，SEQ ID NO:2中的1至100個(gè)，在另一個(gè)例子中1至50個(gè)，在另一個(gè)例子中1至30個(gè)，在另一個(gè)例子中1至15個(gè)，在另一個(gè)例子中1至10個(gè)，和在另一個(gè)例子中1至5個(gè)。這是因?yàn)橐恍┌被岜舜司哂懈咄葱?，使得這些氨基酸之間的改變不影響蛋白的活性或功能，或通過(guò)這些氨基酸之間的變化，蛋白的三維結(jié)構(gòu)相對(duì)于野生型蛋白沒(méi)有顯著改變。因此，相對(duì)于SEQ ID NO:2中所示的完整氨基酸序列，由gshA基因編碼的變體蛋白可以具有不少于65％，不少于70％，不少于75％，不少于80％，不少于85％，不少于90％，不少于95％，不少于98％，或不少于99％的同源性，其在使用計(jì)算機(jī)程序BLAST時(shí)定義為參數(shù)“同一性”，只要維持了γGCS蛋白的活性或功能，或γGCS蛋白的三維結(jié)構(gòu)相對(duì)于野生型γGCS蛋白沒(méi)有顯著改變。

示例性的取代，缺失，插入，和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基可以是保守突變。代表性的保守突變?yōu)楸Ｊ厝〈?。保守取代可以是但不限于取代，其中如果取代位點(diǎn)是芳香族氨基酸，那么取代在Phe、Trp、Tyr之間相互發(fā)生；如果取代位點(diǎn)是疏水氨基酸，那么在Ala、Leu、Ile、Val之間相互發(fā)生；如果取代位點(diǎn)是親水性氨基酸，在Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、His和Thr之間相互發(fā)生；如果取代位點(diǎn)是極性氨基酸，在Gln和Asn之間相互發(fā)生；如果取代位點(diǎn)是堿性氨基酸，在Lys、Arg和His相互發(fā)生；如果取代位點(diǎn)是酸性氨基酸，在Asp和Glu之間相互發(fā)生；如果取代位點(diǎn)是具有羥基的氨基酸，在Ser和Thr之間相互發(fā)生。保守取代的例子包括Ser或Thr取代Ala；Gln,His或Lys取代Arg；Glu,Gln,Lys,His或Asp取代Asn；Asn,Glu或Gln取代Asp；Ser或Ala取代Cys；Asn,Glu,Lys,His,Asp或Arg取代Gln；Asn,Gln,Lys或Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn,Lys,Gln,Arg或Tyr取代His；Leu,Met,Val或Phe取代Ile；Ile,Met,Val或Phe取代Leu；Asn,Glu,Gln,His或Arg取代Lys；Ile,Leu,Val或Phe取代Met；Trp,Tyr,Met,Ile或Leu取代Phe；Thr或Ala取代Ser；Ser或Ala取代Thr；Phe或Tyr取代Trp；His,Phe或Trp取代Tyr；和Met,Ile或Leu取代Val。

示例性的取代，缺失，插入，和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基也可以是非保守突變，只要該突變被氨基酸序列中的不同位置的一個(gè)或多個(gè)二次突變(secondary mutation)補(bǔ)償，使得活性或功能與γGCS蛋白的活性或功能相似，諸如維持了如上文所述的γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶的活性，或γGCS蛋白的三維結(jié)構(gòu)相對(duì)于野生型γGCS蛋白沒(méi)有顯著變化。

為了評(píng)估蛋白或DNA同源性的程度，可以使用幾種計(jì)算方法，如BLAST搜索，F(xiàn)ASTA搜索和ClustalW方法。BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索是由blastp,blastn,blastx,megablast,tblastn,和tblastx程序采用的啟發(fā)式搜索算法(heuristic search algorithm)；這些程序使用Karlin S.和Altschul S.F.的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:2264-2268；Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877)，將顯著性歸于它們的發(fā)現(xiàn)。計(jì)算機(jī)程序BLAST計(jì)算三個(gè)參數(shù)：得分，同一性和相似性。FASTA搜索方法由Pearson W.R.描述(Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA,Methods Enzymol.,1990,183:63-98)。ClustalW方法由Thompson J.D.等人描述(CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weightmatrix choice,Nucleic Acids Res.,1994,22:4673-4680)。

SEQ ID NO:2所示的γGCS蛋白的變體蛋白的例子包括來(lái)自腸肝菌科的不同細(xì)菌的γGCS的蛋白同源物(γGCS同源物)。也就是說(shuō)，來(lái)自腸桿菌科的不同細(xì)菌的γGCS同源物是已知的，其具有如上文所述的γ-谷氨酸-半胱氨酸連接酶活性。來(lái)自屬于腸桿菌科的細(xì)菌的這些γGCS同源物的例子描述于下文(表1)，其中指出了同源性值(作為“同一性”，其為氨基酸的同一性)，分類數(shù)據(jù)，和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的氨基酸序列的登記號(hào)和序列記錄號(hào)(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)。

表1

*-在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(National Center for Biotechnology Information,www.ncbi.nlm.nih.gov/)中

gshA基因可以是編碼γGCS蛋白的任意基因。例如，gshA基因可以是變體核苷酸序列。短語(yǔ)“變體核苷酸序列”可以表示下述核苷酸序列，其編碼如上文所述的“變體蛋白”，或編碼任意野生型γGCS蛋白的核苷酸序列，例如SEQ ID NO:2中所示的γGCS蛋白，使用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼表的任意同義氨基酸密碼子(見(jiàn)例如Lewin B.,“Genes VIII”,2004,Pearson Education,Inc.,Upper Saddle River,NJ 07458)。因此，gshA基因可以是由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性所致的變體核苷酸序列，例如由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性所致的SEQ ID NO:1的變體核苷酸序列。

短語(yǔ)“變體核苷酸序列”也可以表示但不限于在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1中所示的序列互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，或可以在嚴(yán)格條件下從核苷酸序列制備的探針，只要其編碼功能性蛋白質(zhì)?！皣?yán)格條件”包括在如下那些條件，在該條件下形成特異性雜交體，例如具有不低于60％，不低于65％，不低于70％，不低于75％，不低于80％，不低于85％，不低于90％，不低于95％，不低于96％，不低于97％，不低于98％，或不低于99％的同源性(當(dāng)使用計(jì)算機(jī)程序BLAST時(shí)定義為參數(shù)“同一性”)的雜交體，而不形成非特異性雜交體，例如具有低于上文的同源性的雜交體。例如，嚴(yán)格條件可以通過(guò)以鹽濃度為1xSSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉或標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉)，0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)，或在另一個(gè)例子中，0.1xSSC，0.1％SDS在60℃或65℃洗滌一次或多次，或在另一個(gè)例子中，兩次或三次例示。洗滌的持續(xù)時(shí)間依賴于用于印跡的膜類型，且一般來(lái)說(shuō)，可以是制造商所推薦的。例如，對(duì)于Amersham Hybond^TM-N+帶正電荷的尼龍膜(GE Healthcare)，在嚴(yán)格條件下推薦的洗滌持續(xù)時(shí)間是15分鐘。該洗滌步驟可以進(jìn)行2至3次。作為探針，也可以使用與SEQ ID NO:1中所示序列互補(bǔ)的序列的一部分?？梢允褂霉押塑账嶙鳛榛赟EQ ID NO:1中所示的序列制備的引物和含有核苷酸序列的DNA片段作為模版通過(guò)PCR產(chǎn)生此類探針。探針的長(zhǎng)度推薦為>50bp，其可以基于雜交條件適當(dāng)?shù)剡x擇，并通常為100bp至1kbp。例如，當(dāng)具有約300bp長(zhǎng)度的DNA片段作為探針使用時(shí)，雜交后的洗滌條件可以以2xSSC，0.1％SDS在50℃，60℃或65℃例示。

由于已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌物種的γGCS蛋白的基因(見(jiàn)上文)，可以如下獲得編碼γGCS蛋白的變體核苷酸序列，即利用基于gshA基因的核苷酸序列制備的引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；參考White T.J.et al.,The polymerase chain reaction,Trends Genet.,1989,5:185-189)；或者通過(guò)體外處理含有野生型gshA基因的DNA進(jìn)行的定點(diǎn)誘變法(例如使用羥胺)，或用于處理微生物(例如含有野生型gshA基因的屬于腸桿菌科的細(xì)菌)的方法，例如用紫外線(UV)照射或誘變劑進(jìn)行，如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和通常用于此類處理的亞硝酸；或以全長(zhǎng)基因結(jié)構(gòu)化學(xué)合成。也就是說(shuō)，可以由此獲得編碼腸桿菌科的其它細(xì)菌的γGCS蛋白的基因。

短語(yǔ)“野生型蛋白”可以表示由腸桿菌科的野生型或親本細(xì)菌菌株，例如由野生型大腸桿菌MG1655菌株天然產(chǎn)生的天然蛋白。野生型蛋白可以由“野生型基因”編碼，其可以存在于野生型細(xì)菌的基因組中。

以上關(guān)于基因和蛋白質(zhì)的變體的描述也可以在作必要的變更后應(yīng)用于任意的蛋白質(zhì)，如L-氨基酸生物合成酶和編碼它們的基因。

除了已經(jīng)提到的特性外，在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下，細(xì)菌可以具有其它特定的特性，如各種營(yíng)養(yǎng)需求，耐藥性，藥物敏感性和藥物依賴性。

2.方法

本發(fā)明的方法包括用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法，如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-甲硫氨酸，L-鳥(niǎo)氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-纈氨酸，或其混合物。特別地，本發(fā)明的方法包括用于產(chǎn)生支鏈L-氨基酸的方法，如L-異亮氨酸，L-亮氨酸，和L-纈氨酸，或其混合物。更特別地， 本發(fā)明的方法包括用于產(chǎn)生L-纈氨酸的方法。

用于產(chǎn)生L-氨基酸的方法可以包括下述步驟：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如本文所述的細(xì)菌以允許L-氨基酸產(chǎn)生，分泌，和/或在培養(yǎng)基中或在細(xì)菌細(xì)胞中，或兩者中積累，以及從培養(yǎng)基和/或細(xì)菌細(xì)胞中收集L-氨基酸。收集的氨基酸可以進(jìn)一步純化。該目標(biāo)L-氨基酸可以以游離形式，鹽形式，或其水合形式，或其與另一個(gè)有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物的加合物形式，或其組合產(chǎn)生。也就是說(shuō)，短語(yǔ)“L-氨基酸”可以指代以游離形式的L-氨基酸，其鹽形式，其水合物形式，其加合物形式，或其混合物。另外，短語(yǔ)“L-氨基酸”可以特別指代游離形式的氨基酸，其鹽形式，或其混合物。例如，可以通過(guò)該方法產(chǎn)生L-氨基酸的銨，鈉，鉀等鹽或內(nèi)鹽，如兩性離子。這是可能的，因?yàn)榘被峥梢栽诎l(fā)酵條件下在典型的酸-堿中和反應(yīng)中相互反應(yīng)或與中和劑，如無(wú)機(jī)或有機(jī)酸性或堿性物質(zhì)反應(yīng)以形成鹽，這是氨基酸的化學(xué)特征，其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。特別地，可以通過(guò)該方法產(chǎn)生L-氨基酸的單鹽酸鹽(monochlorhydrate salt)，如L-賴氨酸的單鹽酸鹽(L-賴氨酸-HCl)或L-精氨酸的單鹽酸鹽(L-精氨酸-HCl)；或通過(guò)該方法可以產(chǎn)生L-氨基酸的單水合單鹽酸鹽(monochlorhydrate salt monohydrate)，如L-組氨酸的單水合單鹽酸鹽(L-組氨酸-HCl·H₂O)。

細(xì)菌的培養(yǎng)和L-氨基酸的收集和純化可以以與常規(guī)發(fā)酵方法相似的方式進(jìn)行，其中使用微生物產(chǎn)生L-氨基酸。用于產(chǎn)生L-氨基酸的培養(yǎng)基可以是合成的或天然的培養(yǎng)基，如含有碳源，氮源，硫源，磷源，無(wú)機(jī)離子，和需要的其它有機(jī)和無(wú)機(jī)組分的典型培養(yǎng)基。作為碳源，可以使用糖類，如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖，麥芽糖，木糖，海藻糖，核糖，蔗糖和淀粉水解物；醇，如乙醇，甘油，甘露糖醇，山梨糖醇；有機(jī)酸，如葡糖酸，富馬酸，檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸；脂肪酸等。作為氮源，可以使用無(wú)機(jī)銨鹽，如硫酸銨，氯化銨和磷酸銨；有機(jī)氮，如大豆水解產(chǎn)物(soy bean hydrolyzates)；氨氣；氨水等。此外，也可以利用蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麥芽提取物，玉米漿等等。硫源可以包括硫酸銨，硫酸鎂，硫酸亞鐵，硫酸錳等。除了碳源，氮源，和硫源外，培養(yǎng)基可以含有磷源。作為磷源，可以利用磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸聚合物(phosphate polymer)，如焦磷酸等。維生素，如維生素B1，維生素B2，維生素B6，煙酸(nicotinic acid)，煙酰胺(nicotinamide)和維生素B12；需要的物質(zhì)，例如，有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，如核 酸，如腺嘌呤和RNA，氨基酸，蛋白胨，酪蛋白水解物或酵母提取物等可以以適當(dāng)量(即便是痕量)存在。除了這些，如果必要的話，可以添加少量的磷酸鈣，鐵離子，錳離子等。

可以在需氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，持續(xù)16至72小時(shí)，或16至65小時(shí)；培養(yǎng)期間的培養(yǎng)溫度可以控制在30至45℃，或30至37℃內(nèi)；且pH可以調(diào)節(jié)在5和8之間，或6.0和7.5之間?？梢酝ㄟ^(guò)使用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸性或堿性物質(zhì)，以及氨氣調(diào)節(jié)pH。

在培養(yǎng)后，可以從培養(yǎng)基中收集目標(biāo)L-氨基酸。還有，在培養(yǎng)后，可以用例如超聲波等破壞細(xì)胞，可以通過(guò)例如離心或膜過(guò)濾除去固體，如細(xì)胞和經(jīng)細(xì)胞破環(huán)的懸液(cell-disrupted suspension)(也稱為細(xì)胞碎片)獲得上清液，然后，可以從上清液收集目標(biāo)L-氨基酸?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)(如濃縮，離子交換層析，和結(jié)晶)的任意組合進(jìn)行從培養(yǎng)基或上清液等收集L-氨基酸。

除了目標(biāo)L-氨基酸外，收集的目標(biāo)L-氨基酸組合物可以含有微生物細(xì)胞，培養(yǎng)基組分，水分(moisture)，以及微生物的副產(chǎn)物代謝物。收集的目標(biāo)L-氨基酸的純度可以是50％或更高，優(yōu)選85％或更高，特別優(yōu)選95％或更高(美國(guó)專利No.5,431,933,日本專利No.1214636,美國(guó)專利Nos.4,956,471,4,777,051,4,946,654,5,840,358,6,238,714,美國(guó)專利公布申請(qǐng)No.2005/0025878)。

實(shí)施例

本發(fā)明將參考以下非限制性實(shí)施例來(lái)更具體解釋。

實(shí)施例1：具有失活的gshA基因的大腸桿菌菌株的構(gòu)建

1.1大腸桿菌MG1655ΔgshA菌株的構(gòu)建

通過(guò)最初由Datsenko K.A.和Wanner B.L.開(kāi)發(fā)的，稱為“λRed/ET介導(dǎo)的整合”的方法(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)構(gòu)建了具有失活的gshA基因的大腸桿菌菌株。根據(jù)該方法，構(gòu)建了PCR引物P1(SEQ ID NO:3)和P2(SEQ ID NO:4)，其每一個(gè)在任一端與鄰接gshA基因的區(qū)域同源，并在另一端與模板質(zhì)粒中鄰接賦予氯霉素抗性(Cm^R)的cat基因的區(qū)域同源。質(zhì)粒pMIV-5JS(JP2008-99668,EP1942183 A1)用作模板。PCR的條件如下：95℃變性3分鐘；最初2個(gè)循環(huán)的概況(profile)：95℃1分鐘，34℃30秒，72℃1分鐘；最后30個(gè)循環(huán)的概況：95℃30秒， 50℃30秒，72℃1分鐘；最后的延伸：72℃5分鐘。

通過(guò)瓊脂糖中的電泳純化獲得的PCR產(chǎn)物1(SEQ ID NO:5；1,378bp),并用于電穿孔含有具有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌M1655菌株。該pKD46質(zhì)粒(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)包括噬菌體λ的2,154個(gè)核苷酸的DNA片段(核苷酸位置從31088至33241；GenBank,accession No.J02459)，并從而含有在阿拉伯糖誘導(dǎo)型P_araB啟動(dòng)子控制下的λRed同源重組系統(tǒng)的基因(γ、β、和exo基因)。pKD46質(zhì)粒對(duì)于PCR產(chǎn)物整合到大腸桿菌M1655菌株(ATCC 47076)的染色體中是必要的。含有pKD46質(zhì)粒的大腸桿菌M1655菌株可以從大腸桿菌Genetic Stock Center,Yale University,New Haven,USA獲得(Accession No.CGSC7669)。

電感受態(tài)細(xì)胞如下制備：大腸桿菌MG1655/pKD46在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani肉湯(broth)，也稱為溶源性肉湯(lysogenic broth)；Sambrook J.and Russell D.W.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3^rd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中在30℃培養(yǎng)過(guò)夜；接著，使用5mL含有氨芐青霉素(100mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的SOB培養(yǎng)基(Sambrook J.,Fritsch E.F.and Maniatis T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2^nd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)將培養(yǎng)物稀釋100倍。稀釋的培養(yǎng)物在30℃通氣(250rpm)培養(yǎng)至OD₆₀₀為約0.6，接著，通過(guò)濃縮100倍并使用冰冷的去離子H₂O洗滌三次變?yōu)殡姼惺軕B(tài)。使用70μL細(xì)胞和約100ng的PCR產(chǎn)物1進(jìn)行電穿孔。使用1mL的SOC培養(yǎng)基(Sambrook J.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2^nd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)在30℃孵育電穿孔的細(xì)胞2.5小時(shí)，放置到含有溶源性肉湯(Sambrook J.and Russell D.W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)，瓊脂(1.5％)和氯霉素(10mg/L)的平板上，并在37℃培養(yǎng)以選擇Cm^R-重組體。為了消除pKD46質(zhì)粒，在42℃在補(bǔ)充有氯霉素(10mg/L)的L-瓊脂上進(jìn)行了兩次傳代，且對(duì)獲得的菌落測(cè)試對(duì)氨芐青霉素的敏感性。由此，獲得了具有Cm^R-標(biāo)志物的大腸桿菌MG1655ΔgshA菌株，其也稱為大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株。

1.2.gsh基因缺失的確認(rèn)

通過(guò)PCR確認(rèn)了突變體大腸桿菌MG1655ΔgshA菌株中用氯霉素抗性基因(cat)標(biāo)記的gshA基因缺失?；蜃禺愋砸颬3(SEQ ID NO:6)和P4(SEQ ID NO:7)用于確認(rèn)。PCR的條件如下：94℃變性3分鐘；30個(gè)循環(huán)的概括(profile)：94℃30秒，58℃30秒，72℃2分鐘；最終延伸：72℃6分鐘。使用來(lái)自具有天然gshA基因的親本菌株大腸桿菌MG1655的染色體DNA作為模板的反應(yīng)中獲得的PCR產(chǎn)物2的長(zhǎng)度為2,155bp(SEQ ID NO:8)。使用來(lái)自突變體菌株大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R的染色體DNA作為模板的反應(yīng)中獲得的PCR產(chǎn)物3長(zhǎng)度為1,858bp(SEQ ID NO:9)。

實(shí)施例2：具有失活的gshA基因的產(chǎn)L-纈氨酸的大腸桿菌菌株的構(gòu)建

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-纈氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株(實(shí)施例1.1)的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)纈氨酸的大腸桿菌H81菌株(Miller J.H.,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab.Press,Plainview,NY,1972)以獲得大腸桿菌H81ΔgshA::Cm^R菌株。H81菌株(EP1239041A2)在2001年1月30日以保藏號(hào)VKPM B-8066保藏于俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄羅斯，郵政編碼117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))，然后其于2002年2月1日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物。在含有溶源性肉湯，瓊脂(1.5％)和氯霉素(10mg/L)的平板上選擇具有失活的gshA基因的大腸桿菌H81菌株。如此，獲得了大腸桿菌H81ΔgshA::Cm^R菌株。如實(shí)施例1.2中所述通過(guò)PCR確認(rèn)了使用氯霉素抗性基因標(biāo)記的gshA基因的缺失。

實(shí)施例3：通過(guò)大腸桿菌H81ΔgshA::Cm^R菌株的L-纈氨酸的生產(chǎn)

將經(jīng)修飾的大腸桿菌H81ΔgshA::Cm^R和對(duì)照大腸桿菌H81菌株分別在2mL LB培養(yǎng)基中在34℃培養(yǎng)18小時(shí)。然后，將0.2mL獲得的培養(yǎng)物每個(gè)接種到20×200-mm試管中的2mL發(fā)酵培養(yǎng)基中并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上(250rpm)在34℃培養(yǎng)72小時(shí)直到葡萄糖消耗。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組分(g/L)如下：

發(fā)酵培養(yǎng)基在116℃滅菌30分鐘。葡萄糖和CaCO₃如下單獨(dú)滅菌：葡萄糖在110℃滅菌30分鐘而CaCO₃在116℃滅菌30分鐘。在滅菌前通過(guò)添加6M KOH將pH調(diào)節(jié)到7.0。

培養(yǎng)后，通過(guò)薄層色譜法(TLC)確定培養(yǎng)基中積累的L-纈氨酸的量。使用沒(méi)有熒光指示劑的Merck硅膠60包被的10×20-cm TLC平板(Merck,Darmstadt,Germany)。使用Camag Linomat 5樣品敷料器(applicator)將樣品應(yīng)用到平板。Merck平板使用流動(dòng)相顯色，所述流動(dòng)相由丙-2-醇:乙酸乙酯:25％氨水:水＝16:16:5:10(v/v)組成。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可視化試劑(visualizing reagent)。顯色后，將平板干燥并使用Camag TLC Scanner 3以吸光度模式掃描，其中使用winCATS軟件(版本1.4.2)在520nm檢測(cè)。

四次獨(dú)立的試管發(fā)酵的結(jié)果(作為平均值)示于表2。如可以從表2中看到，與親本大腸桿菌H81菌株相比，經(jīng)修飾的大腸桿菌H81ΔgshA::Cm^R菌株能夠產(chǎn)生更高量(g/L)的L-纈氨酸(Val)。表2還示出了與親本大腸桿菌H81菌株相比，經(jīng)修飾的大腸桿菌H81ΔgshA::Cm^R菌株能夠以更高的產(chǎn)率(％，相對(duì)于消耗的葡萄糖)產(chǎn)生L-纈氨酸。

表2

實(shí)施例4：通過(guò)大腸桿菌382ΔgshA菌株的L-精氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-精氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)精氨酸的大腸桿菌382菌株以獲得大腸桿菌382ΔgshA。382菌株在2000年4月10日以保藏號(hào)VKPM B-7926保藏于俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄羅斯，郵政編碼117545，莫斯科(Russian Federation, 117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))，然后其于2001年5月18日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物。

將大腸桿菌382和382ΔgshA菌株分別在3mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中在37℃振蕩(220rpm)培養(yǎng)18小時(shí)。然后，將0.3mL獲得的培養(yǎng)物每個(gè)接種到20×200-mm試管中的2mL發(fā)酵培養(yǎng)基中并在旋轉(zhuǎn)振蕩器(220rpm)上在32℃培養(yǎng)48小時(shí)。

培養(yǎng)后，通過(guò)紙色譜法使用由正丁醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)組成的流動(dòng)相確定培養(yǎng)基中積累的L-精氨酸的量。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可視化試劑。將含有L-精氨酸的點(diǎn)切出，使用CdCl₂的0.5％水溶液洗脫L-精氨酸，且L-精氨酸的量在540nm用分光光度法測(cè)定。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組分(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸鎂單獨(dú)滅菌。CaCO₃在180℃干熱滅菌2小時(shí)。將pH調(diào)節(jié)到7.0。

實(shí)施例5：通過(guò)大腸桿菌382ΔargGΔgshA的L-瓜氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-瓜氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)瓜氨酸的大腸桿菌382ΔargG菌株以獲得大腸桿菌382ΔargGΔgshA。382ΔargG菌株是通過(guò)在產(chǎn)精氨酸的大腸桿菌382菌株(VKPM B-7926,EP1170358 A1)的染色體上刪除argG基因獲得的，通過(guò)最初由Datsenko K.A.和Wanner B.L.開(kāi)發(fā)的稱為“λRed/ET介導(dǎo)的整合”的方法(Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)得到。根據(jù)這一方法，構(gòu)建了PCR引物，其每一個(gè)與argG基因臨近的區(qū)域且與模板質(zhì)粒中賦予抗生素抗性的基因臨近的區(qū)域兩者同源。質(zhì)粒pMW118-λattL-cat-λattR(WO05/010175)在PCR 中用作模板。

將大腸桿菌382ΔargG和382ΔargGΔgshA菌株分別在3mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中在37℃振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。然后將0.3mL獲得的培養(yǎng)物每個(gè)接種到20×200-mm試管中的2mL發(fā)酵培養(yǎng)基中并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上在32℃培養(yǎng)48小時(shí)。

培養(yǎng)后，通過(guò)紙色譜法使用由正丁醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)組成的流動(dòng)相確定培養(yǎng)基中積累的L-瓜氨酸的量。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可視化試劑。將含有L-瓜氨酸的點(diǎn)切出，使用CdCl₂的0.5％水溶液洗脫L-瓜氨酸，且L-瓜氨酸的量在540nm用分光光度法測(cè)定。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組分(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸鎂單獨(dú)滅菌。CaCO₃在180℃干熱滅菌2小時(shí)。將pH調(diào)節(jié)到7.0。

實(shí)施例6.通過(guò)大腸桿菌JM15(ydeD)ΔgshA的L-半胱氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-半胱氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)半胱氨酸的大腸桿菌JM15(ydeD)菌株以獲得大腸桿菌JM15(ydeD)ΔgshA菌株。JM15(ydeD)菌株是大腸桿菌JM15(美國(guó)專利No.6,218,168 B1)的衍生物，其已經(jīng)使用含有ydeD基因的DNA轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利No.5,972,663)。ydeD基因編碼一種膜蛋白，且其不參與任意L-氨基酸的生物合成途徑。

用于評(píng)價(jià)L-半胱氨酸生產(chǎn)的發(fā)酵條件和方案詳細(xì)描述于美國(guó)專利No.6,218,168 B1的實(shí)施例6中。

實(shí)施例7：通過(guò)大腸桿菌VL334thrC⁺ΔgshA的L-谷氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-谷氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌 MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)谷氨酸的大腸桿菌VL334thrC⁺菌株(EP1172433 A1)以獲得大腸桿菌VL334thrC⁺ΔgshA菌株。VL334thrC⁺菌株在2004年12月6日以保藏號(hào)VKPMB-8961保藏于俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄羅斯，郵政編碼117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^stDorozhny proezd,1))，然后其于2004年12月8日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物。

將大腸桿菌VL334thrC⁺和VL334thrC⁺ΔgshA菌株分別在L-瓊脂平板上在37℃培養(yǎng)18-24個(gè)小時(shí)。然后，將一環(huán)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有2mL發(fā)酵培養(yǎng)基的20×200-mm試管中。在30℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)3天。

培養(yǎng)后，通過(guò)紙色譜法使用由丁-1-醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)組成的流動(dòng)相確定培養(yǎng)基中積累的L-谷氨酸的量，接著通過(guò)茚三酮(丙酮中的1％溶液)染色，在具有0.5％CdCl₂的50％乙醇中洗脫L-谷氨酸，并在540nm進(jìn)一步評(píng)估L-谷氨酸的量。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組分(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸鎂單獨(dú)滅菌。將pH調(diào)節(jié)到7.2。

實(shí)施例8：通過(guò)大腸桿菌MG1655+hisG^rhisL'_ΔΔpurRΔgshA的L-組氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-組氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段使用P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)組氨酸的大腸桿菌MG1655+hisG^rhisL'_ΔΔpurR菌株以獲得大腸桿菌MG1655+hisG^rhisL'_Δ ΔpurRΔgshA菌株。MG1655+hisG^rhisL'_Δ ΔpurR菌株描述于RU2119536 C1和Doroshenko V.G.et al.,The directed modification of Escherichia coli MG1655to obtain histidine-producing mutants,Prikl.Biochim. Mikrobiol.(Russian),2013,49(2):149-154。

將大腸桿菌MG1655+hisG^rhisL'_Δ ΔpurR和MG1655+hisG^rhisL'_Δ ΔpurRΔgshA菌株分別在2mL L-肉湯(L-broth)中在30℃培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)(Sambrook J.and Russell D.W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)。然后，將0.1mL獲得的培養(yǎng)物每個(gè)接種到20×200-mm試管中的2mL發(fā)酵培養(yǎng)基中并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上(250rpm)在30℃培養(yǎng)65小時(shí)。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)如下：

Mameno*是大豆粉水解物(soybean meal hydrolysate)(Ajinomoto Co,Inc.)。

葡萄糖，硫酸鎂，甜菜堿和CaCO₃單獨(dú)滅菌。滅菌前通過(guò)6M KOH溶液將pH調(diào)節(jié)到6.0。

培養(yǎng)后，通過(guò)薄層色譜法(TLC)確定在培養(yǎng)基中積累的L-組氨酸的量。使用含非熒光指示劑的Sorbfil硅膠(Stock Company Sorbpolymer,Krasnodar,Russian Federation)的0.11-mm層包被的10×15-cm TLC平板。該Sorbfil平板使用流動(dòng)相顯色，所述流動(dòng)相由丙-2-醇:丙酮:25％氨水:水＝6:6:1.5:1(v/v)組成。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可視化試劑。顯色后，將平板干燥并使用 Camag TLC Scanner 3以吸光度模式掃描，其中使用winCATS軟件(版本1.4.2)在520nm檢測(cè)。

實(shí)施例9：通過(guò)大腸桿菌57ΔgshA的L-亮氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-亮氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)亮氨酸的大腸桿菌57菌株(VKPM B-7386,美國(guó)專利No.6,124,121)以獲得大腸桿菌57ΔgshA菌株。該57菌株在1997年5月19日以保藏號(hào)VKPM B-7386保藏于俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄羅斯，郵政編碼117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^stDorozhny proezd,1))。

將大腸桿菌57和57ΔgshA菌株分別在L-瓊脂平板上在37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。為了獲得種子培養(yǎng)物，將菌株各自在旋轉(zhuǎn)振蕩器(250rpm)上在含有2mL補(bǔ)充有蔗糖(4％)的L-肉湯(Sambrook J.and Russell D.W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)的20×200-mm試管中在32℃培養(yǎng)18小時(shí)。接著，使用0.2mL種子培養(yǎng)物(10％)接種發(fā)酵培養(yǎng)基。在20×200-mm試管中在2mL的基本發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。在32℃在以250rpm振蕩的情況下培養(yǎng)細(xì)胞48-72小時(shí)。

培養(yǎng)后，通過(guò)紙色譜法使用由丁-1-醇(butan-1-ol):乙酸:水＝4:1:1(v/v)組成的流動(dòng)相確定培養(yǎng)基中積累的L-亮氨酸的量。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)如下：

葡萄糖單獨(dú)滅菌。CaCO₃在180℃干熱滅菌2小時(shí)。將pH調(diào)節(jié)到7.2。實(shí)施例10：通過(guò)大腸桿菌AJ11442ΔgshA的L-賴氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)賴氨酸的大腸桿菌AJ11442菌株以獲得大腸桿菌AJ11442ΔgshA菌株。該AJ11442 菌株在1981年5月1日以保藏號(hào)FERM P-5084保藏于生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所，工業(yè)和科學(xué)技術(shù)機(jī)構(gòu)(National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology)(目前,NITE IPOD,日本，292-0818，千葉縣(#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan))，然后其于1987年10月29日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物，指定保藏號(hào)FERM BP-1543。

將大腸桿菌AJ11442和AJ11442ΔgshA菌株分別在含有鏈霉素(20mg/L)的L-培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)。接著，將0.3mL獲得的培養(yǎng)物各自接種到500-mL燒瓶中20mL含有所需藥物的發(fā)酵培養(yǎng)基中。通過(guò)使用往復(fù)振蕩器(reciprocal shaker)以115rpm的攪拌速度在37℃進(jìn)行培養(yǎng)16小時(shí)。

培養(yǎng)后，通過(guò)已知的方法(Biotech-analyzer AS210,Sakura Seiki Co.)確定培養(yǎng)基中積累的L-賴氨酸和殘留的葡萄糖的量。接著，對(duì)于每個(gè)菌株，相對(duì)于消耗的葡萄糖計(jì)算L-賴氨酸的產(chǎn)率。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)如下：

通過(guò)KOH將pH調(diào)節(jié)至7.0，且該培養(yǎng)基在115℃高壓蒸汽處理10分鐘。葡萄糖和硫酸鎂單獨(dú)滅菌。CaCO₃在180℃干熱滅菌2小時(shí)并添加到培養(yǎng)基至終濃度為30g/L。

實(shí)施例11.通過(guò)大腸桿菌382ΔargFΔargI,ΔgshA的L-鳥(niǎo)氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)鳥(niǎo)氨酸的大腸桿菌382ΔargFΔargI菌株以獲得大腸桿菌382ΔargFΔargI,ΔgshA菌株。382ΔargFΔargI菌株是通過(guò)產(chǎn)精氨酸的大腸桿菌382菌株(VKPM B-7926,EP1170358 A1)染色體上的argF和argI基因的連續(xù)缺失得到的，通過(guò)最初由Datsenko K.A.和Wanner B.L.開(kāi)發(fā)的稱為“λRed/ET介導(dǎo)的整合”的方法 (Datsenko K.A.and Wanner B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(12):6640-6645)得到。根據(jù)這一方法，構(gòu)建了與argF或argI基因臨近的兩個(gè)區(qū)域同源的兩對(duì)PCR產(chǎn)物，以及模板質(zhì)粒中賦予抗生素抗性的基因。質(zhì)粒pMW118-λattL-cat-λattR(WO05/010175)在PCR中用作模板。

將大腸桿菌382ΔargFΔargI和382ΔargFΔargI,ΔgshA菌株分別在3mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中在37℃振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。接著，將0.3mL獲得的培養(yǎng)物各自接種到20×200-mm試管中的2mL發(fā)酵培養(yǎng)基中并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上在32℃培養(yǎng)48小時(shí)。

培養(yǎng)后，通過(guò)紙色譜法使用由丁-1-醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)組成的流動(dòng)相確定培養(yǎng)基中積累的L-鳥(niǎo)氨酸的量。丙酮中的茚三酮溶液(2％,w/v)用作可視化試劑。將含有L-鳥(niǎo)氨酸的點(diǎn)切出，使用CdCl₂的0.5％水溶液洗脫L-鳥(niǎo)氨酸，且L-鳥(niǎo)氨酸的量在540nm用分光光度法評(píng)估。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組分(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸鎂單獨(dú)滅菌。CaCO₃在180℃干熱滅菌2小時(shí)。將pH調(diào)節(jié)到7.0。

實(shí)施例12：通過(guò)大腸桿菌AJ12739ΔgshA的L-苯丙氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-苯丙氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)苯丙氨酸的大腸桿菌AJ12739菌株以獲得AJ12739ΔgshA菌株。AJ12739菌株在2001年11月6日以保藏號(hào)VKPM B-8197保藏于俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄羅斯，郵政編碼117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))，然后，其于2002年8月 23日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物。

將大腸桿菌AJ12739和AJ12739ΔgshA菌株分別在營(yíng)養(yǎng)肉湯中在37℃培養(yǎng)18小時(shí)。接著，將0.3mL獲得的培養(yǎng)物各自接種到20×200-mm試管中的3mL發(fā)酵培養(yǎng)基中并在37℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。

培養(yǎng)后，通過(guò)薄層色譜法(TLC)確定在培養(yǎng)基中積累的L-苯丙氨酸的量。使用含非熒光指示劑的Sorbfil硅膠(Stock Company Sorbpolymer,Krasnodar,Russian Federation)的0.11-mm層包被的10×15-cm TLC平板。該Sorbfil平板使用流動(dòng)相顯色，所述流動(dòng)相由丙-2-醇:乙酸乙酯:25％氨水:水＝40:40:7:16(v/v)組成。丙酮中的茚三酮溶液(2％)用作可視化試劑。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組分(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸鎂單獨(dú)滅菌。CaCO₃在180℃干熱滅菌2小時(shí)。將pH調(diào)節(jié)到7.0。

實(shí)施例13：通過(guò)大腸桿菌702ilvAΔgshA的L-脯氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-脯氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)脯氨酸的大腸桿菌702ilvA菌株以獲得大腸桿菌702ilvAΔgshA菌株。702ilvA菌株在2000年7月18日以保藏號(hào)VKPM B-8012保藏于俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄羅斯，郵政編碼117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))，然后其于2001年5月18日依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏物。

將大腸桿菌702ilvA和702ilvAΔgshA菌株分別在L-瓊脂平板上在37℃ 培養(yǎng)18-24小時(shí)。接著，這些菌株各自在與實(shí)施例7(L-谷氨酸的生產(chǎn))相同的條件下培養(yǎng)。

實(shí)施例14：通過(guò)大腸桿菌B-3996ΔgshA的L-蘇氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-蘇氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)蘇氨酸的大腸桿菌VKPM B-3996菌株以獲得大腸桿菌B-3996ΔgshA菌株。VKPM B-3996菌株在1987年11月19日以保藏號(hào)RIA 1867保藏于All-Union Scientific Center of Antibiotics(Russian Federation,117105Moscow,Nagatinskaya Street,3-A)。該菌株也于2002年12月19日以保藏號(hào)VKPM B-3996保藏于俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；FGUP GosNII Genetika,俄羅斯，郵政編碼117545，莫斯科(Russian Federation,117545Moscow,1^st Dorozhny proezd,1))。

將大腸桿菌VKPM B-3996和B-3996ΔgshA菌株分別在L-瓊脂平板上在37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。為了獲得種子培養(yǎng)物，菌株各自在旋轉(zhuǎn)振蕩器上(250rpm)在含有2mL補(bǔ)充有蔗糖(4％)的L-肉湯(Sambrook J.and Russell D.W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3^rd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)的20×200-mm試管中在32℃培養(yǎng)18小時(shí)。接著，使用0.2mL(10％)種子培養(yǎng)物接種發(fā)酵培養(yǎng)基。在20×200-mm試管中的2mL的基本發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。細(xì)胞在32℃使用250rpm振蕩培養(yǎng)65小時(shí)。

培養(yǎng)后，通過(guò)紙色譜法使用由丁-1-醇:乙酸:水＝4:1:1(v/v)組成的流動(dòng)相確定培養(yǎng)基中積累的L-蘇氨酸的量。丙酮中的茚三酮溶液(2％)用作可視化試劑。將含有L-蘇氨酸的點(diǎn)切出，使用CdCl₂的0.5％水溶液洗脫L-蘇氨酸，且L-蘇氨酸的量在540nm用分光光度法評(píng)估。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)如下：

葡萄糖和硫酸鎂單獨(dú)滅菌。CaCO₃在180℃干熱滅菌2小時(shí)。將pH調(diào)節(jié)到7.0。滅菌后將抗生素引入培養(yǎng)基中。

實(shí)施例15：通過(guò)大腸桿菌SV164(pGH5)ΔgshA的L-色氨酸的生產(chǎn)

為了測(cè)試gshA基因的失活對(duì)L-色氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655ΔgshA::Cm^R菌株的染色體的DNA片段通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)色氨酸的大腸桿菌SV164(pGH5)菌株以獲得大腸桿菌SV164(pGH5)ΔgshA菌株。SV164(pGH5)菌株是通過(guò)將質(zhì)粒pGH5導(dǎo)入大腸桿菌SV164菌株獲得的菌株。SV164菌株(JP 3032013B)具有trpE等位基因，其編碼免于色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)。SV164菌株是通過(guò)向大腸桿菌YMC9菌株(ATCC 33927)的trpE基因中引入突變獲得的菌株。YMC9菌株可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)。質(zhì)粒pGH5含有突變體serA基因，編碼免于絲氨酸反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶。SV164菌株(pGH5)詳細(xì)描述于美國(guó)專利No.6,180,373 B1或EP0662143 B1。

將大腸桿菌SV164(pGH5)和SV164(pGH5)ΔgshA菌株分別在3mL補(bǔ)充有四環(huán)素(20mg/L，pGH5質(zhì)粒的標(biāo)志物)的營(yíng)養(yǎng)肉湯中在37℃振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。然后，將0.3mL獲得的培養(yǎng)物各自接種到20×200-mm試管中的3mL發(fā)酵培養(yǎng)基中并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以250rpm在37℃培養(yǎng)48小時(shí)。

培養(yǎng)后，通過(guò)如實(shí)施例12(L-苯丙氨酸的生產(chǎn))中所述的TLC確定培養(yǎng)基中積累的L-色氨酸的量。發(fā)酵培養(yǎng)基組分列于表3中，但應(yīng)當(dāng)以分開(kāi)的組(A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，和H)滅菌，如所顯示的，以避免滅菌期間的不利相互作用。

表3

溶液A的pH使用NH₄OH調(diào)節(jié)至7.1。

*Mameno是大豆粉水解物(Ajinomoto Co,Inc.)

雖然本發(fā)明已經(jīng)參考其優(yōu)選的實(shí)施方案詳細(xì)描述，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，可以在不偏離本發(fā)明范圍的前提下進(jìn)行各種變化以及采用同等方案。本文中所有引用的參考文獻(xiàn)通過(guò)提述作為本申請(qǐng)的一部分收入。

工業(yè)應(yīng)用性

根據(jù)本發(fā)明，可以改進(jìn)通過(guò)腸肝菌科細(xì)菌的L-氨基酸，如支鏈L-氨基酸的生產(chǎn)。