本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種纖維素合酶基因的應(yīng)用，特別涉及一種蓮纖維素合酶基因NnuCESA4的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：纖維素是細(xì)胞壁的主要組成成分之一，也是評(píng)價(jià)造紙?jiān)闲阅軆?yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。植物細(xì)胞壁主要纖維素、半纖維素、木質(zhì)素三大成分組成，這三大組分是地球上最豐富的可再生資源，而纖維素是細(xì)胞壁的第一大組分，由均一的吡喃式D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成，其葡萄糖殘基約2000～25000個(gè)(PaulyM,KeegstraK(2010)Plantcellwallpolymersasprecursorsforbiofuels.CurrentOpinioninPlantBiology,95:305-312；PaulyM,KeegstraK(2008)Cell-wallcarbohydratesandtheirmodificationasaresourceforbiofuels.ThePlantJournal,54(4):559-568)。而這種β-1,4糖苷鏈由纖維素合酶催化合成。Richmond和Somerville在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)了10個(gè)纖維素合酶的編碼基因(現(xiàn)命名為AtCESA)(RichmondTA,SomervilleCR.(2000)Thecellulosesynthasesuperfamily1.PlantPhysiology,124:496-498)。AtCESA1，AtCESA2，AtCESA3，AtCESA5，AtCESA6和AtCESA9與植物初生壁的生物合成有關(guān)(ArioliT,PengL,BetznerA,etal.(1998)MolecularanalysisofcellulosebiosynthesisinArabidopsis.Science,279:717-720；BurnJE,etal.FunctionalanalysisofthecellulosesynthasegenesCESA1,CESA2,andCESA3inarabidopsis.PlantPhysiology,129(2):797-807；PagantS,etal.(2002)KOBITO1encodesanovelplasmamembraneproteinnecessaryfornormalsynthesisofcelluloseduringcellexpansioninarabidopsis.ThePlantCellOnline,14(9):2001-2013)，次生壁纖維素合酶基因復(fù)合體由AtCESA4，AtCESA7和AtCESA8構(gòu)成，這些基因的突變體都表現(xiàn)為坍塌的木質(zhì)部(irregularxylem，irx)(TurnerSR,SomervilleCR.(1997)CollapsedxylemphenotypeofArabidopsisidentifiesmutantsdeficientincellulosedepositioninthesecondarycellwall.PlantCell,9:689-701；SzyjanowiczPMJ,MckinnonI,TaylorNG,etal.(2004)Theirregularxylem2mutantisanallele ofkorriganthataffectsthesecondarycellwallofArabidopsisthaliana.ThePlantJournal,37(5):730-740)。擬南芥cesa4突變體和cesa8突變體次生細(xì)胞壁中的纖維素沉積出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷導(dǎo)致植株出現(xiàn)坍塌的木質(zhì)部細(xì)胞(TurnerSR,SomervilleCR(1997)CollapsedxylemphenotypeofArabidopsisidentifiesmutantsdeficientincellulosedepositioninthesecondarycellwall.PlantCell,9:689-701；TaylorNG,HowellsRM,HuttlyAK,etal.(2002)InteractionsamongthreedistinctCesAproteinsessentialforcellulosesynthesis.100(3):1450-1455)。目前，CESA的功能推測(cè)主要來自于基因表達(dá)、UDP-G結(jié)合實(shí)驗(yàn)(PearJR,KawagoeY,SchreckengostWE,etal.(1996)HigherplantscontainhomologsofthebacterialcelAgenesencodingthecatalyticsubunitofcellulosesynthase.ProcNatlAcadSciUSA,93(22):12637-12642)、突變分析(FagardM,DesnosT,DesprezT,etal.(2000)PROCUSTE1encodesacellulosesynthaserequiredfornormalcellelongationspecificallyinrootsanddark-grownhypocotylsofArabidopsis.ThePlantCell,12(12):2409-2424)及基因沉默實(shí)驗(yàn)(Burtonetal，2000)。蓮(Nelumbonucifera)屬睡蓮科(Nymphaeaceae)蓮屬(Nelumbo)多年生水生宿根草本植物。蓮葉柄中含有大量的纖維素，從中間折斷可拉出大量細(xì)長而有韌性的蓮纖維。蓮纖維的性能非常特殊，Pan等報(bào)道，兩段掰開的葉柄之間的纖維絲能被拉長至少十厘米而不斷開，每根纖維絲由二十根左右的細(xì)纖維絲組成，平行并以螺旋形式的分布在蓮葉柄的導(dǎo)管分子中(PanY,HanG,MaoZ(2011)TheanatomyoflotusfibersfoundinpetiolesofNelumbonucifera.AquaticBotany,95:167-171)。蓮纖維絲的成分中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量分別是41.4±0.29％，25.87±0.64％，19.56±0.32％(PanY,HanG,MaoZ(2011)StructuralcharacteristicsandphysicalpropertiesoflotusfibersobtainedfromNelumbonuciferapetioles.CarbohydPolym,85:188-195)。克隆出蓮的纖維素合酶基因，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究其功能表達(dá)，將有利于深入研究蓮纖維絲及纖維素的合成機(jī)理，進(jìn)而有目的地利用蓮纖維素合酶基因去改善一些林木樹種用于增加其纖維素含量，提高可利用性。蓮以及蓮纖維絲的藥學(xué)應(yīng)用、化學(xué)性能和物理結(jié)構(gòu)均被研究并報(bào)道過，也有蓮基因水平的研究，蓮的基因組于2013年公布(RayM,RobertV,YanlingL,etal.(2013)Genomeofthelong-livingsacredlotus(NelumbonuciferaGaertn.).GenomeBiology,14(5):R41)，這為蓮相關(guān)基因的克隆與功能研究提供了便利。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種蓮纖維素合酶基因NnuCESA4的應(yīng)用。鑒于蓮的葉柄中含有大量纖維絲且葉柄內(nèi)部、外部纖維素含量不一致的現(xiàn)象，為從基因表達(dá)程度方面入手進(jìn)行深入研究其纖維素合成，將蓮葉柄內(nèi)、外和葉片三個(gè)部位做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，進(jìn)而研究其纖維素合酶基因的表達(dá)。本發(fā)明的主要目的是將轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的一段在葉柄部位表達(dá)量比較高的纖維素合酶基因的表達(dá)情況。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的序列設(shè)計(jì)引物以蓮葉柄總cDNA為模板將此基因克隆出來并進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果行BLAST，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥的AtCESA4基因序列相似度最高，因此我們將之命名為NnuCESA4。然后從ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)訂購到擬南芥cesa4突變體(Salk_029940c)，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蓮中的NnuCESA4基因轉(zhuǎn)入到相應(yīng)的擬南芥突變體中檢測(cè)其功能互補(bǔ)情況，推斷該基因的功能表達(dá)情況，以便后續(xù)可有目的性的將該基因轉(zhuǎn)入到一些林木樹種用于增加其纖維素含量，提高可利用性。本發(fā)明通過構(gòu)建過表達(dá)載體及通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來研究其功能表達(dá)，確定該基因具有纖維素合酶功能并促進(jìn)植物次生細(xì)胞壁的纖維素合成。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供一種蓮纖維素合酶基因NnuCESA4在促進(jìn)纖維素合成中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種蓮纖維素合酶基因NnuCESA4在促進(jìn)次生細(xì)胞壁中纖維素合成中的應(yīng)用。所述的蓮纖維素合酶基因NnuCESA4的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。所述的蓮纖維素合酶基因NnuCESA4的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。上述應(yīng)用的具體過程如下：1.基因的獲得根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到了15個(gè)蓮的CESA基因序列，對(duì)這15個(gè)CESA基因進(jìn)行了RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)其中一條序列表達(dá)量特別高并且在葉柄內(nèi)外部位表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物以蓮葉柄總cDNA為模板將此基因克隆出來并進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果行BLAST，發(fā)現(xiàn)本序列與擬南芥的AtCESA4序列相似度最高，因此我們猜測(cè)其與次生細(xì)胞壁纖維素的合成密切相關(guān)，并將該基因命名為NnuCESA4，進(jìn)而搜索已公布的蓮基因組序列，發(fā)現(xiàn)本基因序列與NNU_10513序列相同。所述的引物序列如下：NnuCESA4-F：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAC CGGCCTAATCGCCG-3′；NnuCESA4-R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGCACTCCACTCCACATTGC-3′。2.載體的構(gòu)建將擴(kuò)增的NnuCESA4的cDNA構(gòu)建至過表達(dá)載體pEarlyGate100中組成雙元表達(dá)載體，得到過表達(dá)重組質(zhì)粒；該載體攜帶花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子，并具有除草劑抗性，可供轉(zhuǎn)基因植物的篩選。3.轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將上述得到的過表達(dá)重組質(zhì)粒采用凍融法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101中，選取陽性菌并保存，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染擬南芥。4.轉(zhuǎn)化擬南芥cesa4：由于擬南芥cesa4純合突變體植株矮小，果莢畸形，幾乎不結(jié)種子，故選用無表型的cesa4雜合突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因并收取種子以備下一代陽性植株篩選，將上述得到的含有目的基因的陽性農(nóng)桿菌以浸染法轉(zhuǎn)化45天盛花期的cesa4雜合突變體植株，果莢成熟后收集種子，用除草劑抗性篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株，并通過基因鑒定選取基因背景為cesa4純合突變體的陽性植株，即為轉(zhuǎn)基因植株。以擬南芥cesa4純合突變體作為陰性對(duì)照。5.轉(zhuǎn)基因植株表型觀察擬南芥cesa4純合突變體植株矮小，蓮座葉窄短呈深綠色，果莢畸形短小，幾乎無種子，纖維素含量較低，并具有嚴(yán)重坍塌的木質(zhì)部結(jié)構(gòu)。通過轉(zhuǎn)蓮基因NnuCESA4入擬南芥cesa4純合突變體，對(duì)相同條件下種植的生長6到7周的轉(zhuǎn)基因植株、野生型植株及cesa4純合突變體植株的主莖高度、蓮座葉大小及果莢狀態(tài)進(jìn)行比較觀察并記錄。轉(zhuǎn)基因植株長出了少量比野生型短小但能正常結(jié)種子的果莢，蓮座葉長度比cesa4純合突變體增長了92％，并且莖稈高度也增長了47％。為了觀察木質(zhì)部變化，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的主莖橫切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，cesa4純合突變體原本坍塌比較嚴(yán)重的木質(zhì)部細(xì)胞在蓮NnuCESA4基因的轉(zhuǎn)入后得到了部分恢復(fù)。用硝酸乙醇法測(cè)定擬南芥主莖的纖維素含量，測(cè)定結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因植株的纖維素含量比cesa4純合突變體增長了1.16倍，但尚未恢復(fù)至野生型程度。結(jié)果表明：通過進(jìn)化樹分析和轉(zhuǎn)基因技術(shù)及互補(bǔ)植株表型分析確定蓮基因NnuCESA4具有纖維素合酶功能，能參與次生細(xì)胞壁中纖維素的合成。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：(1)本發(fā)明擴(kuò)增得到蓮基因NnuCESA4，并得到了含有蓮基因NnuCESA4的過表達(dá)載體。(2)本發(fā)明得到了蓮基因NnuCESA4轉(zhuǎn)擬南芥cesa4純合突變體的陽性轉(zhuǎn)基因植株。(3)本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因植株、純合突變體植株與野生型植株對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該基因能部分互補(bǔ)擬南芥cesa4純合突變體的表型，具有纖維素合酶的功能，促進(jìn)纖維素的合成，并確定該基因參與植物次生細(xì)胞壁中纖維素的合成。附圖說明圖1是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中15個(gè)NnuCESA基因在不同部位的表達(dá)量；其中，T1，T2，T3分別是葉片、葉柄外部和葉柄內(nèi)部。圖2是15個(gè)NnuCESA基因的在不同部位的RT-qPCR結(jié)果；其中，T1，T2，T3分別是葉片、葉柄外部和葉柄內(nèi)部。圖3是表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。圖4是cesa4純合突變體、轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株表型對(duì)比圖；其中，圖A中從左至右分別為cesa4純合突變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株；圖B中從下至上三排分別為cesa4純合突變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的蓮座葉片；圖C中從下至上三排分別為cesa4純合突變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的果莢。圖5是cesa4純合突變體、轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株莖部橫切切片對(duì)比圖。其中，A，B，C分別為cesa4純合突變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的莖部橫切面甲苯胺藍(lán)染色圖，箭頭所指的部位為木質(zhì)部細(xì)胞。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)施例1：蓮NnuCESA4基因序列的獲得先將蓮花葉柄內(nèi)、外和葉片三個(gè)部位做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到各基因片段在不同 部位的表達(dá)量，找出15個(gè)CESA基因片段的表達(dá)量(結(jié)果見圖1)，并做RT-qPCR驗(yàn)證(結(jié)果見圖2)，各基因在不同部位的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果趨勢(shì)基本一致，其中一段CESA基因序列表達(dá)量特別高并且在莖稈內(nèi)部和外部的表達(dá)量均高于葉片部位，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物以葉柄總cDNA為模板將此基因克隆出來并進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果行BLAST,發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥中參與次生細(xì)胞壁纖維素合成的基因AtCESA4相似度極高，因此我們推測(cè)該基因應(yīng)該參與次生細(xì)胞壁中纖維素的合成，并將其命名為NnuCESA4,通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本基因序列與蓮基因組網(wǎng)站(http://lotus-db.wbgcas.cn/)中的基因NNU_10513序列相同。實(shí)施例2：蓮葉柄的總RNA的提取用RNA提取試劑盒(OMEGA)分別提取蓮葉柄的總RNA。詳細(xì)步驟參考試劑盒說明書。實(shí)施例3：蓮總cDNA的獲得以蓮葉柄總RNA為模板采用OMEGA反轉(zhuǎn)錄試劑盒得蓮總cDNA，詳細(xì)步驟按照試劑盒使用說明書操作。實(shí)施例4：目的片段的擴(kuò)增以蓮基因NnuCESA4的mRNA為模板設(shè)計(jì)兩端引物，并在引物兩端加上用于構(gòu)建載體的Gateway接頭引物。上下游引物分別為：NnuCESA4-F：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGACCGGCCTAATCGCCG-3′；NnuCESA4-R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGCACTCCACTCCACATTGC-3′；以蓮葉柄總cDNA為模板，在退火溫度為52℃及延伸溫度為72℃的程序下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后純化并保存。實(shí)施例5：載體構(gòu)建連接采用Gateway雙元載體構(gòu)建方法，將實(shí)施例4中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體質(zhì)粒pDONR207(購買于ABRC，http://abrc.osu.edu/)進(jìn)行BP重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(市售)并得到陽性菌，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后進(jìn)行 質(zhì)粒測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒與pEarlyGate100(購買于ABRC，http://abrc.osu.edu/)(該載體攜帶花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子，并具有除草劑抗性，可供轉(zhuǎn)基因植物的篩選)進(jìn)行LR重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并得到陽性菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測(cè)序，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒保存?zhèn)溆?。表達(dá)載體構(gòu)建示意圖如圖3所示。測(cè)序結(jié)果如SEQIDNO:2所示，與基因NnuCESA4(基因ID為NNU_10513)中序列相同。實(shí)施例6：轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV31011.將根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)細(xì)胞(市售)冰上融化，加入1至5μL(<300μg)實(shí)施例5中的重組質(zhì)粒，輕彈混勻，冰浴15min。2.將上述混合物轉(zhuǎn)移至液氮中急凍5min，再37℃熱激5min，迅速轉(zhuǎn)移至冰上5min。3.加入800μL無抗性的LB液體培養(yǎng)基，28℃，200rpm搖4h。4.5000rpm，離心1min，棄700μL上清，其余重懸，取200μL涂布于LB固體培養(yǎng)基(Rif+：50μg/mL，Gen+：15μg/mL)，28℃倒置培養(yǎng)2天。5.選取陽性菌落并小搖保菌。實(shí)施例7：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染擬南芥1.選用抽苔十天后的擬南芥(Arabidopsisthaliana)cesa4雜合突變體植株，保持較高濕度，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。2.在LB培養(yǎng)基中分別復(fù)蘇上述帶有重組質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌，28℃，220rpm小遙24h。3.5000rpm離心15min收集菌體。同時(shí)配制1L重懸液(5％(w/v)Sucrose，0.02～0.05％Silwet-77)。4.棄上清，殘留菌液用5％(w/v)蔗糖重懸清洗，8000rpm，離心10min收集菌體，此步驟可再復(fù)一次。5.用重懸液重懸菌體至OD600位0.8，重懸液轉(zhuǎn)移至15cm培養(yǎng)皿中。6.將待轉(zhuǎn)化擬南芥的花序侵入重懸液中1min。7.將已轉(zhuǎn)化植株倒置平放，22℃，相對(duì)濕度60～70％暗培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng)，一個(gè)月后收取轉(zhuǎn)化種子。實(shí)施例8：篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株將實(shí)施例7中得到的種子播種，萌芽10天左右噴施除草劑，得到存活植株后通過DNA鑒定確定目的基因是否轉(zhuǎn)入及植株基因型背景，做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)基因后的cesa4純合突變體可結(jié)少量種子，待果莢成熟后單株收種并保存。實(shí)施例9：擬南芥觀察表型選取生長6～7周的野生型、cesa4純合突變體及轉(zhuǎn)基因植株來觀察對(duì)比植株表型變化，每種類型的植株選取十株以上并用標(biāo)尺來測(cè)量其莖稈高度、蓮座葉長度，觀察并拍照記錄果莢大小。結(jié)果如圖4和表1所示，結(jié)果表明，cesa4純合突變體的畸形果莢較多，幾乎無種子；轉(zhuǎn)基因植株長出了少量比野生型短小但能正常結(jié)種子的果莢，蓮座葉長度比cesa4純合突變體增長了92％，并且莖稈高度也增長了47％。表1野生型植株、純合突變體和轉(zhuǎn)基因植株纖維素含量比較結(jié)果野生型cesa4純合突變體轉(zhuǎn)基因植株莖稈纖維素含量(μg/mg)300±8.97A78.625±2.33C169.8±5.16B蓮座葉長度(cm)4.41±0.13A1.13±0.13C2.17±0.09B莖稈高度(cm)33.4±2.37A10.01±1.48C14.73±1.24B注：數(shù)值代表平均值+標(biāo)準(zhǔn)差(n＝4)，不同的字母代表顯著性差異(P<0.05；T檢驗(yàn))。實(shí)施例10：擬南芥主莖纖維素含量比較纖維素提取采用硝酸乙醇法。具體步驟為：先將收集的擬南芥主莖粉碎，烘干后經(jīng)苯醇抽提，稱取2g經(jīng)苯醇抽提的試樣，把試樣置于250mL潔凈干燥的錐形瓶中，加入25mL硝酸乙醇混合液，裝上回流裝置，放在沸水浴上加熱1h。在加熱過程中，應(yīng)隨時(shí)搖蕩錐形瓶，以防止試樣跳動(dòng)。煮沸1h后，移去冷凝管，將錐形瓶自水浴上取下，靜置片刻。待殘?jiān)练e瓶底后，用傾瀉法濾經(jīng)已恒重的1G2玻璃濾器，盡量不使試樣流出。用真空泵將濾器中的濾液吸干，再用玻璃棒將流入濾器的殘?jiān)迫脲F形瓶中重復(fù)施行上述步驟數(shù)次，直至纖維變白為止。最后將錐形瓶內(nèi)容物全部移入濾器，用10mL硝酸乙醇混合液洗滌殘?jiān)?，再用熱水洗滌，至洗滌液遇甲基橙不呈酸性反?yīng)為止。最后用乙醇洗滌兩次，吸干洗液，將濾器移入烘箱，于105±2℃烘干至恒重。纖維素含量計(jì)算：纖維素含量＝(m1-m2)/m0(1-w)×100％，式中m1為絕干纖維素與玻璃濾器的質(zhì)量，m2為絕干空玻璃濾器質(zhì)量，m0為風(fēng)干試樣的質(zhì)量，w為試樣的含水量。纖維素含量的結(jié)果見表1。從表1中可知，測(cè) 定結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因植株的纖維素含量比cesa4純合突變體增長了1.16倍，但尚未恢復(fù)至野生型程度。實(shí)施例11：擬南芥莖段橫切片的制作與觀察分別選取生長6～7周的野生型、cesa4純合突變體及轉(zhuǎn)基因植株主莖，在土壤表層以上3cm取1cm莖段，用3％(w/v)的瓊脂糖包埋莖段，在LeicaVT1000S震動(dòng)切片機(jī)上切片，厚度40μm，甲苯氨藍(lán)染色1～2min，置于載玻片上于光學(xué)顯微鏡下觀察比較并拍照。結(jié)果如圖5所示，A，B，C分別為cesa4純合突變體，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的莖部橫切面甲苯胺藍(lán)染色圖，箭頭所指的部位為木質(zhì)部細(xì)胞，圖A中的木質(zhì)部細(xì)胞坍塌變形比較嚴(yán)重，圖B中的木質(zhì)部細(xì)胞已得到部分恢復(fù)，但尚有部分畸形塌陷的細(xì)胞存在，未完全恢復(fù)至野生型。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3