本發(fā)明涉及一種生物實(shí)驗(yàn)方法，尤其涉及一種枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是除先天性白內(nèi)障以外的所有類型白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。晶狀體上皮細(xì)胞相當(dāng)于晶狀體的外屏障，對(duì)晶狀體纖維起一定的保護(hù)作用，而且晶狀體上皮細(xì)胞擔(dān)負(fù)著晶狀體的生長(zhǎng)、分化和損傷修復(fù)，在保持整個(gè)晶狀體透明性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上起重要作用。已有研究證明晶狀體細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中易受到各種可避免或不可避免誘發(fā)因素的影響而發(fā)生晶狀體纖維將不再保持透明，繼而發(fā)生混濁,形成白內(nèi)障。晶狀體上皮細(xì)胞也是糖尿病性白內(nèi)障最早受累的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于高血糖外源性環(huán)境的刺激下，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡與增殖失去平衡而發(fā)生細(xì)胞凋亡，晶狀體內(nèi)環(huán)境代謝失衡，最終引起白內(nèi)障的發(fā)生。
白內(nèi)障手術(shù)治療已日臻完善及廣泛應(yīng)用，但仍然存在一定手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，因此尋找一種能治療及延緩白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的藥物是眼科一項(xiàng)重要的臨床及科學(xué)研究。白內(nèi)障的發(fā)生可能與遺傳、免疫因素及外傷、福射造成晶狀體正常的代謝失衡，發(fā)生晶狀體的混濁變性。由于其發(fā)病的多因性，但大概包括氧化應(yīng)激、滲透應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等方面，枸杞菊花對(duì)晶狀體具有抗氧化、清除自由基、抗凋亡等藥理活性。但現(xiàn)有技術(shù)中，采用枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞的方法尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此，需要一種新方法誕生。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問(wèn)題而提供一種枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞的方法。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的：
本發(fā)明包括以下步驟：
步驟一：原料選?。喝幭蔫坭?0克，杭白菊5克；
步驟二：枸杞提取液的制備：選取無(wú)蛀蟲(chóng)、無(wú)霉變的枸杞干果為原料，清洗晾干后，將每粒枸杞干果破碎成兩瓣，并置于加熱的容器(70℃-90℃)內(nèi)，之后向加熱的容器中加入枸杞干果，重量10倍的水(100ml)進(jìn)行靜置浸泡5-8小時(shí)，然后，加熱煮沸至容器內(nèi)水的體積減少一半，之后停止加熱，過(guò)濾除渣，得到枸杞提取液，備用；
步驟三：菊花提取液的制備：選取菊花原材料，除去雜質(zhì)后，放入清水中進(jìn)行振蕩清洗3-5min，撈出淋干后，置于菊花原材料重量50倍的95℃水中進(jìn)行漂燙30min，之后，降溫至75-80℃浸泡40min，然后，過(guò)濾除渣，得到菊花提取液，備用；
步驟四：晶狀體細(xì)胞培養(yǎng)液的制備：按照體積比，取2-3份步驟一得到的枸杞提取液和1-2份步驟二得到的菊花提取液進(jìn)行混合，之后，向混合液中加入干粉細(xì)胞培養(yǎng)基12.0g，至混合均勻，在室溫環(huán)境下進(jìn)行0.22μm過(guò)濾除菌，之后，轉(zhuǎn)至于100ml的培養(yǎng)瓶中用于晶狀體細(xì)胞的培養(yǎng)；
步驟四：晶狀體細(xì)胞的培養(yǎng)：用上述制備得到的培養(yǎng)基，添加胎牛血清、谷氨酰胺、丙酮酸鈉和青鏈霉素合劑等，并調(diào)整PH值為7.2-7.4，預(yù)熱備用，解凍晶狀體細(xì)胞于60cm培養(yǎng)皿預(yù)熱的培養(yǎng)基中，在飽和濕度、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜至貼壁，次日，換液繼續(xù)培養(yǎng)，等待細(xì)胞觀察及檢測(cè)。
進(jìn)一步，所述步驟三中，枸杞提取液與菊花提取液的混合配比為2:1；所述步驟三中，適合晶狀體細(xì)胞的干粉培養(yǎng)基為12.0g的DMEM/F12進(jìn)口培養(yǎng)基。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明是一種枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體上皮細(xì)胞的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用不同配比枸杞菊花提取液培養(yǎng)晶狀體細(xì)胞，提高細(xì)胞增殖能力，減少氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞凋亡的細(xì)胞培養(yǎng)方法，可用于指導(dǎo)養(yǎng)肝明目用藥的理論基礎(chǔ)，具有推廣應(yīng)用的價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
本發(fā)明包括以下步驟：
步驟一：原料選?。喝幭蔫坭?0克，杭白菊5克；
步驟二：枸杞提取液的制備：選取無(wú)蛀蟲(chóng)、無(wú)霉變的枸杞干果為原料，清洗晾干后，將每粒枸杞干果破碎成兩瓣，并置于加熱的容器(70℃-90℃)內(nèi)，之后向加熱的容器中加入枸杞干果，重量10倍的水(100ml)進(jìn)行靜置浸泡5-8小時(shí)，然后，加熱煮沸至容器內(nèi)水的體積減少一半，之后停止加熱，過(guò)濾除渣，得到枸杞提取液，備用；
步驟三：菊花提取液的制備：選取菊花原材料，除去雜質(zhì)后，放入清水中進(jìn)行振蕩清洗3-5min，撈出淋干后，置于菊花原材料重量50倍的95℃水中進(jìn)行漂燙30min，之后，降溫至75-80℃浸泡40min，然后，過(guò)濾除渣，得到菊花提取液，備用；
步驟四：晶狀體細(xì)胞培養(yǎng)液的制備：按照體積比，取2-3份步驟一得到的枸杞提取液和1-2份步驟二得到的菊花提取液進(jìn)行混合，之后，向混合液中加入干粉細(xì)胞培養(yǎng)基12.0g，至混合均勻，在室溫環(huán)境下進(jìn)行0.22μm過(guò)濾除菌，之后，轉(zhuǎn)至于100ml的培養(yǎng)瓶中用于晶狀體細(xì)胞的培養(yǎng)；
步驟四：晶狀體細(xì)胞的培養(yǎng)：用上述制備得到的培養(yǎng)基，添加胎牛血清、谷氨酰胺、丙酮酸鈉和青鏈霉素合劑等，并調(diào)整PH值為7.2-7.4，預(yù)熱備用，解凍晶狀體細(xì)胞于60cm培養(yǎng)皿預(yù)熱的培養(yǎng)基中，在飽和濕度、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜至貼壁，次日，換液繼續(xù)培養(yǎng)，等待細(xì)胞觀察及檢測(cè)。
進(jìn)一步，所述步驟三中，枸杞提取液與菊花提取液的混合配比為2:1；所述步驟三中，適合晶狀體細(xì)胞的干粉培養(yǎng)基為12.0g的DMEM/F12進(jìn)口培養(yǎng)基。
實(shí)施例1：枸杞10g加100ml超純水浸提、除渣；菊花5g加50倍超純水浸提、除渣，將兩者混合，按照1:1混合過(guò)濾，再加入干粉培養(yǎng)基，待晶狀體細(xì)胞培養(yǎng)。
實(shí)施例2：枸杞10g加100ml超純水浸提、除渣；菊花5g加50倍超純水浸提、除渣，將按照體積比為2:1混合，過(guò)濾，再加入干粉培養(yǎng)基，待晶狀體細(xì)胞培養(yǎng)。
實(shí)施例3：枸杞10g加100ml超純水浸提、除渣；菊花5g加50倍超純水浸提、除渣，將按照體積比為1:2混合，過(guò)濾，再加入干粉培養(yǎng)基，待晶狀體細(xì)胞培養(yǎng)。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。