本發(fā)明涉及生物制造領(lǐng)域。具體而言是一種利用聚球藻utex2973生產(chǎn)糖類化合物的構(gòu)建體、菌株與方法。
背景技術(shù)：
：代謝工程和合成生物學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，使得經(jīng)過(guò)代謝工程改造的異養(yǎng)微生物，如大腸桿菌或酵母，已經(jīng)可以將糖類原料發(fā)酵轉(zhuǎn)化成為許多種生物燃料(peralta-yahyaetal.2012)和生物基化學(xué)品(haraetal.2014)。與現(xiàn)有基于石化原料的化學(xué)品生產(chǎn)方式相比，基于糖原料的微生物發(fā)酵生產(chǎn)方式更環(huán)保且可持續(xù)，具有顯著的應(yīng)用潛力。雖然目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)品得到了廣泛的關(guān)注和發(fā)展，但是大部分產(chǎn)品的生產(chǎn)成本較高，目前僅有大約30種生物基化學(xué)品實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)(e4techetal.2015)。而生物化學(xué)品生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)可行性很大程度上依賴于糖原料成本。糧食作物如甘蔗、玉米等以及纖維素生物質(zhì)都已經(jīng)被成功地用作微生物發(fā)酵的原料(ziolkowska2014)。但是以糧食作物為原料用于微生物發(fā)酵存在了“與人爭(zhēng)糧、與糧爭(zhēng)地”的弊端，而且原料供應(yīng)受限。纖維素生物質(zhì)是自然界中含量最多的糖類物質(zhì)，因此纖維素近年來(lái)被認(rèn)為是具有前景的糖類原料(graham-rowe2011)。然而由于植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素和纖維素的降解和轉(zhuǎn)化成本較高，由纖維素作為原料的發(fā)酵產(chǎn)品與石油化工產(chǎn)品相比并沒(méi)有成本優(yōu)勢(shì)(ziolkowska2014)。因此，廉價(jià)且可持續(xù)獲得的糖類原料對(duì)當(dāng)今微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)仍然十分重要，且對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)廉價(jià)化學(xué)品更為重要。藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)藻)是一種能進(jìn)行植物型放氧光合作用的原核微生物，是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要初級(jí)生產(chǎn)者(hernandez-prietoetal.2014)。與高等植物相比，藍(lán)細(xì)菌具有生長(zhǎng)速度快、光合效率高、容易進(jìn)行遺傳改造等優(yōu)勢(shì)(zhouandli2010)。另外，水生的藍(lán)細(xì)菌可以用放置在不適宜耕種土地甚至漂浮在海洋中的培養(yǎng)器中進(jìn)行培養(yǎng)?；谶@些優(yōu)勢(shì)，藍(lán)細(xì)菌已經(jīng)在生產(chǎn)生物燃料、生物基化學(xué)品及糖類物質(zhì)方面展現(xiàn)了其巨大的潛力，具有廣泛的應(yīng)用前景(angermayretal.2015；guptaetal.2013；haysandducat2015；sarkarandshimizu2015)。蔗糖是微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇的主要糖類原料，目前主要在甘蔗中提取(balatandbalat2009)。已知至少有60種藍(lán)細(xì)菌菌株可以合成蔗糖，蔗糖主要是作為藍(lán)細(xì)菌應(yīng)對(duì)外界滲透脅迫的相容性物質(zhì)(balatandbalat2009)，也可作為穿梭于細(xì)胞之間的營(yíng)養(yǎng)糖分以及信號(hào)分子(hagemann2011)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)蔗糖的研究工作主要以集胞藻pcc6803和聚球藻pcc7942作為宿主菌，通過(guò)代謝工程改造來(lái)提高其蔗糖產(chǎn)量(duetal.2013；ducatetal.2012)。通過(guò)在聚球藻pcc7942表達(dá)大腸桿菌來(lái)源的質(zhì)子/蔗糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cscb，研究人員得到了目前藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)蔗糖的最高產(chǎn)量36.1mg/l/h(ducatetal.2012)。根據(jù)研究人員估算，如果能夠?qū)⒋斯こ叹笠?guī)模培養(yǎng)，其蔗糖年產(chǎn)量將是甘蔗的7倍(ducatetal.2012)。這些研究充分說(shuō)明利用藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠生產(chǎn)蔗糖的巨大潛力。藍(lán)細(xì)菌中的糖原已經(jīng)被證明可以作為糖類原料直接被微生物利用來(lái)生產(chǎn)乙醇(aikawaetal.2013)。除了作為藍(lán)細(xì)菌中主要的碳水化合物儲(chǔ)存物質(zhì)(allen1984)和黑暗條件下呼吸作用的能量來(lái)源(grundeletal.2012)，糖原還對(duì)藍(lán)細(xì)菌在缺氮、鹽脅迫及氧化脅迫的適應(yīng)中起到重要作用(grundeletal.2012；hickmanetal.2013；suzukietal.2010)。aikawa等報(bào)道了他們利用聚球藻pcc7002生產(chǎn)糖原的工作，在氮源減少、補(bǔ)加氯化鈉的培養(yǎng)條件培養(yǎng)7天，聚球藻pcc7002胞內(nèi)糖原積累速率為0.5g/l/d，這是目前文獻(xiàn)報(bào)道的藍(lán)細(xì)菌糖原最高產(chǎn)率(aikawaetal.2014)。由于糖原積累依賴于限制氮源的培養(yǎng)條件，大多數(shù)藍(lán)細(xì)菌糖原積累與細(xì)胞生物質(zhì)積累之間存在明顯的矛盾(aikawaetal.2014)。因此，為了實(shí)現(xiàn)使用藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)糖原，需要一個(gè)能夠同時(shí)快速積累糖原和生物質(zhì)的藍(lán)細(xì)菌菌株。聚球藻(synechococcuselongatus)utex2973，來(lái)源于美國(guó)德克薩斯大學(xué)藻種保藏中心(theculturecollectionofalgaeattheuniversityoftexasataustin)，是目前已報(bào)道的生長(zhǎng)速度最快的藍(lán)細(xì)菌(yuetal.2015)。雖然它與聚球藻pcc7942的基因組具有99.8％的同源性，在同樣的培養(yǎng)條件下聚球藻utex2973的生長(zhǎng)速度是聚球藻pcc7942的兩倍，并且可以更好地耐受室外的高光、高溫環(huán)境(yuetal.2015)。在38℃、500μe/m2/s，通入3％co2的條件下，聚球藻utex2973的代時(shí)為2.3h，與酵母的生長(zhǎng)代時(shí)相近(yuetal.2015)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是一種利用聚球藻生產(chǎn)糖類化合物的構(gòu)建體、菌株與方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：一種利用聚球藻utex2973生產(chǎn)糖類化合物的構(gòu)建體，構(gòu)建體包含有在聚球藻utex2973中具有活性的啟動(dòng)子，處于該啟動(dòng)子控制之下的質(zhì)子/蔗糖的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，用于篩選轉(zhuǎn)化體的抗生素抗性基因，以及用于基因組同源整合的同源臂。所述構(gòu)建體含有所述在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子上游的用于篩選藍(lán)細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的抗生素抗性基因。所述質(zhì)子/蔗糖的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?yàn)閟eqidno:1中所示的來(lái)源于大腸桿菌的cscb基因。所述抗生素抗性基因?yàn)槁让顾乜剐曰?，其例如顯示在seqidno:4中。所述在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子選自plac啟動(dòng)子。其它啟動(dòng)子舉例：ppete，pcpcb，pcpt，penyc4等。其它抗生素抗性基因列舉：卡那霉素抗性基因，壯觀霉素抗性基因，慶大霉素抗性基因等適用于藍(lán)細(xì)菌的抗生素抗性基因。所述用于基因組同源整合的同源臂為來(lái)源于聚球藻utex2973的ns3基因的c-末端序列(seqidno:2)和n-末端序列(seqidno:3)。其他同源臂列舉：來(lái)源于聚球藻utex2973的ns1基因的c-末端序列(seqidno:12)和n-末端序列(seqidno:13)；ns2基因的c-末端序列(seqidno:14)和n-末端序列(seqidno:15)。一種載體，其包含上述任一項(xiàng)的構(gòu)建體。所述載體選自下列質(zhì)粒，質(zhì)粒psk015，其于2016年3月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，sk028,分類命名大腸埃希氏菌，escherichiacoli保藏號(hào)為cgmccno.12192。一種包含上述任一項(xiàng)的構(gòu)建體的藍(lán)細(xì)菌。一種包含上述的載體轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌。所述藍(lán)細(xì)菌選自：于2016年3月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，藍(lán)細(xì)菌syn2973::cscb，分類命名為聚球藻synechococcussp.,其保藏號(hào)為cgmccno.12231。一種在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)糖類化合物的方法，在含有nacl或kcl的條件下培養(yǎng)任一項(xiàng)的藍(lán)細(xì)菌，從獲得的培養(yǎng)物中提取所需的糖類化合物。所述糖類化合物為蔗糖和糖原。所述藍(lán)細(xì)菌的培養(yǎng)條件為38℃，250μe/m2/s，通入3％co2，使用100-200mm的nacl或kcl對(duì)藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行鹽脅迫,于培養(yǎng)物細(xì)胞內(nèi)外獲得所需的糖類化合物；優(yōu)選為150mm。使用含有150mmkcl的培養(yǎng)基重懸藍(lán)細(xì)菌從而進(jìn)行半連續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)21天之后共積累了8.1g/l的胞外蔗糖。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供在光合微生物藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)利用太陽(yáng)能固定二氧化碳合成糖類化合物，合成糖類物質(zhì)的能量來(lái)自于太陽(yáng)能，碳源來(lái)自于二氧化碳。因此，利用本發(fā)明方式制備的生物基產(chǎn)品不會(huì)受到原料不足的制約，使用這種生物基產(chǎn)品不會(huì)增加碳排放，是真正的零排放生物基產(chǎn)品。具體是，本發(fā)明在光合生物藍(lán)細(xì)菌聚球藻utex2973中合成糖類化合物構(gòu)建體，包含所述構(gòu)建體的載體，包含所述構(gòu)建體或用所述載體轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌，以及在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)糖類化合物的方法。進(jìn)而使得在藍(lán)細(xì)菌聚球藻utex2973內(nèi)大量分泌蔗糖的同時(shí)也在胞內(nèi)積累大量的糖原，分泌到胞外的蔗糖以及在胞內(nèi)的糖原均可以回收用于微生物發(fā)酵。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的聚球藻utex2973與聚球藻pcc7942生物質(zhì)和糖原含量對(duì)比圖；其中，a為兩個(gè)菌株的生物質(zhì)積累情況；b為兩菌株在此培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)糖原的量；c為糖原分別占各自細(xì)胞干重的比例。圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的質(zhì)粒psk015的基本結(jié)構(gòu)；其中，在聚球藻utex2973的m744_rs12430基因上下游片段(ns3-n和ns3-c)之間有氯霉素抗性基因(cmr)、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cscb以及plac啟動(dòng)子。圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的加入iptg對(duì)syn2973::cscb蔗糖積累的影響圖；其中，a為是否加入iptg下的生長(zhǎng)曲線；b為藍(lán)細(xì)菌胞外蔗糖的積累情況；c為胞內(nèi)蔗糖的積累情況；d為胞外蔗糖占蔗糖總產(chǎn)量的百分比。圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的分別使用150mm的nacl或kcl鹽脅迫下聚球藻utex2973野生細(xì)胞的生物質(zhì)積累(a)及胞內(nèi)蔗糖積累情況(b)圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的基因工程菌株syn2973::cscb在使用150mmkcl進(jìn)行鹽脅迫下，半連續(xù)培養(yǎng)第一個(gè)生長(zhǎng)周期胞外蔗糖積累情況(a)以及生物質(zhì)分布情況(b)圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的基因工程菌株syn2973::cscb在使用150mmkcl進(jìn)行鹽脅迫下，半連續(xù)培養(yǎng)21天(7個(gè)周期)的生物質(zhì)情況(a)及胞外蔗糖積累情況(b)圖。序列表信息：seqidno:1：來(lái)源于大腸桿菌(escherichiacoli)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cscb)基因序列。seqidno:2：來(lái)源于聚球藻utex2973的ns3基因的c-末端序列。seqidno:3：來(lái)源于集聚球藻utex2973的ns3基因的n-末端序列。seqidno:4：質(zhì)粒psk015上的氯霉素抗性序列(ncbiid：nc_005923.1)。seqidno:5：引物ns3-f的序列。seqidno:6：引物ns3-r的序列。seqidno:7：?jiǎn)?dòng)子plac的序列。seqidno:8：?jiǎn)?dòng)子ppete的序列。seqidno:9：?jiǎn)?dòng)子pcpcb的序列。seqidno:10：?jiǎn)?dòng)子pcpt的序列。seqidno:11：?jiǎn)?dòng)子penyc4的序列。seqidno:12：來(lái)源于聚球藻utex2973的ns1基因的c-末端序列。seqidno:13：來(lái)源于集聚球藻utex2973的ns1基因的n-末端序列。seqidno:14：來(lái)源于聚球藻utex2973的ns2基因的c-末端序列。seqidno:15：來(lái)源于集聚球藻utex2973的ns2基因的n-末端序列。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例可以結(jié)合附圖使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。相關(guān)術(shù)語(yǔ)藍(lán)細(xì)菌(也稱為藍(lán)藻)是一類光合自養(yǎng)的原核微生物，其能夠利用太陽(yáng)能，固定二氧化碳為碳水化合物。質(zhì)子/蔗糖的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cscb)是能夠利用跨膜的質(zhì)子梯度特異性地運(yùn)輸蔗糖進(jìn)出細(xì)胞的通道蛋白。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，載體(vector)是指能夠?qū)na片段(目的基因)轉(zhuǎn)移到受者細(xì)胞中的一種自我復(fù)制的dna分子。接合轉(zhuǎn)移(conjugation)是指細(xì)菌細(xì)胞間通過(guò)直接細(xì)胞接觸或性鞭毛進(jìn)行的遺傳物質(zhì)的傳遞過(guò)程，適用于對(duì)非天然感受態(tài)的宿主細(xì)胞基因工程改造過(guò)程中。同源臂(homologyarms)是在對(duì)藍(lán)細(xì)菌遺傳改造的過(guò)程中，用于將啟動(dòng)子、處于該啟動(dòng)子控制之下的基因以及抗生素抗性基因，通過(guò)同源重組(homologousrecombination)整合到宿主藍(lán)細(xì)菌基因組的兩個(gè)dna片段；分為n-末端和c-末端。本發(fā)明的實(shí)施方案是利用在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)質(zhì)子/蔗糖的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在藍(lán)細(xì)菌中表達(dá)，利用藍(lán)細(xì)菌光合生物的特點(diǎn)，吸收光能固定二氧化碳，在鹽脅迫條件下合成并分泌蔗糖；同時(shí)利用聚球藻utex2973生長(zhǎng)速度快，可以在積累生物質(zhì)的同時(shí)大量積累胞內(nèi)糖原的特點(diǎn)，合成分泌蔗糖的同時(shí)在胞內(nèi)積累糖原。實(shí)施例1：用聚球藻utex2973生產(chǎn)糖原1.實(shí)驗(yàn)步驟(1)將聚球藻utex2973和pcc7942野生型藻株分別在柱式光反應(yīng)器培養(yǎng)：普通玻璃管，柱高580mm，直徑30mm，裝液量150ml(可裝約300ml)。初始接種濃度od730為0.05，培養(yǎng)基為bg11培養(yǎng)基(bg11培養(yǎng)基成分為1.5g/lnano3,40mg/lk2hpo4·3h2o,36mg/lcacl2·2h2o,6mg/l檸檬酸,6mg/l檸檬酸鐵銨,1mg/ledta二鈉鹽,20mg/lnaco3,2.9mg/lh3bo3,1.8mg/lmncl2·4h2o,0.22mg/lznso4·7h2o,0.39mg/lnamoo4·2h2o,0.079mg/lcuso4·5h2o和0.01mg/lcocl2·6h2o)；在38℃、250μe/m2/s光照、通入3％的co2空氣進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，取樣測(cè)試od730和糖原含量。而藍(lán)細(xì)菌生物質(zhì)(drycellweight，dcw，細(xì)胞干重)含量按1mlod730＝1.0的藻細(xì)胞約相當(dāng)于0.34mg換算。(2)糖原的檢測(cè)：將上述獲得藍(lán)細(xì)菌藻液離心后，用無(wú)菌水洗滌3次，重懸于30％(w/v)的koh，95℃溫浴2h,然后加入冷的乙醇至終濃度為70-75％(v/v)，置于冰上至少2h，用于沉淀糖原。然后4℃，10000g離心10分鐘，糖原沉淀用70％和98％的乙醇洗滌兩次，60℃，10min真空離心干燥，糖原溶于100mm醋酸鈉溶液(ph4.5)，加入糖化酶(novozyme,denmark)進(jìn)行糖化，60℃，2小時(shí)，將糖原轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，然后通過(guò)測(cè)定葡萄糖含量計(jì)算糖原含量。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在相同的培養(yǎng)條件(38℃、250μe/m2/s光照、通入3％的co2空氣)下，與聚球藻pcc7942相比，聚球藻utex2973的生物質(zhì)積累速度達(dá)到1.56gdcw/l/d，比pcc7942快約50％(圖1a)。積累生物質(zhì)的同時(shí)聚球藻utex2973糖原也迅速積累；在第22到51.5h，聚球藻utex2973糖原含量從細(xì)胞干重的14.7％上升到42.15％，糖原積累速率達(dá)到0.75g/l/d，高于目前文獻(xiàn)報(bào)道最高產(chǎn)率0.5g/l/d；最后在平臺(tái)期時(shí)其糖原含量達(dá)1.1g/l左右，占干重的51％以上。這些結(jié)果顯示了聚球藻utex2973更強(qiáng)的生物質(zhì)和糖原積累能力，證明了其作為生物發(fā)酵糖原料的潛力。實(shí)施例2：構(gòu)建用于導(dǎo)入聚球藻utex2973的載體psk015以ns3-f(5’-tcagccagctcgtcgtgatgtcgaaacccaagcc-3’)和ns3-r(5’-acagtcggcgtcacggcaacttgctccgcgtagg-3’)為引物對(duì)，以質(zhì)粒pns3-3bwithcscb(ducatetal.2012)為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增；并將pcr產(chǎn)物，與經(jīng)ecori/sali酶切，t4dna聚合酶補(bǔ)平的pbr322載體連接，從而得到重組質(zhì)粒psk015(圖2)。pcr擴(kuò)增的條件、體系：1、pcr擴(kuò)增體系10×擴(kuò)增緩沖液：5μl、4種dntp混合物(2.5mm)：4μl、ns3-f(20mm)：0.5μl、ns3-r(20mm)：0.5μl、質(zhì)粒模板dna(100ng/μl)：0.5μl、fastpfuflydna聚合：1μl、加雙蒸水至50μl；2、pcr擴(kuò)增條件：95℃5min、95℃30s、55℃30s、72℃3min(返回第二步，共30個(gè)循環(huán))、72℃10min。實(shí)施例3：聚球藻utex2973的接合轉(zhuǎn)移以及接合子的篩選1、取1ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(od730約為1.0)的聚球藻utex2973培養(yǎng)物，5000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞；并用新鮮的bg11培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，再將細(xì)胞重懸于100μlbg11培養(yǎng)基中。2、在lb培養(yǎng)基(10g/l蛋白胨，10g/l氯化鈉，5g/l酵母抽提物)中分別培養(yǎng)含有prl443質(zhì)粒和prl623質(zhì)粒的大腸桿菌hb101菌株，以及含有psk015質(zhì)粒的大腸桿菌hb101菌株的兩種菌株，將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(od600約為1.0)；各取1ml大腸桿菌培養(yǎng)物，5000rpm離心5分鐘收集菌體；并用新鮮的lb培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，再將細(xì)胞分別重懸于100μllb培養(yǎng)基中。3、將含有prl443質(zhì)粒和prl623質(zhì)粒的大腸桿菌hb101菌株、含有psk015質(zhì)粒的大腸桿菌hb101菌株、和聚球藻utex2973三種微生物細(xì)胞混合，均勻地涂布到鋪在bg11平板(未加抗生素)上的硝酸纖維素膜上，并置于30℃、30μe/m2/s光照條件下溫育12小時(shí)。4、將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到含有20μg/ml氯霉素的bg11平板上，并在30℃、30μe/m2/s的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。5、大約4～5天，將接合子從平板上挑出，在新鮮的bg11平板(含有20μg/ml氯霉素)劃線；待細(xì)胞富集后，再將它們接入到液體bg11(含20μg/ml氯霉素)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。6、將psk015質(zhì)粒按照常規(guī)方式接合轉(zhuǎn)移到野生型聚球藻utex2973后,得到的藻株命名為syn2973::cscb。所述質(zhì)粒psk015，其于2016年3月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmcc12192。實(shí)施例4：基因工程聚球藻utex2973合成并分泌蔗糖1、實(shí)驗(yàn)步驟(1)將上述獲得基因工程藻株syn2973::cscb在柱式光反應(yīng)器中培養(yǎng)；柱式光反應(yīng)器為普通玻璃管，柱高580mm，直徑30mm，裝液量150ml(可裝液約300ml)。初始接種濃度od730為0.05，培養(yǎng)基為bg11(補(bǔ)加20μg/ml氯霉素)，在38℃、250μe/m2/s光照、通入3％的co2空氣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。(2)藍(lán)細(xì)菌鹽脅迫：向上述步驟培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)末期的藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)基中添加使用bg11溶液配制的5mnacl，使得培養(yǎng)基中的nacl濃度為150mm。同時(shí)，向藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)物中加入iptg(異丙基硫代半乳糖苷)至終濃度為1mm；而以不加入iptg的上述培養(yǎng)物作為對(duì)照。鹽脅迫之后，連續(xù)取樣監(jiān)測(cè)藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外蔗糖含量。(3)藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)和胞外蔗糖提?。喝?ml上述鹽脅迫之后藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞藻液，8000rpm離心10min收集藻細(xì)胞。離心所得上清液，經(jīng)稀釋后用離子色譜檢測(cè)，即得到細(xì)胞外蔗糖含量。向細(xì)胞沉淀加入1ml80％乙醇混勻，65℃水浴4h。8000rpm離心10min，棄沉淀，上清用n2吹干，加入合適的ddh2o稀釋后，使用離子色譜進(jìn)行濃度測(cè)定，即得到細(xì)胞內(nèi)蔗糖含量。(4)離子色譜檢測(cè)蔗糖含量：使用離子色譜isc-3000(dionex,usa)，分析柱：ma1(dionex,usa)。流動(dòng)相為800mmnaoh溶液，流速0.4ml/min，蔗糖出峰約在28min處。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)由上述可見(jiàn)使用150mmnacl對(duì)syn2973::cscb藻株進(jìn)行鹽脅迫，同時(shí)比較了iptg加入對(duì)蔗糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不加入iptg時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)更好(圖3a)，并且胞外可以積累達(dá)3.2g/l的蔗糖(圖3b)。在使用1mmiptg誘導(dǎo)時(shí)，鹽脅迫下細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變差(圖3a)，同時(shí)蔗糖產(chǎn)量降低為約2g/l(圖3b)。而比較兩種條件下藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的蔗糖含量發(fā)現(xiàn)，加入iptg后，藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)蔗糖含量相對(duì)于對(duì)照顯著降低(圖3c)。通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，即使不加入iptg，syn2973::cscb藻株產(chǎn)生的蔗糖也有超過(guò)94％被分泌到細(xì)胞外；加入iptg，藻株蔗糖分泌的比例與對(duì)照相比稍高(圖3d)。這一結(jié)果說(shuō)明，導(dǎo)入cscb基因的藻株能夠非常有效地將其在鹽脅迫中積累的蔗糖分泌到胞外。實(shí)施例5：相同濃度氯化鈉和氯化鉀對(duì)聚球藻utex2973蔗糖合成的影響1、實(shí)驗(yàn)步驟(1)將聚球藻utex2973野生型藻株在柱式光反應(yīng)器中培養(yǎng)；柱式光反應(yīng)器為普通玻璃管，柱高580mm，直徑30mm，裝液量150ml(可裝液約300ml)。初始接種濃度od730為0.05，培養(yǎng)基為bg11，在38℃、250μe/m2/s光照、通入3％的co2空氣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。(2)藍(lán)細(xì)菌鹽脅迫：向上述培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)末期的野生型藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)基中添加使用bg11溶液配制的5mnacl或3mkcl，使得培養(yǎng)基中的鹽濃度為150mm。鹽脅迫之后，連續(xù)取樣監(jiān)測(cè)藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外蔗糖含量。(3)藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)蔗糖提取和離子色譜檢測(cè)蔗糖含量的方法參照實(shí)施例4。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)由上述可見(jiàn)分別使用150mm的nacl和kcl對(duì)聚球藻utex2973野生型進(jìn)行鹽脅迫，對(duì)比其胞內(nèi)、胞外蔗糖的積累情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聚球藻utex2973野生型藻株在150mmkcl脅迫下的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于150mmnacl脅迫(圖4a)，并且兩種鹽脅迫下細(xì)胞生產(chǎn)蔗糖的能力并沒(méi)有明顯區(qū)別(圖4b)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明kcl也能夠誘導(dǎo)藍(lán)細(xì)菌合成積累蔗糖，而kcl脅迫時(shí)藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)更好。實(shí)施例6：半連續(xù)培養(yǎng)模式下syn2973::cscb藻株的蔗糖合成1、實(shí)驗(yàn)步驟(1)將上述實(shí)施例獲得的基因工程藻株syn2973::cscb在柱式光反應(yīng)器中培養(yǎng)；柱式光反應(yīng)器為普通玻璃管，柱高580mm，直徑30mm，裝液量150ml(可裝液約300ml)。初始接種濃度od730為0.05，培養(yǎng)基為bg11(補(bǔ)加20μg/ml氯霉素)，在38℃、250μe/m2/s光照、通入3％的co2空氣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。(2)藍(lán)細(xì)菌鹽脅迫：向上述步驟培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)末期的藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)基中添加使用bg11溶液配制的3mkcl，使得培養(yǎng)基中的kcl濃度為150mm，在鹽脅迫下繼續(xù)培養(yǎng)。(3)之后，每3天重復(fù)如下操作：8000rpm離心10分鐘收集藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞；然后將細(xì)胞重懸于等體積的含有150mmkcl和20μg/ml氯霉素的新鮮bg11培養(yǎng)基中，繼續(xù)下一個(gè)培養(yǎng)周期(3天)。每個(gè)培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，取樣用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞外蔗糖含量。(4)離子色譜檢測(cè)蔗糖含量的方法參照實(shí)施例4。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在150mmkcl脅迫條件下，syn2973::cscb胞外蔗糖含量以24.64mg/l/h的速率線性增加(圖5a)。在kcl脅迫后第54.5h，syn2973::cscb向細(xì)胞外分泌的蔗糖含量占細(xì)胞干重的81.43％；與此同時(shí)，胞內(nèi)糖原含量占細(xì)胞干重的41.83％，這一比例與野生型菌株在nacl脅迫相同時(shí)間后的糖原含量相當(dāng)。這一結(jié)果表明，即使syn2973::cscb在鹽脅迫條件下合成并分泌了大量的蔗糖，其胞內(nèi)糖原含量仍然可以維持一定的比例；這顯示了聚球藻syn2973::cscb強(qiáng)大的糖類化合物合成能力。而該藻株的這一特點(diǎn)，使得將來(lái)利用該藻株生產(chǎn)蔗糖的同時(shí)，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞生物質(zhì)由于富含糖原也可以用作微生物發(fā)酵的原料。在半連續(xù)培養(yǎng)模式下，從第2個(gè)培養(yǎng)周期開(kāi)始syn2973::cscb細(xì)胞生長(zhǎng)狀況得到明顯改善；在經(jīng)過(guò)7個(gè)培養(yǎng)周期(21天)，syn2973::cscb生長(zhǎng)依舊良好(圖6a)。從蔗糖分泌的情況看，在前3個(gè)培養(yǎng)周期，蔗糖產(chǎn)量保持穩(wěn)定，約為2g/l；雖然隨后單位培養(yǎng)周期蔗糖產(chǎn)量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是在7個(gè)培養(yǎng)周期(21天)內(nèi)總共分泌了約8.70g/l的蔗糖。這些結(jié)果進(jìn)一步展示了聚球藻syn2973::cscb強(qiáng)大的糖類化合物合成能力。生物材料樣品保藏信息菌株保藏號(hào)保藏時(shí)間大腸桿菌sk028，其包含質(zhì)粒psk015cgmcc121922016年3月11日藍(lán)細(xì)菌syn2973::cscbcgmcc122312016年3月11日上述菌株均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，cgmcc)另外，上述實(shí)例中的啟動(dòng)子抗生素抗性基因、同源臂分別可由下述記載的啟動(dòng)子、抗生素抗性基因和同源臂替換；啟動(dòng)子為ppete，pcpcb，pcpt，penyc4等?？股乜剐曰?yàn)榭敲顾乜剐曰颍瑝延^霉素抗性基因，慶大霉素抗性基因等適用于藍(lán)細(xì)菌的抗生素抗性基因。同源臂為來(lái)源于聚球藻utex2973的ns1基因的c-末端序列和n-末端序列、來(lái)源于聚球藻utex2973的ns2基因的c-末端序列和n-末端序列。參考文獻(xiàn)aikawas,josepha,yamadar,izumiy,yamagishit,matsudaf,kawaih,changjs,hasunumat,kondoa(2013)directconversionofspirulinatoethanolwithoutpretreatmentorenzymatichydrolysisprocesses.energenvironsci6(6):1844-1849.doi:10.1039/c3ee40305jaikawas,nishidaa,hosh,changjs,hasunumat,kondoa(2014)glycogenproductionforbiofuelsbytheeuryhalinecyanobacteriasynechococcussp.strainpcc7002fromanoceanicenvironment.biotechnolbiofuels7:88.doi:10.1186/1754-6834-7-88allenmm(1984)cyanobacterialcellinclusions.annurevmicrobiol38(1):1-25.doi:10.1146/annurev.mi.38.100184.000245angermayrsa,roviraag,hellingwerfkj(2015)metabolicengineeringofcyanobacteriaforthesynthesisofcommodityproducts.trendsbiotechnol33(6):352-361.doi:10.1016/j.tibtech.2015.03.009balatm,balath(2009)recenttrendsinglobalproductionandutilizationofbio-ethanolfuel.applenerg86(11):2273-2282.doi:10.1016/j.apenergy.2009.03.015duw,liangfy,duanyk,tanxm,luxf(2013)exploringthephotosyntheticproductioncapacityofsucrosebycyanobacteria.metabolicengineering19:17-25.doi:doi10.1016/j.ymben.2013.05.001ducatdc,avelar-rivasja,wayjc,silverpa(2012)reroutingcarbonfluxtoenhancephotosyntheticproductivity.appliedandenvironmentalmicrobiology78(8):2660-2668.doi:10.1128/aem.07901-11e4tech,re-cord,wur(2015)fromthesugarplatformtobiofuelsandbiochemicals.finalreportfortheeuropeancommission:contractno.ener/c2/423-2012/si2012.673791.graham-rowed(2011)agriculture:beyondfoodversusfuel.nature474(7352):s6-s8.doi:10.1038/474s06agrundelm,scheunemannr,lockauw,zilligesy(2012)impairedglycogensynthesiscausesmetabolicoverflowreactionsandaffectsstressresponsesinthecyanobacteriumsynechocystissp.pcc6803.microbiology158(12):3032-3043.doi:10.1099/mic.0.062950-0guptav,rathask,sooda,chaudharyv,prasannar(2013)newinsightsintothebiodiversityandapplicationsofcyanobacteria(blue-greenalgae)—prospectsandchallenges.algalres2(2):79-97.doi:10.1016/j.algal.2013.01.006hagemannm(2011)molecularbiologyofcyanobacterialsaltacclimation.femsmicrobiolrev35(1):87-123.doi:10.1111/j.1574-6976.2010.00234.xharaky,arakim,okain,wakais,hasunumat,kondoa(2014)developmentofbio-basedfinechemicalproductionthroughsyntheticbioengineering.microbialcellfactories13(1):1-19.doi:10.1186/s12934-014-0173-5hayssg,ducatdc(2015)engineeringcyanobacteriaasphotosyntheticfeedstockfactories.photosynthesisres123(3):285-295.doi:10.1007/s11120-014-9980-0hernandez-prietoma,semeniukta,futschikme(2014)towardasystems-levelunderstandingofgeneregulatory,proteininteraction,andmetabolicnetworksincyanobacteria.frontgenet5:191.doi:10.3389/fgene.2014.00191hickmanjw,kotovickm,millerc,warrenerp,kaiserb,juristat,buddem,crossf,robertsjm,carletonm(2013)glycogensynthesisisarequiredcomponentofthenitrogenstressresponseinsynechococcuselongatuspcc7942.algalres2(2):98-106.doi:10.1016/j.algal.2013.01.008peralta-yahyapp,zhangf,delcardayresb,keaslingjd(2012)microbialengineeringfortheproductionofadvancedbiofuels.nature488(7411):320-328.doi:10.1038/nature11478sarkard,shimizuk(2015)anoverviewonbiofuelandbiochemicalproductionbyphotosyntheticmicroorganismswithunderstandingofthemetabolismandbymetabolicengineeringtogetherwithefficientcultivationanddownstreamprocessing.bioresourcesandbioprocessing2(1):17.doi:10.1186/s40643-015-0045-9suzukie,ohkawah,moriyak,matsubarat,nagaikey,iwasakii,fujiwaras,tsuzukim,nakamuray(2010)carbohydratemetabolisminmutantsofthecyanobacteriumsynechococcuselongatuspcc7942defectiveinglycogensynthesis.applenvironmicrobiol76(10):3153-3159.doi:10.1128/aem.00397-08yuj,libertonm,cliftenpf,headrd,jacobsjm,smithrd,koppenaaldw,brandjj,pakrasihb(2015)synechococcuselongatusutex2973,afastgrowingcyanobacterialchassisforbiosynthesisusinglightandco2.scirep5:8132.doi:10.1038/srep08132zhouj,liy(2010)engineeringcyanobacteriaforfuelsandchemicalsproduction.proteincell1(3):207-210.doi:10.1007/s13238-010-0043-9ziolkowskajr(2014)prospectivetechnologies,feedstocksandmarketinnovationsforethanolandbiodieselproductionintheus.biotechnolrep4:94-98.doi:10.1016/j.btre.2014.09.001序列表seqidno:1大腸桿菌(escherichiacoli)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cscb)基因序列atggcactgaatattccattcagaaatgcgtactatcgttttgcatccagttactcatttctcttttttatttcctggtcgctgtggtggtcgttatacgctatttggctgaaaggacatctagggttgacagggacggaattaggtacactttattcggtcaaccagtttaccagcattctatttatgatgttctacggcatcgttcaggataaactcggtctgaagaaaccgctcatctggtgtatgagtttcatcctggtcttgaccggaccgtttatgatttacgtttatgaaccgttactgcaaagcaatttttctgtaggtctaattctgggggcgctcttttttggcctggggtatctggcgggatgcggtttgcttgacagcttcaccgaaaaaatggcgcgaaattttcatttcgaatatggaacagcgcgcgcctggggatcttttggctatgctattggcgcgttctttgccggcatattttttagtatcagtccccatatcaacttctggttggtctcgctatttggcgctgtatttatgatgatcaacatgtgttttaaagataaggatcaccagtgcgtagcggcggatgcgggaggggtaaaaaaagaggattttatcgcagttttcaaggatcgaaacttctgggttttcgtcatatttattgttgggacgtggtctttctataacatttttgatcaacaactttttcctgtcttttatgcaggtttattcgaatcacacgatgtaggaacgcgcctgtatggttatctcaactcattccaggtggtactcgaagcgctgtgcatggcgattattccgttctttgtgaatcgggtagggccaaaaaatgcattacttatcggtgttgtgattatggcgttgcgtatcctttcctgcgcgctgttcgttaacccctggattatttcattagtgaagctgttacatgccattgaggttccactttgtgtcatatccgtcttcaaatacagcgtggcaaactttgataagcgcctgtcgtcgacgatctttctgattggttttcaaattgccagttcgcttgggattgtgctgctttcaacgccgactgggatactctttgaccacgcaggctaccagacagttttcttcgcaatttcgggtattgtctgcctgatgttgctatttggcattttcttcctgagtaaaaaacgcgagcaaatagttatggaaacgcctgtaccttcagcaatatag(a)序列特征：●長(zhǎng)度：1248堿基對(duì)●類型：脫氧核糖核酸(dna)●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：大腸桿菌seqidno:2聚球藻utex2973的m744_rs12430基因的c-末端序列(也包括一部分基因上游序列)(ncbiid：nz_cp006471.1)tcagccagctcgtcgtgatgtcgaaacccaagccaccctcagaggtgaaggccgcttcgagcacatcgggaagcgtgtcgacgacggtgctcggtgcctcgggtaagagccagatagatgcggtgacgttcaccgtcgcgatcgtggcgggaaccacggtcactgcgtccgttacaactcgcacgtcgtcggccagcacgactgactcgacggcttcgattagcccgggagaggcaaggccatcaggctcggtagacagaatgctgattaacacctcgccgggagcagggctgctcacagccgcgtccttcacccgtgggtcagccgtcagcgcttgatagcggtaccaggccgcaccgcctgcggtcgagctgcccttgatccgctcgatggtgcgatcgcgaagctcgccatccggctcattcggctgccgcaccacgccgtagaacgcggcaaggttgtcgaggtcggggccgtttgagtagcgaagcagtgtcgcaagaagtgcgtcgttgatccgctgacgcaggatcagctcgcgggctgcgcagacctccagcagcttgatgaccgggtcggattcgaggatggcggtgtagctggcgtcacgcgatcgcaggtcgtcgatcaagtcctgcaggatcagttcaaagtccagcgcttcgatgatggtgggcgcgggaatcgtagcaaagtcaagaacggtcatgagacgactaagccctccagcgtgatacgcctgccctcggggatgtagtagccgatcaggttcagctcgacttgaccagctgcgctggctgagacgatgcgaaccttctccagcttcagccgtggctcccagcgatcgagcgcttcagctgtggccgccaccaggtcaacgatgagggactggttgatcgg(a)序列特征：●長(zhǎng)度：900堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：聚球藻utex2973seqidno:3：聚球藻utex2973的m744_rs12430基因的n-末端序列(也包括一部分基因下游序列)(ncbiid：nz_cp006471.1)gacaagccggggcagacgtgagccgtagtcccgtcgccagacgcgggtgcccacgggcgtcgtcaggatgtccgtaattgactgccggaggtggtcaatgcccttcagctccttgccactgtcacggctcatgcctcgggtcattagtcgcccgctccggtatcttcactggcttcgatgattgccgccccgcagctgcagaggtcaccgatccgagcagtcggcctctggttggtaaagaccgtgcgactgccggtgatgatcgtgttcaagccatgcagggggcaggcgtgaaggtcatcctttcgggccacggggcggctgttgacgaaggtgtcgtcgctcccggtgatgatgatcccgccgtgatcggtcacgtcgtttagtcgagcgatgcctggcgtcgtagtcacgggtttaggtcaatacgacttgcggtcactgtaacgttgccctcggcggtcacgttaacgtcgccttgggcttcgacttgcgcctcctgcacaaggatcacaatccgtccttgggctgcggtgaggtcgatcttgtactcatgcgcttcgcggtcgtactggatgattgagtcatcctcgaactgcgtcttttggatcgtttctttgtcctcgatctgggggtagtcagtcgagaacgcgccgggcatcgcgaagccctgactgatctcgccggagggggccatcacgacgacggcctcaccgacctcgggcgcccaccagaaccgatccttgcccgctcgctgcgtgagccacggaatccagtcagtgaggagcagcgcctcgccgctctcctcgtcttcctcgatcgcgacacggatcagccccttgggatagtcagcctcggctaccctgcctacgcggagcaagttgccgtgacgccgactgt(a)序列特征：●長(zhǎng)度：900堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：聚球藻utex2973seqidno:4：氯霉素抗性序列atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggagttccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcactatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtctgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaa(a)序列特征：●長(zhǎng)度：660堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：質(zhì)粒pns3-3bwithcscbseqidno:5：引物ns3-f的序列tcagccagctcgtcgtgatgtcgaaacccaagccseqidno:6：引物ns3-r的序列acagtcggcgtcacggcaacttgctccgcgtaggseqidno:7：?jiǎn)?dòng)子plac的序列atcaaataaaacgaaaggctcagtcggaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctactctagtttcgaaaccccaggcttgacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaaggaggaaaaacatatgtctaga(a)序列特征：●長(zhǎng)度：327堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：pns3-3bwithcscbseqidno:8：?jiǎn)?dòng)子ppete的序列aaggattcatagcggttgcccaatctaactcagggagcgacttcagcccacaaaaaacaccactgggcctactgggctattcccattatcatctacattgaagggatagcaagctaatttttatgacggcgatcgccaaaaacaaagaaaattcagcaattaccgtgggtagcaaaaaatccccatctaaagttcagtaaatatagctagaacaaccaagcattttcggcaaagtactattcagatagaacgagaaatgagcttgttctatccgcccggggctgaggctgtataatctacgacgggctgtcaaacattgtgataccatgggcagaagaaaggaaaaacgtccctgatcgcctttttgggcacggagtagggcgttaccccggcccgttcaaccacaagtccctatagatacaatcgccaagaagt(a)序列特征：●長(zhǎng)度：435堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：集胞藻pcc6803seqidno:9：?jiǎn)?dòng)子pcpcb的序列ttcgttataaaataaacttaacaaatctatacccacctgtagagaagagtccctgaatatcaaaatggtgggataaaaagctcaaaaaggaaagtaggctgtggttccctaggcaacagtcttccctaccccactggaaactaaaaaaacgagaaaagttcgcaccgaacatcaattgcataattttagccctaaaacataagctgaacgaaactggttgtcttcccttcccaatccaggacaatctgagaatcccctgcaacattacttaacaaaaaagcaggaataaaattaacaagatgtaacagacataagtcccatcaccgttgtataaagttaactgtgggattgcaaaagcattcaagcctaggcgctgagctgtttgagcatcccggtggcccttgtcgctgcctccgtgtttctccctggatttatttaggtaatatctctcataaatccccgggtagttaacgaaagttaatggagatcagtaacaataactctagggtcattactttggactccctcagtttatccgggggaattgtgtttaagaaaatcccaactcataaagtcaagtaggagattaat(a)序列特征：●長(zhǎng)度：591堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：集胞藻pcc6803seqidno:10：?jiǎn)?dòng)子pcpt的序列ttaacaaaaaagcaggaataaaattaacaagatgtaacagacataagtcccatcaccgttgtataaagttaactgtgggattgcaaaa(a)序列特征：●長(zhǎng)度：88堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：集胞藻pcc6803seqidno:11：?jiǎn)?dòng)子penyc4的序列aaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcatacgctcacaattggtaccggtgataccagcatcgtcttgatgcccttggcagcaccctgctaaggaggcaacaag(a)序列特征：●長(zhǎng)度：155堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：人工合成dnaseqidno:12：來(lái)源于聚球藻utex2973的ns1基因的c-末端序列。tccctgctcgtcacgctttcaggcaccgtgccagatatcgacgtggagtcgatcactgtgattggcgaaggggaaggcagcgctacccaaatcgctagcttgctggagaagctgaaacaaaccacgggcattgatctggcgaaatccctaccgggtcaatccgactcgcccgctgcgaagtcctaagagatagcgatgtgaccgcgatcgcttgtcaagaatcccagtgatcccgaaccataggaaggcaagctcaatgcttgcctcgtcttgaggactatctagatgtctgtggaacgcacatttattgccatcaagcccgatggcgttcagcggggtttggtcggtacgatcatcggccgctttgagcaaaaaggcttcaaactggtgggcctaaagcagctgaagcccagtcgcgagctggccgaacagcactatgctgtccaccgcgagcgccccttcttcaatggcctcgtcgagttcatcacctctgggccgatcgtggcgatcgtcttggaaggcgaaggcgttgtggcggctgctcgcaagttgatcggcgctaccaatccgctgacggcagaaccgggcaccatccgtggtgattttggtgtcaatattggccgcaacatcatccatggctcggatgcaatcgaaacagcacaacaggaaattgctctctggtttagcccagcagagctaagtgattggacccccacgattcaaccctggctgtacgaataaggtctgcattccttcagagagacattgccatgcccgtgctgcgatcgcccttccaagctgccttgccccgctgtttcgggctggcagccctggcgttggggctggcgaccgcttgccaagaaagcagcgctccgccggctgccggatcccagcccttgggcttggcgatcgctcaaaccggcaatgcctctctgtttggtcaggaacagttggcgggtcttcagattgccaaagcagtctttgaacgacctgctactggtgttccgattgactttcgcttgcaggacagtggcagtgatga(a)序列特征：●長(zhǎng)度：1042堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：聚球藻utex2973seqidno:13：來(lái)源于集聚球藻utex2973的ns1基因的n-末端序列。tggatgtgatcggaaccctgagccgtcgtcctggaggtgaagtctaatgtttgaaacgatttttgcgctgctgattgttctaggcgctggcgccggggctggcagcttagtcctgcgcaatctctactacatctgccaacccagtgaaattttgatctttgctggcagtagtcgccgcagtagtgatggccgccgagttggctatcgcttggtcaagggcggcagcagcctgcgggtacctctgctggaaaaagcgctccgcatggatctgaccaacatgatcattgagttgcgcgtttccaatgccttctccaagggcggcattcccctgactgttgaaggcgttgccaatatcaagattgctggggaagaaccgaccatccacaacgcgatcgagcggctgcttggcaaaaaccgtaaggaaatcgagcaaattgccaaggagaccctcgaaggcaacttgcgtggtgttttagccagcctcacgccggagcagatcaacgaggacaaaattgcctttgccaaaagtctgctggaagaggcggaggatgaccttgagcagctgggtctagtcctcgatacgctgcaagtccagaacatttccgatgaggtcggttatctctcggctagtggacgcaagcagcgggctgatctgcagcgagatgcccgaattgctgaagccgatgcccaggctgcctctgcgatccaaacggccgaaaatgacaagatcacggccctgcgtcggatcgatcgcgatgtagcgatcgcccaagccgaggccgagcgccggattcaggatgcgttgacgcggcgcgaagcggtggtggccgaagctgaagcggacattgctaccgaagtcgctcgtagccaagcagaactccctgtgcagcaggagcggatcaaacaggtgcagcagcaacttcaagccgatgtgatcgccccagctgaggcagcttgtaaacgggcgatcgcggaagcgcggggggccgccgcccgtatcgtcgaagatggaaaagctcaagcggaagggacccaacggctggcggaggcttggcagaccgctggtgctaatgcccgcgacatcttcctgctccagaag(a)序列特征：●長(zhǎng)度：1099堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：聚球藻utex2973seqidno:14：來(lái)源于聚球藻utex2973的ns2基因的c-末端序列。ctgaaacggtgaagtttgcattgtttttaagcacgagccatcaacagtaagagcgatcgcgctgggacgatgtaatcgcgccgtaggcagggttttgcctcatccggcagatgacaagcttcaagattcggcagtgaagtatcgagcaagcgataccaaacgcggccgcgaggaggcctcggcaactggaagcgcaggtcttcccagtaagcattaaaggctaggtaaagccattcctgctggcgaggatggcagagactgacggccagactgtgggaccacagcgcccaatcgggttgtttgagtttgacgccatgccagatggcatagggacgacgcggatggggttcgttctgcagcagttcgttctgttggaacatcaccagcgactgggaaagttcaatcaggcggcgactgaacaccaagaaatcggcatggcgatcgcacagcgaccaatcaaaccagctgatctcattgtcttggcagtaggcgttattgttaccctgctgactgcgtttgacctcatcgcccatcgtcagcatcggtgtgccctgggcgaggaataacgtggcgagcaaattgcgctgctgccgttcccgtaagctcagaatcgtggggtcatcggtctcgccttcaatgccgtagttccagctgtagttgtcattggtcccgtcccgattgttctctccattggcaaagttgtgcttctggctatagctgactagatctcgcagcgtaaagccgtcatggcaggtgatgaagttaatggtgcgtccggcataccattggtctgtgctgtagacatcggggctacccagcaggcgttgactgagggcgtaagtacagccctgatctccacgccaaaaacgccgaatatcgtcccggaagggaccgttccaagtcccaa(a)序列特征：●長(zhǎng)度：907堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：聚球藻utex2973seqidno:15：來(lái)源于集聚球藻utex2973的ns2基因的n-末端序列。acggcagcgaaagggcgacggcgcgatcgccggtatggaaaacgcttgctgcagcatcagatcgatgcgatcgccgaagactgtgacctagatgaggaagcatgagcgaactgggcttgagtctgacggcgatcgcgatttttaccacgacggcattagctttggtgggaccaatgctgggtagttctccgctgctaccggcgggattgggttttagcctcttggtgctgttcagtctggatgcggtgacttggcaggggcggggtgccacgttactgctcgatggcattcagcagcgatcgcccgaatatcgtcagcggattttgcatcacgaagcgggtcactacttggtagcaaccgcgctggggttacccgtgacgggctacaccctctcagcgtgggaagcgctgcgccaaggacaacctggtcgcgggggtgtgcagttccaagcagctgcgctagaagccgaagccgcacaggggcaactcagtcagcgatcgctggaacagtggtgtcaggtgttgatggccggtgcagcggcagagcaactggtctacggcaacgtggaagggggagctgacgatcgcgcccagtggaaacaactgtggcggcaactcgatcgcaatcctgccgaagcggatttacgcagtcgctggggattgttacgggcgaagactttactggagcaacaacgtcccgcctacgatgctttggtggcggcgatggctgcagaggccagcattgaagactgcaatcaagcgatcgccactgcttgggtagaagaacctgcgatcgccgcttagtgaagagtccagaagattcccctcccctctcgcccaatggacaagggaaatgtgattcagcatgagtcaagtccccagtgcatggatgggtgtgcaatgacggacagaggctgttgactctcagttatccctgtaagccaaatcgtccgaaaatcaccagctgaaacggttagggttgcattgtttttaagcacgagccatcaacagtaagagcgatcgcgcaggaacggtttagtgtgtagttgcgg(a)序列特征：●長(zhǎng)度：1051堿基對(duì)●類型：dna●鏈型：?jiǎn)捂湣裢負(fù)浣Y(jié)構(gòu)：線性(b)分子類型：dna(c)假設(shè)：否(d)反義：否(e)最初來(lái)源：聚球藻utex2973。當(dāng)前第1頁(yè)12