本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種鹵化II型聚酮類抗生素化合物、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗生素在治療微生物感染和腫瘤等疾病方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，但是由于抗生素的濫用等諸多原因，臨床上發(fā)現(xiàn)的病原菌耐藥性問題越來越嚴(yán)重。例如，近年來世界各地出現(xiàn)多種“超級細菌”，它們對大多數(shù)抗生素都產(chǎn)生耐藥性，給臨床上病原菌感染等疾病的治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。目前，細菌耐藥、二次感染、不良反應(yīng)、過敏反應(yīng)等嚴(yán)重威脅著人類健康，如果不盡快采取行動，這可能會給人類帶來災(zāi)難性后果。因此，鑒于當(dāng)前日益嚴(yán)峻的抗菌形勢，加大抗生素研發(fā)力度，探索和研發(fā)新抗生素成為當(dāng)務(wù)之急。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種較強的抗耐藥金黃色葡萄球菌的鹵化II型聚酮類抗生素化合物。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:鹵化II型聚酮類抗生素化合物，結(jié)構(gòu)為：

該化合物具有Anthrabenzoxocinones型的結(jié)構(gòu)骨架類型。該化合物通過對鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2菌株(菌株保藏號：CGMCC 4.7321)發(fā)酵并分離得到，對革蘭氏陽性細菌如金黃色葡萄球菌及其耐藥菌具有很高的抑制活性，有望成為抗耐藥金黃色葡萄球菌藥物及其先導(dǎo)化合物而具有良好的藥用開發(fā)前景。

本發(fā)明提供的另一技術(shù)方案，鹵化II型聚酮類抗生素化合物的制備方法，包括有CGMCC登記號碼為CGMCC 4.7321的鏈霉菌。

本發(fā)明提供的另一技術(shù)方案，鹵化II型聚酮類抗生素化合物的應(yīng)用，用作抗耐藥金黃色葡萄球菌。

附圖說明

圖1為本發(fā)明化合物的紅外光譜圖；

圖2為本發(fā)明化合物的高分辨質(zhì)譜圖；

圖3為本發(fā)明化合物在MeOH-d4中的¹H-NMR譜圖；

圖4為本發(fā)明化合物在MeOH-d4中的¹³C-NMR譜圖；

圖5為本發(fā)明化合物在MeOH-d4中的DEPT譜圖；

圖6為本發(fā)明化合物在MeOH-d4中的HSQC譜圖；

圖7為本發(fā)明化合物在MeOH-d4中的HMBC譜圖；

圖8為本發(fā)明化合物在MeOH-d4中的H-H COSY譜圖；

圖9為本發(fā)明化合物在MeOH-d4中的ROESY譜圖；

圖10為本發(fā)明化合物在MeOH-d4中的CD譜；

圖11為化合物的抗耐藥金黃色葡萄球菌活性實物圖。

所用鏈霉菌的保藏單位：北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；

保藏編號：CGMCC 4.7321；

保藏時間：2016年06月02日。

具體實施方式

鹵化天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎的特點，使鹵化產(chǎn)物成藥潛力增大，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有6000余種具有結(jié)構(gòu)多樣的鹵化天然產(chǎn)物。它們中很大一部分具有抗生素的活性。由于鹵化產(chǎn)物在對抗耐藥菌感染方面有較大的臨床應(yīng)用潛力，如臨床上抗感染的萬古霉素，替考拉寧以及2014年美國FDA批準(zhǔn)上市的抗耐藥菌感染抗生素新藥達巴萬星，奧利萬星及泰地唑胺，它們都屬于鹵化天然產(chǎn)物。

本發(fā)明人從一株鏈霉菌Streptomyces sp.(此鏈霉菌保藏于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，登記號為：CGMCC 4.7321)次級代謝產(chǎn)物中分離一個Anthrabenzoxocinones類抗生素，經(jīng)紫外光譜、紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、圓二色譜及核磁共振等波譜數(shù)據(jù)仔細分析，確定為Anthrabenzoxocinones類的新氯化產(chǎn)物。

CGMCC 4.7321鏈霉菌：

1)、生物學(xué)命名、分類依據(jù)：

經(jīng)16S rRNA保守引物(27f/1492r)擴增，測序并在線比對分析和參考菌株Streptomyces sparsogenes strain NBRC 13086的同源性為99％，初步分類為鏈霉菌。

命名為：鏈霉菌Streptomyces sp.

2)、保藏單位：北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；

3)、保藏編號：CGMCC 4.7321；

4)、保藏時間：2016年06月02日；

5)、保藏地點：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號：中國科學(xué)院微生物研究所；

6)、特征：

i.氣生菌絲發(fā)達，米黃色菌落，邊緣粗糙，有皺褶；孢子數(shù)目偏少；mol％G+C＝73％。

分離培養(yǎng)基：

ii.固體GYM(ISP2)：葡萄糖4g，麥芽抽提物4g，酵母粉10g，碳酸鈣2g，瓊脂粉18g，加水至1000毫升，滅菌。

iii.建議培養(yǎng)條件：

固體GYM培養(yǎng)基：最適培養(yǎng)溫度28℃，建議培養(yǎng)時間：4天。

iv.16s RNA序列為：

TGCAGTCGAACGATGAAGCCGCTTCGGTGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCTGGTGAGGCATCTTACTGGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTTGTCCGtGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAaGgAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACATCGGAAACATCCAGAGATGGGTGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGAGGGAGTC。

7)、分離地點：

貴州省梵凈山自然保護區(qū)(海拔高度800m，東經(jīng)108°47′50″，北緯27°56′32″)。以下為本發(fā)明抗生素化合物的具體制備方法、化合物的確認(rèn)及其應(yīng)用的確定。

以下為本發(fā)明抗生素化合物的具體制備方法、化合物的確認(rèn)及其應(yīng)用的確定。

一、本發(fā)明的抗生素化合物的制備方法為：

1、發(fā)酵培養(yǎng)

將生長斜面的鏈霉菌Streptomyces sp.FJS31-2菌株接種于種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基為GYM固體培養(yǎng)基，(GYM固體培養(yǎng)基的制備方法為：用葡萄糖4g、麥芽抽提物4g、酵母粉10g、碳酸鈣2g、微量元素預(yù)混液0.5mL和1.8％瓊脂粉(w/v)，加入去離子水定容到1.0L，121℃高壓滅菌30min制成)，28℃培養(yǎng)48小時，然后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(配方與種子培養(yǎng)基相同)，在28℃培養(yǎng)17天。

2、提取分離

將上述的發(fā)酵培養(yǎng)基連同菌體搗碎，加入乙酸乙酯在旋轉(zhuǎn)搖床(160rpm)提取24小時，連續(xù)提取三次，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45℃回收乙酸乙酯溶劑，得到發(fā)酵物粗提物32g。

發(fā)酵物粗提物32g，正相硅膠柱層(硅膠100-200目，1.5Kg硅膠顆粒)，洗脫溶劑氯仿：丙酮(100％、95％、90％、80％、67％、50％、33％、0％)依次洗脫，將氯仿-丙酮為80％(v/v)的洗脫部分再經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析，100％甲醇洗脫得到的組分Ⅰ再經(jīng)過硅膠柱層析(100-200目)，石油醚：乙酸乙酯(v/v)洗脫，依次按以上順序洗脫，石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝10：1的洗脫部分再經(jīng)過HPLC 95％甲醇等度洗脫制備得化合物。

二、化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

為淺黃色粉末，易溶于甲醇，二甲亞砜等有機溶劑，如圖1所示，化合物的紅外光譜顯示，其紅外吸收3385cm^-1和1609cm^-1表明該化合物有羥基及羰基基團存在，此外紅外吸收峰1421^-1cm及1384cm^-1，該化合物還含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)；

如圖2所示，化合物的高分辨質(zhì)譜顯示，其高分辨負離子峰荷質(zhì)比527.0658和529.0652，暗示該化合物有分子式為C₂₇H₂₂Cl₂O₇，不飽和度為16。

如圖4、圖5、圖6所示，在¹³C NMR和DEPT譜以及HSQC譜中顯示，該化合物具有三個苯環(huán)，其碳質(zhì)子吸收信號分別為160.6，157.7，152.6，151.8，150.7，150.7，150.4，141.2，133.4，122.5，117.2，115.7，113.6，113.6，111.2，107.2，106.3和101.7；此外該化合物還 含有一個羰基基團，其信號在189.7；一個亞甲基(δ_C：39.4)；四級碳原子(δ_C：38.1，98.4)；如圖3所示，結(jié)合¹³H NMR核磁譜中化合物具有三個苯環(huán)單峰氫質(zhì)子信號[δ_H：6.82(1H,s),6.57(1H,s),6.17(1H,s)]；四個甲基峰信號[2.41(3H,s),1.51(3H,s),1.45(3H,s),1.36(3H,s)]；結(jié)合文獻調(diào)研表明該化合物具有ABX聚型骨架。該化合物與ABX骨架不同在于，它苯環(huán)上的兩個氫質(zhì)子被氯原子取代。

如圖7、圖8所示，HMBC譜和H-H COSY譜圖上，氫信號6.82(1H,s)與碳信號111.2和122.5相關(guān)，證明該質(zhì)子連接在ABX骨架的C-8位；δ_H 6.57(1H,s)與δ_C 106.3相關(guān)。

如圖9所示，在ROSEY譜圖上，δ_H 6.57(1H,s)和兩個甲基氫質(zhì)子信號1.36和1.45相關(guān)可以確定該氫質(zhì)子是連接在C-10位；δ_H 6.17(1H,s)與δ_C 113.6，115.7，133.4，150.7和152.6相關(guān)，證明了質(zhì)子6.17(1H,s)連接在C-4位上；最后質(zhì)子信號6.10(1H,s)有一個關(guān)鍵相關(guān)信號，它與碳信號98.4相關(guān)確定該質(zhì)子連接在C-16位上。綜合以上信息，可以確定氯原子在苯環(huán)上取代位置，2個氯原子分別取代了4以及12位上的氫原子，得到了該化合物的平面結(jié)構(gòu)。

如圖10所示，通過CD譜圖可以確定化合物的絕對構(gòu)型，CD譜圖顯示在239nm及283nm具有明顯的正科頓效應(yīng)，根據(jù)陳海燕等人的報道，表明該化合物C-16及C-6構(gòu)型為S，由此確定該化合物的結(jié)構(gòu)為：和化合物在MeOH-d4中的NMR數(shù)據(jù)如表1所示。系統(tǒng)命名該化合物為：(6s,16s)-4,12-dichloro anthrabenzoxocinone，由于此化合物為本發(fā)明人的首次發(fā)現(xiàn)，因此，發(fā)明人將次化合物命名為zunyimycin B。其二維立體表示為：

表1

三、化合物的應(yīng)用確定

采用紙片法對命名為zunyimycin B的該化合物進行抗菌活性測試，以耐藥鮑曼不動桿菌、 耐藥大腸桿菌、耐藥肺炎克雷伯桿菌、耐藥金黃色葡萄球菌為測活菌，甲醇和丙酮為陰性對照。結(jié)果如圖11所示，2為本發(fā)明的化合物，1、3為其他兩種化合物；4為丙酮；5為甲醇，表明，本發(fā)明的化合物均對耐藥金黃色葡萄球菌具有抑制作用，抑菌圈直徑為1.3mm。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。