本發(fā)明涉及一種基因工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體為一種mirna標(biāo)志物在制備篩查葉酸缺乏群體的宮頸上皮內(nèi)瘤變?cè)噭┲械膽?yīng)用。
背景技術(shù)：
：宮頸癌（cervicalcancer，cc）發(fā)病率位居發(fā)展中國(guó)家女性惡性腫瘤第二位，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新發(fā)病例50萬(wàn)，我國(guó)占25%，病死率達(dá)11.30%，遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國(guó)家。山西省為宮頸癌的高發(fā)區(qū)，其中我省陽(yáng)城縣仍為我國(guó)子宮頸癌發(fā)病率（78.23/10萬(wàn)）和死亡率（25.07/10萬(wàn)）最高的地區(qū)，遠(yuǎn)高于同期我國(guó)宮頸癌平均發(fā)病率（9.62/10萬(wàn)）和死亡率（2.54/10萬(wàn)）[2,3]。故山西省已經(jīng)成為該病的重災(zāi)區(qū)，嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命。所以在我們國(guó)家（尤其山西）研究該病的發(fā)生機(jī)制、阻斷其發(fā)生仍然是迫切需要解決的問題。宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepithelialneoplasia,cin）作為癌前病變，是阻斷宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵階段。由于篩查的廣泛推進(jìn)，cin呈發(fā)病增加及年輕化趨勢(shì)。cin可分為兩個(gè)級(jí)別即：低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（low-gradecervicalsquamousintraepitheliallesions,lsil）和高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（high-gradecervicalsquamousintraepitheliallesions,hsil）。其中，前者多自然消退，而后者則高度可能進(jìn)展為浸潤(rùn)癌。隨著預(yù)防關(guān)口的前移，阻斷cin進(jìn)展為宮頸癌已成為目前廣泛關(guān)注和亟待解決的問題。持續(xù)性的人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus,hpv）（尤其是hpv16、18等）的感染是宮頸癌發(fā)生的重要因素，hpv16和hpv18感染存在于70%以上的宮頸癌中。然而超過80%婦女曾有hpv感染，只有不到1%宮頸癌變。可見在宮頸癌的發(fā)生過程中必然存在hpv外的協(xié)同因素的輔助。所以深入探討山西宮頸癌高發(fā)的區(qū)域因素，及其在疾病進(jìn)展中的分子機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步完善宮頸癌發(fā)病機(jī)制，尋求新的防治策略具有重要意義。目前已經(jīng)明確1.葉酸缺乏引可能是協(xié)同hr-hpv感染致cin進(jìn)展、宮頸癌發(fā)生的重要輔助因素已發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)素（葉酸，vita，vite等）攝入量或體內(nèi)水平較低可增加患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。與葉酸缺乏有關(guān)的新生兒神經(jīng)管畸形發(fā)生率在山西省居全國(guó)首位，高發(fā)區(qū)沿太行山脈走形，與宮頸癌的高發(fā)區(qū)域基本一致。這兩者間是否存在內(nèi)在某種聯(lián)系呢？以醫(yī)院為基礎(chǔ)的人群研究發(fā)現(xiàn)，無論是膳食葉酸攝入量抑或血清葉酸水平，在宮頸癌組均低于對(duì)照組，宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)與血清葉酸間存在劑量反應(yīng)關(guān)系。且血清水平低與hpv16感染間存在交互作用，兩者同時(shí)存在時(shí)患宮頸癌的危險(xiǎn)高達(dá)17.45倍。葉酸作為體內(nèi)甲基提供者s-腺苷蛋氨酸（s-adenosylmethionine,sam）合成的極為重要、必要的組成成分，可參與dna合成、dna甲基化，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。sam是體內(nèi)100多個(gè)（dna、rna和膜磷脂甲基化反應(yīng)）通用的甲基供體。在所有細(xì)胞內(nèi)，通過dna甲基轉(zhuǎn)移酶（dnamethytrasferase,dnmt）的作用，sam脫去一個(gè)甲基，變成s-腺苷高半胱氨酸（s-adenosylhomocystein,sah），sah轉(zhuǎn)化成高半胱氨酸，提供下一個(gè)蛋氨酸循環(huán)之用。葉酸缺乏時(shí)，sam易耗竭，高半胱氨酸堆積，sah含量升高，sam/sah比例下降，對(duì)dnmt的抑制功能下降，導(dǎo)致dnmt活性升高，使得抑癌基因（啟動(dòng)子區(qū)）發(fā)生過度甲基化，發(fā)生轉(zhuǎn)錄沉默，表達(dá)降低或不表達(dá)，是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（見圖1）。隨著宮頸病變（cin至宮頸癌的進(jìn)程）的加重，血清葉酸含量降低，p16基因cpg島甲基化率逐漸升高，且葉酸水平低和p16、fhit基因（cpg島）甲基化過度在宮頸癌的發(fā)生中有交互作用。提示葉酸缺乏引發(fā)、dna甲基化紊亂可能是導(dǎo)致hr-hpv感染致宮頸病變（cin至宮頸癌）進(jìn)展的重要輔助機(jī)制。2.mirna在葉酸輔助hr-hpv感染導(dǎo)致cin進(jìn)展、宮頸癌發(fā)生中的作用不容忽視《mirna與宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌關(guān)系的研究進(jìn)展》首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心，醫(yī)學(xué)綜述2012.11.18卷22期，梁學(xué)愛，代蔭梅。公開了以下內(nèi)容，研究證實(shí)，mir-143，mir-145抑制宮頸細(xì)胞的增殖，mir-146促進(jìn)細(xì)胞的增殖。hr-hpve6，p53，mir-,34a,p181nk4c,與宮頸癌的發(fā)生有一定關(guān)系，p181nk4c很可能是宮頸癌的分子標(biāo)志物。mir-21可促進(jìn)宮頸細(xì)胞的增生、降低宮頸癌細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡基因的表達(dá)。在hpv感染細(xì)胞中，hpv-dna的含量與mir-125的表達(dá)水平呈反比，外源性的mir-125b可以顯著地抑制宮頸細(xì)胞中hpv-dna的合成。mir-886-5p通過抑制程序性細(xì)胞死亡可引起宮頸癌的發(fā)生。運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的方法檢測(cè)cin的mir-218表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)hpv-dna陽(yáng)性患者的mir-218表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為mir-218缺乏與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。mir-29抑制細(xì)胞周期，通過yy1轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期依賴性激酶源減少細(xì)胞凋亡。現(xiàn)已明確，腫瘤的發(fā)生與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)，后者包括dna甲基化、微小核糖核酸（microrna,mirna）、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等。其中，mirna與腫瘤發(fā)生關(guān)系從表觀遺傳學(xué)角度進(jìn)行研究受到很多學(xué)者的關(guān)注。mirna通過與目標(biāo)mrna（5’和3’端非編碼區(qū)域）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mrna翻譯、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，使相應(yīng)的蛋白表達(dá)下調(diào)。mirna通過影響（原癌、抑癌）基因的表達(dá)，發(fā)揮著原癌、抑癌的作用。目前認(rèn)為，約1/3的蛋白編碼基因受mirna的調(diào)控，且一個(gè)mirna可調(diào)控百余種靶基因。其中，超出1/2的mirna位于染色體的脆性位點(diǎn)、hpv整合區(qū)域等癌癥相關(guān)的基因組不穩(wěn)定區(qū)域。patricia等研究發(fā)現(xiàn)，68種mirna在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)（mir-199s，mir-9，mir-199a，mir-199a，mir-199b，mir-145，mir-133a，mir-133b，mir-214和mir-127等），8種mirna（mir-26a,mir-143,mir-145,mir-99a,mir-203，mir-513，mir-29a和mir-199a）在cin、宮頸癌組織中下調(diào)，其下調(diào)程度與宮頸病變級(jí)別的升高相關(guān)。在宮頸癌組織或細(xì)胞系中，mir-15b，mir-16，mir-17-5p，mir-20a，mir-20b，mir-21，mir-93，mir-106a，mir-155，mir-182，mir-185和mir-224等也表達(dá)上調(diào)，mir-29a，mir-34a，mir-126，mir-127，mir-145，mir-218，mir-424，mir-450，mir-455等表達(dá)明顯下調(diào)。由此可見，mirna異常表達(dá)是宮頸癌表觀遺傳機(jī)制的關(guān)鍵內(nèi)容。研究表明，超出一半的mirna（編碼基因啟動(dòng)子區(qū)）富含cpg島，該部位過度甲基化可引起mirna表達(dá)下調(diào)，影響其靶基因的表達(dá)、功能，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常所致的癌癥。在hct-116細(xì)胞中，han等[19]將dnmt敲除，發(fā)現(xiàn)基因甲基化廣泛下調(diào)（95%），低甲基化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)7種mirna過表達(dá)，包括mir-10a（2.85倍），mir-200a（2.35倍），mir-125b（1.72倍），mir-221（1.34倍）和mir-222（1.34倍）；此外，6種mirna低表達(dá)，包括mir-17（0.71倍）,mir-20a（0.77倍）和mir-106a（0.57倍）。wilting等發(fā)現(xiàn)mirna（啟動(dòng)子區(qū)）甲基化發(fā)生于癌前病變?cè)缙陔A段，與hpv惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，添加去甲基化試劑可以使宮頸癌細(xì)胞株mirna表達(dá)恢復(fù)。鑒于葉酸與cpg島甲基化、cpg島甲基化與mirna表達(dá)間存在不可分割、極其重要的聯(lián)系，推測(cè)葉酸可誘發(fā)cpg島甲基化、mirna異常表達(dá)，在cin進(jìn)展、宮頸癌發(fā)生中發(fā)揮一定的作用。associationbetweenfolatestatusandcervicalintraepithelialneoplasia.eurjclinnutr.2016.[epubaheadofprint]zhaow,haom,wangy,fengn,wangz,wangw,wangj,dingl.證實(shí)了血清葉酸水平低可增加cin發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，且與hr-hpv感染存在正相加交互作用。葉酸缺乏可能通過影響dna的甲基化和dna合成及修復(fù)功能,使宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上升;補(bǔ)充葉酸可改善cin情況,抑制癌細(xì)胞增殖,可能會(huì)降低宮頸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)已明確，腫瘤的發(fā)生與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)，后者包括dna甲基化、mirna、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等。其中，mirna與腫瘤發(fā)生關(guān)系從表觀遺傳學(xué)角度進(jìn)行研究受到很多學(xué)者的關(guān)注。mirna通過轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因表達(dá)調(diào)控，降調(diào)節(jié)其體內(nèi)約1/3的蛋白編碼基因，廣泛參與病毒感染、腫瘤發(fā)生發(fā)展的每一個(gè)階段。研究已證實(shí)，mirna異常表達(dá)是宮頸癌表觀遺傳機(jī)制的重要內(nèi)容。超過一半mirna位于癌癥相關(guān)的基因組不穩(wěn)定區(qū)域（染色體基因的脆性位點(diǎn)、hpv整合區(qū)域）。patricia等研究發(fā)現(xiàn)，68種mirna在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)，8種mirna在cin、宮頸癌組織中下調(diào)，其程度與宮頸病變級(jí)別的升高相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，葉酸參與調(diào)控mirna表達(dá)在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。有學(xué)者對(duì)雄性fisher鼠在單獨(dú)采用葉酸缺乏飲食飼養(yǎng)而無其他致癌物接觸的第54周發(fā)生了肝細(xì)胞癌，同時(shí)與接受葉酸充足飲食飼養(yǎng)的鼠肝組織相比，發(fā)生肝癌的鼠體內(nèi)肝組織中l(wèi)et-7a,mir-21,mir-23,mir-130,mir-190,mir-17-92的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而mir-122的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)；當(dāng)重新給予葉酸飼養(yǎng)36周后，mir-122轉(zhuǎn)錄水平增加且肝癌生長(zhǎng)受抑。葉酸可通過調(diào)控mirna異常表達(dá)產(chǎn)生化學(xué)預(yù)防腫瘤作用。marist等使用葉酸缺乏培養(yǎng)基培養(yǎng)人的類淋巴母細(xì)胞（tk-6）后發(fā)現(xiàn)，mir-125b,-221,-222,-22,-34b表達(dá)水平分別增加2.89,2.50,2.09,1.93和2.08倍。隨后通過與血清葉酸水平正常的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者相比，血清葉酸缺乏者mir-222表達(dá)水平明顯增高。liang等對(duì)鼠胚胎干細(xì)胞采用葉酸缺乏培養(yǎng)基培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其凋亡率增加，g0/g1期停滯，且增殖速度減慢。同時(shí)12種mirna轉(zhuǎn)錄異常。wang等[42]對(duì)胚胎鼠早期暴露酒精后發(fā)現(xiàn)，腦組織內(nèi)mir-10a,mir-10b,mir-9,mir-145,mir-30a-3p和mir-152表達(dá)上調(diào)（>1.5倍），而mir-200a,mir-496,mir-296,mir-30e-5p,mir-362,mir-339,mir-29c和mir-154表達(dá)下調(diào)（<0.67倍），給予葉酸干預(yù)后，上調(diào)的mir-10a表達(dá)下調(diào)，且其下游靶基因同源異型盒a1表達(dá)恢復(fù)，該研究證實(shí)葉酸干預(yù)可影響體內(nèi)mirna的異常表達(dá)。然而，葉酸缺乏是否通過調(diào)控mirna異常表達(dá)，參與cin進(jìn)展至宮頸癌？目前國(guó)內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，我們研究葉酸缺乏條件下調(diào)控mirna異常表達(dá)，以確定某些mirna參與cin，以更好地判斷cin。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種在身體內(nèi)葉酸缺乏條件下篩查宮頸上皮內(nèi)瘤變?cè)噭﹎irna標(biāo)志物及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種mirna標(biāo)志物在制備篩查葉酸缺乏群體的宮頸上皮內(nèi)瘤變?cè)噭┲械膽?yīng)用，所述的葉酸缺乏標(biāo)準(zhǔn)為不大于10nmol/l，所述的mirna標(biāo)志物包括：mirna為14個(gè)；mir-10a,mir-375，mir-23a,mir-18a，mir-6774,mir-21,mir-3613,mir-4730，mir-1247,mir-3607,mir-224,mir-30a,mir-30c,mir-196b。所述的試劑或試劑盒可以用來檢查葉酸缺乏患者宮頸組織內(nèi)14個(gè)mirna表達(dá)情況。以便于分析此類群體患cin乃至宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)性。本發(fā)明為國(guó)家衛(wèi)計(jì)委2014年度公益性衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目“宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展的預(yù)警模式及治療策略優(yōu)化的多中心研究（編號(hào)：2014020）”。本發(fā)明研究的目的：應(yīng)用mirna芯片技術(shù)篩選血清葉酸充足/缺乏的不同程度宮頸組織中mirna表達(dá)譜的差異，結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與血清葉酸缺乏、宮頸病變進(jìn)展均相關(guān)的mirnas，同時(shí)對(duì)差異最為顯著的特定mirna擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，為以后進(jìn)一步研究葉酸缺乏在cin進(jìn)展為宮頸癌中的協(xié)同作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。采取的方法：經(jīng)嚴(yán)格流行病學(xué)資料匹配后，選擇血清葉酸含量充足的單純hpv16陽(yáng)性正常宮頸組織作為對(duì)照組，血清葉酸含量充足和缺乏的單純hpv16陽(yáng)性hsil、單純hpv16陽(yáng)性早期宮頸鱗癌組織作為研究組，每組各選擇5例進(jìn)行affymetrixgenechipmirna4.0array芯片技術(shù)檢測(cè)各組宮頸組織mirna的表達(dá)譜，應(yīng)用生物信息學(xué)分析手段twoclassdif、go-analysis、pathway-analysis選擇顯著性差異mirnas，進(jìn)一步利用差異mirnas與靶基因及其功能的從屬關(guān)系構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)mirna-gene-network、mirna-go-network；同時(shí)對(duì)差異最為顯著的特定mirna擴(kuò)大樣本量進(jìn)行qrt-pcr驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：（1）mirna芯片結(jié)果顯示，與血清葉酸缺乏、宮頸病變進(jìn)展均相關(guān)的特異性差異表達(dá)的mirnas為14個(gè)，mir-10a,375在hsil中上調(diào)，但在scc中下調(diào)；mir-23a,18a在hsil中下調(diào)，但在scc中上調(diào)；mir-6774,21,3613,4730隨著宮頸病變的進(jìn)展呈一致性上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；mir-1247,3607,224,30a,30c,196b隨著宮頸病變的進(jìn)展呈一致性下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，其中mir-375在scc組織中下調(diào)最為顯著。（2）生物信息學(xué)分析顯示，差異mirnas主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞大分子生物合成、細(xì)胞組分形態(tài)發(fā)生、大分子代謝、細(xì)胞內(nèi)氮化合物生物合成、干細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)成分結(jié)構(gòu)及表觀遺傳修飾等分子生物過程；且可參與腫瘤發(fā)生、雌激素信號(hào)通路、黑色素生成、軸突導(dǎo)向、干細(xì)胞多能性信號(hào)通路、泛素化蛋白水解等信號(hào)通路異常。（3）qrt-pcr驗(yàn)證結(jié)果顯示，mir-375在lsil、hsil和scc組的表達(dá)水平低于nc組，尤以hsil和scc組下調(diào)最為顯著，且與血清葉酸水平呈正相關(guān)。最終結(jié)論：葉酸差異相關(guān)宮頸病變組織中存在mirna表達(dá)譜的差異，與血清葉酸缺乏、宮頸病變進(jìn)展均相關(guān)的特異性差異表達(dá)mirna有14個(gè)，其中，以mir-375在scc組織中下調(diào)最為顯著，并經(jīng)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證。生物信息學(xué)分析顯示差異mirna主要參與腫瘤發(fā)生等信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞大分子生物合成等一系列分子生物過程。我們可以將上述研究應(yīng)用于篩查體內(nèi)葉酸缺乏的群體患宮頸上皮內(nèi)瘤變的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步判斷宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。附圖說明圖1葉酸代謝參與基因表達(dá)調(diào)控示意圖圖2-1部分樣本rna電泳圖圖2-2芯片掃描圖圖2-33端雜交質(zhì)控圖圖2-4芯片平均信號(hào)值與背景信號(hào)值圖2-5hpv16感染的正常宮頸組織、葉酸缺乏的hpv16感染的hsil組織、葉酸缺乏的hpv16感染的早期scc組織3組的mirna表達(dá)譜（p＜0.05）。顏色從綠到紅表示mirna的表達(dá)量從低到高。圖2-6hpv16感染的正常宮頸組織、葉酸充足的hpv16感染的hsil組織、葉酸充足的hpv16感染的早期scc組織3組的mirna表達(dá)譜（p＜0.05）。顏色從綠到紅表示mirna的表達(dá)量從低到高。圖2-7芯片篩選葉酸充足的正常宮頸組織、葉酸充足和葉酸缺乏的hsil組織、葉酸充足和葉酸缺乏的早期scc組織5組中差異表達(dá)mirna的動(dòng)態(tài)表達(dá)特征（p＜0.05），y軸為mirna差異倍數(shù)的相對(duì)表達(dá)量（log2值），x軸為不同程度宮頸組織。圖2-8差異mirna靶基因顯著性go的log柱狀圖圖2-9差異mirna靶基因顯著性pathway的log柱狀圖圖2-10差異mirna與其靶向基因建立mirna-gene作用網(wǎng)絡(luò)圖2-11差異mirna與基因功能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（mirna-pathway-network）圖2-12mir-375在nc、lsil,hsil和scc組織中的相對(duì)表達(dá)量，*p＜0.05。具體實(shí)施方式一種mirna標(biāo)志物在制備篩查葉酸缺乏群體的宮頸上皮內(nèi)瘤變?cè)噭┲械膽?yīng)用，所述的葉酸缺乏標(biāo)準(zhǔn)為血清葉酸不大于10nmol/l，所述的mirna標(biāo)志物包括：mirna為14個(gè)；mir-10a,mir-375，mir-23a,mir-18a，mir-6774,mir-21,mir-3613,mir-4730，mir-1247,mir-3607,mir-224,mir-30a,mir-30c,mir-196b。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象1.1.1研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)選擇2013年1月～12月于我院就診的婦科疾病患者，采用tct檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞，排除宮頸腺細(xì)胞異常者，對(duì)tct結(jié)果結(jié)果為ascus及以上者進(jìn)一步行陰道鏡下活檢和組織病理學(xué)檢查。同時(shí)使用導(dǎo)流雜交芯片技術(shù)（hybrimax）進(jìn)行hpv型別檢測(cè)。將病理診斷證實(shí)為hsil、宮頸鱗癌（ⅰa-ⅱa）且單純hpv16感染的患者作為研究組，同期選擇病理診斷證實(shí)為正常宮頸組織且單純hpv16陽(yáng)性者作為對(duì)照組。每組50例以上。研究對(duì)象必須符合下列所有標(biāo)準(zhǔn)：①已婚至65歲女性；②本地區(qū)居住一年以上；③簽署知情同意書。本研究為國(guó)家衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201402010）基金項(xiàng)目；所有研究方案、知情同意書于2013年7月經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；經(jīng)中國(guó)臨床試驗(yàn)中心注冊(cè)（注冊(cè)號(hào)：chictr-roc-15006479）。1.1.2研究對(duì)象排除標(biāo)準(zhǔn)凡具備下列任一情況者不得入選：①妊娠期婦女。②有子宮切除術(shù)史者。③有宮頸及陰道病變治療史者。④其他惡性腫瘤患者。⑤血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病患者。⑥近期（三個(gè)月內(nèi)）b族維生素使用者。1.1.3研究對(duì)象分組（1）采集基線信息：由流行病學(xué)專家設(shè)計(jì)統(tǒng)一的、結(jié)構(gòu)式問卷，由培訓(xùn)合格、固定的調(diào)查員，面對(duì)面地對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行詢問、填寫。調(diào)查內(nèi)容有人口學(xué)特征（年齡、職業(yè)、文化程度、年收入），婚育信息（月經(jīng)史、婚姻史、孕產(chǎn)史、性行為史、避孕史），既往病史和腫瘤家族史等。（2）血清葉酸檢測(cè)：方法同第一部分。世界衛(wèi)生組織葉酸和維生素b12缺乏技術(shù)顧問組確定將葉酸缺乏標(biāo)準(zhǔn)定為葉酸濃度小于4ng/ml（10mol/l）[9]。（3）研究對(duì)象分組：根據(jù)宮頸組織病理學(xué)、hpv分型檢測(cè)結(jié)果，選擇正常宮頸組織（normalcervix,nc）、lsil、hsil和宮頸鱗癌（squamouscervicalcancer,scc）（ⅰa-ⅱa期）者每組30例以上，根據(jù)血清葉酸水平又分為葉酸含量充足者和葉酸含量缺乏者（血清葉酸＜10nmol/l），經(jīng)嚴(yán)格匹配流行病學(xué)資料后篩選出各組5例用于mirna芯片篩查。分組編號(hào)如下：1=血清葉酸充足的單純hpv16陽(yáng)性nc（45.00±1.58歲），2=血清葉酸充足的單純hpv16陽(yáng)性hsil（46.60±3.44歲），3=血清葉酸缺乏的單純hpv16陽(yáng)性hsil（44.20±2.77歲），4=血清葉酸充足的單純hpv16陽(yáng)性scc（47.40±2.41歲），5=血清葉酸缺乏的單純hpv16陽(yáng)性scc（48.40±1.82歲）。五組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=2.373，=0.087）。25例mirna芯片實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的臨床病理資料（如表2-1所示）。然后擴(kuò)大樣本量，選擇經(jīng)病理學(xué)確診的nc、lsil、hsil和scc組四組共計(jì)120例標(biāo)本對(duì)篩選的差異mirna進(jìn)行qrt-pcr驗(yàn)證，120例標(biāo)本的臨床病理資料（如表2-2所示），其中30例scc標(biāo)本的臨床病理資料（如表2-3所示）。表2-1mirna芯片檢測(cè)標(biāo)本的臨床病理資料groupsampleno.pathologyagehpvtypetctserumfolate10000134nc5616nilm23.8612100365nc4416nilm40.6312100071nc3716nilm18.2612100371nc4316nilm26.8912100222nc2716nilm17.9220000219cinⅲ3516asc28.7922100218cinⅲ5216hsil17.3722100209cinⅲ5616asc-h21.7820000043cinⅲ3716asc18.1722100399cinⅲ累腺5216asc-h35.0232100046cinⅲ累腺3316nilm9.2530000126cinⅲ3116lsil9.9132100005cinⅲ4116asc7.9230000179cinⅲ4116asc8.4032100068cinⅲ4316nilm8.9042100279sccg2-g35316scc21.8442100387sccg25916hsil20.2242100418sccg25616asc22.5940000266sccg24016asc17.3340000172sccg2416scc26.7652100125sccg15616asc9.9152100385sccg26616hsil9.5750000048sccg25716nilm9.6550000104sccg26716asc7.3652100290sccg25916scc6.67表2-2mirnaqrt-pcr實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的臨床病理資料表2-3mirnaqrt-pcr驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中所用scc標(biāo)本的臨床病理資料1.2主要儀器與試劑1.2.1主要儀器及設(shè)備沉降式、全自動(dòng)液基細(xì)胞學(xué)制片、染色系統(tǒng)（dc-12型）達(dá)誠(chéng)，廣州，中國(guó)核酸擴(kuò)增分析儀（tc-96/g/h(6)型）、醫(yī)用核酸分子快速雜交儀（hmm-2型）凱普，廣東，中國(guó)全自動(dòng)、微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（beckmancoulteraccess2型）beckmancoulter，美國(guó)-80°c冰箱sanyo，日本mettlertoledo*ab204-s電子天平fisherscientific，美國(guó)分光光度計(jì)（sma3000）meriton，北京，中國(guó)凝膠成像儀（js-380a）培清，上海，中國(guó)geneamppcrsystem9700abi，美國(guó)電泳儀biorad，美國(guó)渦旋器（evtx05）碧云天，北京，中國(guó)磁力架invitrgen，美國(guó)離心管、pcr管axygen，美國(guó)雜交爐（genechip2hybridizationoven640）affymetrix，美國(guó)洗滌工作站（genechip2fluidicsstation450）affymetrix，美國(guó)掃描儀（genechip2scanner30007g）affymetrix，美國(guó)移液器（1000ul,200μl,20μl,2.5μl）eppendorf，德國(guó)振蕩器（9600）agilent，美國(guó)nanodrop2000thermo，美國(guó)eppendorf5418離心機(jī)eppendorf，德國(guó)振蕩器（gl-88b）其林貝爾，海門，中國(guó)金屬浴（hb-100，chb-100）博日科技，杭州，中國(guó)恒溫培養(yǎng)箱（xmtd-8222）精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備，上海，中國(guó)1.2.2主要試劑及耗材液基細(xì)胞制片耗材、染色劑達(dá)誠(chéng)，廣州，中國(guó)hpv分型試劑盒（20143402188）凱普，廣州，中國(guó)葉酸檢測(cè)試劑盒beckmancoulter，美國(guó)accesssubstratebeckmancoulter，美國(guó)accesswashbufferⅱbeckmancoulter，美國(guó)葉酸校準(zhǔn)品beckmancoulter，美國(guó)測(cè)試杯拱東，杭州，中國(guó)trizol試劑invitrogen，美國(guó)flashtagbiotinhsrrnalabelingkitaffymetrix，美國(guó)genechip?hybridization,wash,andstainkitaffymetrix，美國(guó)chipaffymetrix，美國(guó)real-timepcrmastermix（2×）吉碼，上海，中國(guó)mirnahairpin-primerset（5μm）吉碼，上海，中國(guó)mirnartprimer（10μm）吉碼，上海，中國(guó)taqdnapolymerase（5u/μl）吉碼，上海，中國(guó)syntheticmir-16standard吉碼，上海，中國(guó)1xrnadilutionbuffer1ml吉碼，上海，中國(guó)1.3宮頸組織標(biāo)本收集（1）取出預(yù)冷（4度冰箱）低溫凍存管（1ml）。（2）由具有陰道鏡檢查經(jīng)驗(yàn)2年以上者實(shí)施陰道鏡檢查，對(duì)病變部位進(jìn)行觀察，初步考慮為cin或?qū)m頸癌病變（研究組）：在不影響常規(guī)病理診斷的前提下，另鉗取2塊組織（大小各約5mm）；對(duì)照組：宮頸3、6、9、12點(diǎn)各鉗取2塊組織（大小各約5mm）；（3）新鮮宮頸組織標(biāo)本離體后，予生理鹽水清洗血跡，置于預(yù)冷好的低溫凍存管中，及時(shí)（＜10min)放入裝好液氮的保溫桶內(nèi)。放置新鮮宮頸組織時(shí)應(yīng)用的無菌棉簽或鑷子不得接觸其他液體、組織或物品，以防污染。（4）待標(biāo)本在液氮桶內(nèi)放置1h后，旋緊凍存管的蓋子，按要求放入凍存盒，按預(yù)設(shè)的存儲(chǔ)位置放入-80℃冰箱，并記錄進(jìn)入信息系統(tǒng)。1.4mirna芯片檢測(cè)1.4.1宮頸組織總rna提?。?）在加入液氮的研缽中，將宮頸組織剪成小塊、磨成粉末，取其50mg加入ep管（盛有1ml的trizol液），混勻。（2）室溫放置5min，加入氯仿（200μl），蓋緊ep管、劇烈搖蕩15s。（3）12000rpm離心（10min），取上層水相置于另一ep管，加入異丙醇（500μl），溫和混勻。室溫放置10min，12000rpm離心（10min）。（4）棄去上清，加入75%乙醇（1ml），渦旋混勻，4℃下12000rpm離心（5min）。重復(fù)操作一次。（5）棄去上清，室溫或真空干燥（5～10min）。depc水將rna溶解，必要時(shí)溫水浴10min。吸取上清到離心管，加入氯仿（1/5體積）混勻，放置3min，4℃12000rpm離心（15min）；重復(fù)操作一次。（6）吸取上清到離心管中，加入無水乙醇（1.5倍體積），混勻。（7）上述溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱，8000rpm離心1min，倒掉廢液，將其放回收集管。（8）rwt（350μl）加入吸附柱中，8000rpm離心（1min），倒掉廢液，然后將其放回收集管中。（9）dnasei（80μl）加入吸附柱中，25℃消化dna15min，輕柔混合；后重復(fù)步驟（8）。（10）rpe洗滌液（500μl）洗滌1次，8000rpm離心1min。（11）棄掉收集管廢液，然后12000rpm離心（2min）。（12）把吸附柱移到收集管，加入預(yù)熱（50℃）過的rnase-freewater（15～20μl），室溫放2min，12000rpm離心2min，得rna溶液。1.4.2mirna芯片檢測(cè)步驟（1）poly(a)tailing①在無rnase的rna樣品pcr管中加入1μg總rna，補(bǔ)充nuclease-freewater至8μl，冰上靜置。②加入2ulrnaspikecontrololigos混勻。③用1mmtris稀釋atpmix，稀釋倍數(shù)如下：totalrna：atpmix稀釋倍數(shù)=1:500。④加入5μlmastermix混合液至pcr管，混勻離心5s，mastermix組分如下：⑤在pcr儀37℃孵浴15min，然后離心5s，放在冰上。（2）flashtagbiotinhsrligation①加4μl5×flashtagbiotinhsr連接混合液，加入2μlt4連接酶，輕輕混勻、離心5s，25℃孵浴30min；②離心5s。加入2.5μlhsrstopsolution混勻后離心5s，然后吸取2μl做elosaqcassay檢測(cè)，其余-20℃保存。（3）芯片雜交①把芯片從冰箱中取出后放在室溫；②在無rnasepcr管中加入5ul20×eukaryotichybridizationcontrols在pcr儀上65℃孵育5min；③配制雜交液：④離心5s，pcr儀上孵育。⑤將上述液體離心5s，然后取100μl注入芯片中，貼紙封住加樣口。⑥置于雜交爐，48℃，60rpm，16h。（4）芯片洗滌和掃描①結(jié)束雜交后，吸掉雜交液，加入100μlarrayholdingbuffer；②在affymetrixgenechipcommandconsole（agcc）中，掃描芯片條形碼，注冊(cè)樣品信息，生成樣品對(duì)應(yīng)芯片arr文件；③將芯片洗滌液置于相應(yīng)位置，運(yùn)行agccflutionscontrol軟件；④初始化結(jié)束后，3個(gè)無rnase離心管（1.5ml）中分別加入600mlstaincocktail1、600mlstain在cocktail2和800mlarrayholdingbuffer，將其置于洗脫站的相應(yīng)位置（1、2、3）上，然后把芯片插入洗脫站的槽中；⑤在洗脫站中掃描芯片條形碼、選擇芯片類型，點(diǎn)擊運(yùn)行，洗滌1h；⑥將芯片置于affymetrix掃描儀中，點(diǎn)擊agccscancontrol，生成芯片掃描數(shù)據(jù)。1.5mirna生物信息學(xué)分析1.5.1兩分類的差異基因篩選（twoclassdif）對(duì)于小樣本，通常使用隨機(jī)方差模型（t檢驗(yàn)、f檢驗(yàn)）篩選差異基因。t檢驗(yàn)通常適合于二類的差異基因。設(shè)，為二類型的樣本平均值，為方差，為樣本量，計(jì)算公式為：，其中，t服從自由度為的t分布。估計(jì)t檢驗(yàn)中的方差時(shí)，選擇反伽瑪分布作為隨機(jī)方差模型。首先，選擇線性模型中，設(shè)為來自i樣本的基因j的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)值，為標(biāo)志不同特性的向量，為系數(shù)向量，為未知?dú)埐睿ň禐?，方差未知）。對(duì)每一個(gè)基因j，且方差的樣本估計(jì)值服從反伽瑪分布。對(duì)的假設(shè)檢驗(yàn)基于給定的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。根據(jù)線形模型要檢驗(yàn)的假設(shè)為為線性子空間表示的維數(shù)，表示受子空間約束的線性向量的維數(shù)。在空間上，對(duì)的最大似然估計(jì)為，以及在子空間上，對(duì)的最大似然估計(jì)為，其中代表在子空間上的滿秩矩陣。要假設(shè)的檢驗(yàn)為，我們要先考慮各偏差平方和，然后用下面給出的統(tǒng)計(jì)量去檢驗(yàn)假設(shè)：。在零假設(shè)為真時(shí)，f服從自由度為r與n-k的f分布。我們?cè)僭陔S機(jī)方差模型的假設(shè)檢驗(yàn)下，對(duì)進(jìn)行估計(jì)，就會(huì)在最大似然估計(jì)中有一些改變。在統(tǒng)計(jì)量f中，分母的殘差平方和替換為，而其自由度也由n-k變?yōu)閚-k+2a。所以，調(diào)整后的統(tǒng)計(jì)量為，在假設(shè)為真時(shí)，服從自由度為r與n-k+2a的f分布。在線性模型下，采用最大似然估計(jì)對(duì)方差進(jìn)行估計(jì)，得到：，，再運(yùn)用隨機(jī)方差模型，經(jīng)過運(yùn)算之后，得到：通過隨機(jī)方差模型的建造，我們得到對(duì)t檢驗(yàn)的方差估計(jì)，也就是說對(duì)傳統(tǒng)t檢驗(yàn)中的方差進(jìn)行修正，得到：，其中，，使得統(tǒng)計(jì)量的自由度由n-2變?yōu)椤?.5.2基因功能的顯著性分析（go-analysis）篩選得到差異表達(dá)的mirna，利用數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)差異mirna調(diào)控的靶基因，對(duì)其進(jìn)行顯著性的功能分析，得到顯著性的功能?；虮倔w論（geneontology,go）是對(duì)基因進(jìn)行顯著性go的分析，利用如下的四格表：nf：表示go中差異基因的數(shù)目；nf：表示差異基因的數(shù)目；n：表示go中含有基因的總數(shù)目；n：表示基因的總數(shù)目（注釋系統(tǒng)）。在給定的邊際頻率（即go中基因數(shù)目確定）時(shí)，四格表中元素服從超幾何分布，從而得到fisher精確檢驗(yàn)的p值，即通過求解雙尾的累積超幾何分布值得到fisher精確檢驗(yàn)的p值，對(duì)于2nf≤n，p值計(jì)算公式如下：為了控制多重比較檢驗(yàn)中犯第一類錯(cuò)誤的整體概率，我們采用benjamini-hochberg的方法來控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（falsediscoveryrate，fdr）（判斷為顯著性的go中假陽(yáng)性go比例的期望），從而得到具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的功能[15]。另外，我們通過富集得分（enrichmentscore,e）來評(píng)估單個(gè)功能中基因的富集程度，計(jì)算方法如下[16]：。1.5.3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的顯著性分析（pathway-analysis）目前，京都基因與基因組百科全書（kyotoencyclopediaofgenesandgenome，kegg）是有關(guān)pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，pathwayanalysis是對(duì)mirna調(diào)控的靶基因按照kegg進(jìn)行pathway分類，并對(duì)靶基因進(jìn)行基于離散分布的顯著性分析。利用如下四格表：：表示pathway中差異基因的數(shù)目；：表示差異基因的數(shù)目；：表示pathway中含有基因的總數(shù)目；：表示芯片上檢測(cè)出來基因的總數(shù)目；：表示差異基因落在pathway中的概率；：表示非差異基因不落在pathway中的概率。假設(shè)：，在此假設(shè)下分別利用fisher精確檢驗(yàn)、檢驗(yàn)，得到值、值，進(jìn)一步經(jīng)多重比較，確定pathway的fdr。最后得出顯著性pathway，完成pathway-analysis。enrichment計(jì)算公式為：1.5.4mirna與基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（mirna-gene-network）生物網(wǎng)絡(luò)體現(xiàn)了基因之間或者基因與其他功能或通路之間的相互聯(lián)系，通過網(wǎng)絡(luò)分析可以發(fā)現(xiàn)基因影響生物體的協(xié)助脈絡(luò)，并能在復(fù)雜的作用鏈條中，系統(tǒng)地挖掘基因發(fā)揮作用的真實(shí)線索。利用差異mirna、靶基因二者間的屬性關(guān)系建立mirna-gene相互作用網(wǎng)絡(luò)。其中，圓圈表示gene，圓角矩形表示mirna，一條邊表示相互作用。中心度表示mirna對(duì)周圍gene的貢獻(xiàn)程度，或gene對(duì)周圍mirna的貢獻(xiàn)程度。degree最高表明該mirna、gene在網(wǎng)絡(luò)中處于最核心的位置。1.5.5mirna與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（mirna-pathway-network）通過pathwayenrichmentanalysis，可以得到mirna調(diào)控的靶基因參與的顯著性的pathway與gene的關(guān)系，聯(lián)合mirna與gene的靶向關(guān)系，就可以建立mirna與顯著性pathway之間的相互作用關(guān)系。其中，圓圈表示pathway，圓角矩形表示mirna，一條邊表示相互作用。degree最高表明該mirna、pathway在網(wǎng)絡(luò)中處于最核心的位置。1.6qrt-pcr驗(yàn)證mir-375的表達(dá)（1）總rna提取和質(zhì)檢：同1.4。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：程序：42oc，30min；85oc，10min；產(chǎn)物4℃保存。（3）引物的設(shè)計(jì)與合成mir-375基因的引物序列來自參考文獻(xiàn)。正義引物：5-cttactatccgtttgttcgttcg-3反義引物：5-tatggttgttctcgtctctgtgtc-3（4）熒光定量反應(yīng)體系：程序：95oc3min；95oc12s；62oc40s；40循環(huán)。根據(jù)2-δδct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用affymetrixexpressionconsoletm對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化解析、質(zhì)控。應(yīng)用rqmanagerversion1.2軟件分析qrt-pcr結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示相對(duì)表達(dá)量。采用spss18.0windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述正態(tài)分布資料；采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組資料比較，采用anova和lsd-t檢驗(yàn)進(jìn)行多組資料比較；以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1質(zhì)量控制rna樣品加于1%瓊脂糖凝膠孔，經(jīng)120v電壓5min，紫外光下觀察，可見28s、18s核糖體rna條帶濃、亮，且前者密度約是后者的2倍；二者間彌散一片溴化乙啶染色物質(zhì)，由mrna和其它異型rna組成。再下方還有可能觀察到一個(gè)稍微擴(kuò)散的、更小的帶，其由低分子量rna（如trna、5s核糖體rna等）組成。當(dāng)dna污染時(shí)，更高分子量的彌散遷移物質(zhì)、會(huì)在28s核糖體帶的上面出現(xiàn)，提示需要進(jìn)行純化。當(dāng)rna降解時(shí)，核糖體rna帶發(fā)生彌散。本組入選研究對(duì)象的組織標(biāo)本中總rna經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在28s、18s、5s條帶出完整且清晰（如圖2-1所示）。芯片質(zhì)量控制參照核心質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、參考質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。其中，從所有芯片掃描圖上都可以看到芯片陣列名以及角落的黑白棋盤狀圖案，表示b2oligo強(qiáng)陽(yáng)性雜交質(zhì)控合格（如圖2-2所示）。參考質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)有兩方面：（1）雜交控制：圖顯示雜交探針結(jié)果為biob<bioc<biod<cre，表示雜交質(zhì)控合格（如圖2-3所示）。（2）芯片平均信號(hào)值與背景信號(hào)值：芯片的平均信號(hào)值（meanintensity）高于芯片的背景信號(hào)值（meanbackgroundintensity），表示芯片檢測(cè)結(jié)果好（如圖2-4所示）。2.2mirna芯片篩選葉酸差異的不同宮頸組織mirna表達(dá)譜通過選擇血清葉酸水平充足的單純hpv16陽(yáng)性的正常宮頸作為對(duì)照組，分別選擇葉酸含量充足/缺乏的單純hpv16陽(yáng)性的hsil及早期scc組織作為實(shí)驗(yàn)組，嚴(yán)格匹配流行病學(xué)資料后，每組各5例患者采用affymetrixgenechipmirna4.0array芯片技術(shù)檢測(cè)各組宮頸組織mirna的表達(dá)譜，首先對(duì)單純hpv16感染的正常宮頸組織、葉酸缺乏的單純hpv16感染的hsil組織、葉酸缺乏的單純hpv16感染的早期scc組織（a組）3組進(jìn)行單因素方差分析，差異表達(dá)的mirna為34個(gè)（p＜0.05）（如圖2-5所示）；其次對(duì)單純hpv16感染的正常宮頸組織、葉酸正常的單純hpv16感染的hsil組織、葉酸正常的單純hpv16感染的早期scc組織（b組）3組進(jìn)行單因素方差分析，差異表達(dá)的mirna為57個(gè)（p＜0.05）（如圖2-6所示）；將a組與b組取交集，得到與單純與宮頸病變進(jìn)展相關(guān)的差異表達(dá)的mirna為20個(gè)，最后從a組除去a組與b組的交集mirna，得出與血清葉酸缺乏、宮頸病變進(jìn)展均相關(guān)的特異性差異表達(dá)的mirna為14個(gè)，mir-10a,375在hsil組織中上調(diào)，但在scc組織中下調(diào)；mir-23a,18a在hsil組織中下調(diào)，但在scc組織中上調(diào)；mir-6774,21,3613,4730隨著宮頸病變的進(jìn)展呈一致性上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；mir-1247,3607,224,30a,30c,196b隨著宮頸病變的進(jìn)展呈一致性下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；其中，以mir-375在scc組中下調(diào)最為顯著（如表2-1,圖2-7所示）。表2-1不同宮頸組織中差異mirna在基因芯片中的表達(dá)量注：先將所有差異顯著的mirna進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，即每個(gè)mirna的hsil、scc的表達(dá)量分別除以正常宮頸的表達(dá)量以后，再進(jìn)行l(wèi)og2標(biāo)準(zhǔn)化，將正常宮頸組織的每個(gè)mirna都?xì)w一化為0。2.3差異mirna功能的生物信息學(xué)分析2.3.1mirna調(diào)控的靶基因預(yù)測(cè)取血清葉酸充足、單純hpv16感染的正常宮頸組織作為對(duì)照，取葉酸充足/缺乏的單純hpv16感染的hsil組織、葉酸充足/缺乏的單純hpv16感染的早期scc組織5組差異表達(dá)的14個(gè)mirna，分別搜索數(shù)據(jù)庫(kù)（targetscan、miranda）預(yù)測(cè)靶基因，取交集部分，得到差異mirna（顯著性趨勢(shì)）調(diào)控的所有靶基因作為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)研究。本研究中，14個(gè)差異表達(dá)mirna共預(yù)測(cè)到1263個(gè)交集靶基因。2.3.2靶基因功能的顯著性分析（go-analysis）go-analysis對(duì)靶基因按go分類，基于顯著性、誤判率和富集度分析，得到聯(lián)系顯著、低誤判率、靶向性的基因功能分類。本研究通過對(duì)14個(gè)差異mirna預(yù)測(cè)到的交集靶基因進(jìn)行g(shù)o分析，顯示其靶向性的基因功能共195類（如圖2-8所示）。2.3.3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的顯著性分析（pathway-analysis）本研究中按照kegg，對(duì)mirna調(diào)控的靶基因進(jìn)行pathway分類，基于離散分布的顯著性分析，得到顯著性的pathway分類42條（如圖2-9所示）。2.3.4mirna與基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（mirna-gene-network）將顯著性go與顯著性pathway包含的靶基因交集并與mirna構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)位置函數(shù)計(jì)算出mirna在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)系強(qiáng)度，即網(wǎng)絡(luò)特征值。特征值最高代表該mirna處于網(wǎng)絡(luò)的樞紐性地位，其調(diào)控能力最強(qiáng)，同時(shí)亦可得到mirna調(diào)控的關(guān)鍵靶基因。本研究中，根據(jù)mirna與gene的屬性關(guān)系建立二者間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，其中mir-30a-5p和mir-18a-3p具有最高的degree，表明該mirna在網(wǎng)絡(luò)中處于最核心的調(diào)控位置（如表2-2和圖2-10所示）。2.3.5mirna與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（mirna-pathway-network）根據(jù)呈顯著性趨勢(shì)的mirna和靶基因的顯著性功能，利用二者間的聯(lián)系，建立mirna-pathway-network，來反映mirna對(duì)基因功能的作用。同樣，根據(jù)位置函數(shù)計(jì)算出mirna在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)系強(qiáng)度，即網(wǎng)絡(luò)特征值，數(shù)值最高代表該mirna處于網(wǎng)絡(luò)的樞紐性地位，其調(diào)控能力最強(qiáng)，同時(shí)亦可得到mirna調(diào)控的關(guān)鍵pathway。本研究中，根據(jù)mirna與pathway的屬性關(guān)系建立二者間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，其中mir-18a-3p和mir-30c-2-3p具有最高的degree，表明該mirna在網(wǎng)絡(luò)中處于最核心的調(diào)控位置（如表2-3a，b和圖2-11所示）。2.4不同宮頸組織中mir-375的表達(dá)及其與血清葉酸的相關(guān)性選擇在葉酸缺乏宮頸癌組織中下調(diào)最為顯著的mir-375作為研究目標(biāo)，分別選擇nc30例，lsil30例，hsil30例，scc30例，檢測(cè)各組宮頸組織中mir-375的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)nc、lsil、hsil和scc組宮頸組織中mir-375的相對(duì)表達(dá)量分別為：1.04±0.13；0.87±0.10；0.04±0.02和0.08±0.02，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（f=1236.62，p＜0.001）。其中，除hsil組、scc組兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.06），其余任兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.001）（如圖2-12所示）?？梢姡琺ir-375在lsil、hsil和scc組的表達(dá)水平低于nc組。隨后，進(jìn)一步將宮頸組織中mir-375的表達(dá)水平與血清葉酸水平進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，mir-375的表達(dá)水平、血清葉酸水平間呈正相關(guān)（r=0.695,p=0.03）。提示，mir-375表達(dá)下調(diào)在宮頸病變的進(jìn)展中發(fā)揮一定的作用，且可能與血清葉酸水平低相關(guān)。本研究中使用affymetrixgenechipmirna4.0array芯片，總探針數(shù)30,424，具有以下優(yōu)勢(shì)：①可以全面覆蓋sangermirbasev20.0數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)檢測(cè)206個(gè)物種的mirna。②同時(shí)檢測(cè)成熟mirna、mirna前體，能檢測(cè)人snorna和scarna。③增加mirna和mrna之間的關(guān)聯(lián)分析。④可全面解決mirna芯片分析方案（包括歸一化、差異基因篩選、mirna靶基因預(yù)測(cè)、mirna-target-network、mirna-gonetwork、mirna-pathway-network的聯(lián)合分析）。本研究中，通過選擇血清葉酸水平正常、單純hpv16陽(yáng)性的正常宮頸組織作為對(duì)照組，分別選擇葉酸含量缺乏/充足的單純hpv16陽(yáng)性的hsil及早期scc組織作為實(shí)驗(yàn)組，嚴(yán)格匹配流行病學(xué)資料后，每組各5例患者采用affymetrixgenechipmirna4.0array芯片技術(shù)檢測(cè)各組宮頸組織mirna的表達(dá)譜，得出與葉酸缺乏（＜10nmol/l）、宮頸病變進(jìn)展均相關(guān)的特異性差異表達(dá)的mirna為14個(gè)，mir-10a,375在hsil組織中上調(diào)，但在scc組織中下調(diào)；mir-23a,18a在hsil組織中下調(diào)，但在scc組織中上調(diào)；mir-6774,21,3613,4730隨著宮頸病變的進(jìn)展呈一致性上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；mir-1247,3607,224,30a,30c,196b隨著宮頸病變的進(jìn)展呈一致性下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；其中，mir-375在scc組織中下調(diào)最為顯著。然而，芯片分析結(jié)果有一定局限性，獲得的葉酸差異相關(guān)mirna特征性表達(dá)譜仍存在假陽(yáng)性的可能，故我們對(duì)mir-375在不同宮頸組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了qrt-pcr驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-375在lsil、hsil和scc組的表達(dá)水平低于nc組，而hsil和scc組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，mir-375表達(dá)下調(diào)與cin進(jìn)展為宮頸癌密切相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)，mir-375過表達(dá)可通過抑制e6和e7轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致p53、rb降解受抑和htert轉(zhuǎn)錄激活，使得細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞增殖受抑，提示mir-375表達(dá)下調(diào)對(duì)hpv陽(yáng)性宮頸癌的發(fā)生起關(guān)鍵的調(diào)控作用[44]。然而，有關(guān)mir-375下調(diào)的機(jī)制尚不明確。bierkensm等[45]采用高分辨率微陣列比較基因組雜交的方法檢測(cè)hsil病變組織中的微小染色體突變（＜3mb），結(jié)果顯示染色體突變眼睛發(fā)育缺失蛋白（drosophilaeyesabsenthomologue-2,eya2）（20q13）和mir-375（2q35）導(dǎo)致的表達(dá)缺失與hsil相關(guān)，進(jìn)一步在宮頸癌細(xì)胞株內(nèi)外源性導(dǎo)入mir-375可降低細(xì)胞活性。wilting等[46]發(fā)現(xiàn)與mir-149,-203,-375,-638啟動(dòng)子區(qū)高甲基化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制是宮頸癌發(fā)生的重要機(jī)制，后兩者發(fā)生于癌前病變?cè)缙陔A段，與hpv感染細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，且對(duì)添加去甲基化試劑可以使siha細(xì)胞mir-149,-203,-375表達(dá)恢復(fù)。本研究同時(shí)對(duì)mir-375的表達(dá)水平、血清葉酸水平分析相關(guān)性，結(jié)果顯示二者間呈正相關(guān)（r=0.695,p=0.03）。提示，葉酸缺乏引發(fā)的mir-375下調(diào)是cin進(jìn)展、宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵分子事件。此外，本研究同時(shí)利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)本研究中差異表達(dá)的14個(gè)mirnas分別通過搜索數(shù)據(jù)庫(kù)（targetscan、miranda）進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，取交集部分，得到顯著性趨勢(shì)包含的差異mirna調(diào)控的所有靶基因共1263個(gè)。對(duì)這些靶基因進(jìn)行g(shù)o分析，發(fā)現(xiàn)這些差異mirna主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞大分子生物合成、細(xì)胞組分形態(tài)發(fā)生、大分子代謝、細(xì)胞內(nèi)氮化合物生物合成、干細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)成分結(jié)構(gòu)、發(fā)育過程調(diào)控及表觀遺傳修飾等重要的分子生物過程；kegg分析發(fā)現(xiàn)這些差異mirna主要參與腫瘤發(fā)生、雌激素信號(hào)通路、黑色素生成、軸突導(dǎo)向、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性信號(hào)通路、泛素化蛋白質(zhì)水解等信號(hào)通路。提示，這些分子生物過程及信號(hào)通路可能是葉酸缺乏協(xié)同hr-hpv感染致宮頸癌變過程中的關(guān)鍵調(diào)控步驟。通過建立mirna-target-network、microrna-pathway-network，發(fā)現(xiàn)mir-18a-5p在2個(gè)網(wǎng)絡(luò)中處于最核心的位置，表明其調(diào)控能力最強(qiáng)。mir-18a是mir-17-92基因簇的重要成員，對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的正常增殖、分化至關(guān)重要。大多研究顯示mir-18a在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌和前列腺癌中均為高表達(dá)，發(fā)揮癌基因的作用。然而，也有少許研究顯示，過表達(dá)mir-18a可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。目前有關(guān)mir-18a在宮頸癌組織中的研究甚少。近期，lius等發(fā)現(xiàn)對(duì)宮頸癌組織中mir-18a的表達(dá)與放療敏感性有關(guān)，過表達(dá)mir-18a可以抑制共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因的突變率、減弱dna雙鏈斷裂修復(fù)能力，提高放療敏感性。本研究mirna芯片結(jié)果顯示，與nc相比，mir-18a在hsil組織中表達(dá)下調(diào)，但在scc組織中表達(dá)上調(diào)。有待進(jìn)一步通過大樣本組織標(biāo)本對(duì)mir-18a在不同宮頸組織中的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。4結(jié)論4.1葉酸差異的不同宮頸組織中差異mirna的篩選及驗(yàn)證mirna芯片結(jié)果顯示，與葉酸缺乏和宮頸病變進(jìn)展均相關(guān)的特異性差異表達(dá)的mirna為14個(gè)，mir-10a,375在hsil中上調(diào)，但在scc中下調(diào)；mir-23a,18a在hsil中下調(diào)，但在scc中上調(diào)；mir-6774,21,3613,4730隨著宮頸病變的進(jìn)展呈一致性上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；mir-1247,3607,224,30a,30c,196b隨著宮頸病變的進(jìn)展呈一致性下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；其中，mir-375在scc組織中下調(diào)最為顯著。qrt-pcr驗(yàn)證結(jié)果顯示，mir-375在lsil、hsil和scc組的表達(dá)水平低于nc組，且與血清葉酸水平間呈正相關(guān)。14個(gè)mirna；mir-10a,mir-375，mir-23a,mir-18a，mir-6774,mir-21,mir-3613,mir-4730，mir-1247,mir-3607,mir-224,mir-30a,mir-30c,mir-196b?；蛐蛄斜?。micrornanameidseq>hsa-mir-10a-5pmimat0000253uacccuguagauccgaauuugug>hsa-mir-10a-3pmimat0004555caaauucguaucuaggggaaua>hsa-mir-1247-5pmimat0005899acccgucccguucguccccgga>hsa-mir-1247-3pmimat0022721ccccgggaacgucgagacuggagc>hsa-mir-18a-5pmimat0000072uaaggugcaucuagugcagauag>hsa-mir-18a-3pmimat0002891acugcccuaagugcuccuucugg>hsa-mir-196b-5pmimat0001080uagguaguuuccuguuguuggg>hsa-mir-196b-3pmimat0009201ucgacagcacgacacugccuuc>hsa-mir-21-5pmimat0000076uagcuuaucagacugauguuga>hsa-mir-21-3pmimat0004494caacaccagucgaugggcugu>hsa-mir-6774-5pmimat0027448acuugggcaggagggacccuguaug>hsa-mir-6774-3pmimat0027449ucgugucccucuuguccacag>hsa-mir-23a-5pmimat0004496gggguuccuggggaugggauuu>hsa-mir-23a-3pmimat0000078aucacauugccagggauuucc>hsa-mir-3613-5pmimat0017990uguuguacuuuuuuuuuuguuc>hsa-mir-3613-3pmimat0017991acaaaaaaaaaagcccaacccuuc>hsa-mir-4730mimat0019852cuggcggagcccauuccaugcca>hsa-mir-3607-5pmimat0017984gcaugugaugaagcaaaucagu>hsa-mir-3607-3pmimat0017985acuguaaacgcuuucugaug>hsa-mir-224-5pmimat0000281caagucacuagugguuccguu>hsa-mir-224-3pmimat0009198aaaauggugcccuagugacuaca>hsa-mir-30a-5pmimat0000087uguaaacauccucgacuggaag>hsa-mir-30a-3pmimat0000088cuuucagucggauguuugcagc>hsa-mir-30c-5pmimat0000244uguaaacauccuacacucucagc>hsa-mir-30c-2-3pmimat0004550cugggagaaggcuguuuacucu>hsa-mir-30c-1-3pmimat0004674cugggagaggguuguuuacucc>hsa-mir-375mimat0000728uuuguucguucggcucgcguga當(dāng)前第1頁(yè)12