本發(fā)明是關(guān)于一種用以產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原，尤其是關(guān)于一種鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原。本發(fā)明亦是關(guān)于包括該鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原的疫苗組合物，以及可專一性結(jié)合鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原的抗體。同時(shí)，本發(fā)明亦是關(guān)于編碼該鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原的分離核酸，包括該分離核酸的表達(dá)載體以及包括該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacterspp.)細(xì)菌廣泛地分布于自然界當(dāng)中，其大約分有20個(gè)種，屬于革蘭氏陰性桿菌。其中，鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是最常見(jiàn)且被研究的菌種，他們能夠在各種濕潤(rùn)或干燥的物體表面上生存，目前已是醫(yī)院環(huán)境里最常引起院內(nèi)感染的病原之一。鮑氏不動(dòng)桿菌是一伺機(jī)性病原菌，其對(duì)于免疫力正常的宿主而言是無(wú)害的，但在宿主免疫力下降時(shí)，此細(xì)菌就容易引起感染，造成疾病。舉凡手套、針筒、針頭、推車、呼吸器、床鋪、柜架、水槽、地板、空調(diào)出風(fēng)回風(fēng)口，甚至連聽(tīng)診器、病歷都可能存有鮑氏不動(dòng)桿菌，而在潮濕溫暖的飲水、食物以及和排水道中，或是人體上，例如皮膚、腋下、結(jié)膜、口腔、上呼吸道、鼻咽及腸胃道、尿道等，更是容易見(jiàn)到鮑氏不動(dòng)桿菌的蹤跡。接觸到這些細(xì)菌的病患或家屬，經(jīng)常就在抵抗力變?nèi)鯐r(shí)成為發(fā)病的宿主。特別的是，伺機(jī)性病原菌在進(jìn)行侵入性治療例如插管、手術(shù)時(shí)，更增加了院內(nèi)感染的機(jī)率，成為病人健康與醫(yī)護(hù)的一大隱憂。一般對(duì)于細(xì)菌的感染，其治療方法是使用抗生素。然而，由于抗生素的濫用，該些細(xì)菌逐漸產(chǎn)生抗藥性而難以消滅，目前，為了對(duì)抗越來(lái)越多院內(nèi)感染而對(duì)抗生素具有抗藥性的細(xì)菌，患者必須更換抗生素種類或使用昂貴的新型抗生素，若細(xì)菌的抗藥性繼續(xù)發(fā)展演化，將來(lái)恐怕會(huì)面臨無(wú)有效抗生素可用的狀況。關(guān)于造成院內(nèi)感染的鮑氏不動(dòng)桿菌，目前臨床上已分離出具有多重抗藥性的菌株，由于其在物體表面上仍可存活相當(dāng)一段時(shí)日，因此若無(wú)適當(dāng)?shù)闹委熁蝾A(yù)防方法，未來(lái)勢(shì)必成為院內(nèi)感染防治的棘手難題。如前所述，鮑氏不動(dòng)桿菌的無(wú)所不在與其抗藥性已逐漸成為院內(nèi)感染防治的重大難題，因此若能對(duì)人體施打疫苗產(chǎn)生預(yù)防力，即可有效避免鮑氏不動(dòng)桿菌的感染。一般疫苗是利用失去活性或減毒的病原體，注入人體內(nèi)，借由人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液性(例如抗體)與細(xì)胞性(例如：細(xì)胞毒性、輔助型或調(diào)節(jié)型T細(xì)胞)等免疫反應(yīng)，而可在將來(lái)病原體進(jìn)入宿主生物體后將該病原體中和后清除。然而，利用失去活性或減毒的病原體疫苗，對(duì)于某些疾病的預(yù)防是危險(xiǎn)的，尤其是缺乏該些病原體相關(guān)的病理?xiàng)l件與減毒特性時(shí)。因此，利用病原體上能夠產(chǎn)生免疫刺激反應(yīng)的抗原作為疫苗組合物，而不是引入整個(gè)的致病病原體，已是目前制備較具安全性疫苗的主要方法之一。然而，如何找尋到鮑氏不動(dòng)桿菌中具特異性的抗原而用以制作疫苗卻是困難的。雖然在先前的研究中，Pantophlet等人曾利用不動(dòng)桿菌脂多醣體的O抗原和相對(duì)應(yīng)的抗體，用以鑒定不動(dòng)桿菌菌株(PantophletR.etal.，ClinicalandDiagnosticLaboratoryImmunology，9，60-65，2002)，但其并未揭露其他抗原以及任何關(guān)于疫苗的應(yīng)用，而美國(guó)公告第6,562,958號(hào)雖然也公開(kāi)了大約4000種與鮑氏不動(dòng)桿菌相關(guān)的核苷酸和氨基酸序列，但這些序列極大部分并不清楚其是否為可表達(dá)的基因，也不知其功能為何。因此，為了預(yù)防鮑氏不動(dòng)桿菌的感染同時(shí)建立起精確的檢測(cè)診斷方式，找尋并利用能有效產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原目標(biāo)以及具專一性的檢測(cè)、治療用抗體，有其迫切的需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種鮑氏不動(dòng)桿菌間共有的多肽抗原，用以制備疫苗組合物以預(yù)防鮑氏不動(dòng)桿菌或具有相類似抗原病原菌的感染。本發(fā)明的另一目標(biāo)則同時(shí)提供一種可專一性對(duì)抗該多肽抗原的抗體，以作為檢測(cè)或治療之用。為了實(shí)現(xiàn)前述的目的，本發(fā)明提供一種分離的鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)多肽抗原，該多肽抗原包括至少一選自下列群組中的氨基酸序列：(a)SEQIDNO：1至5的氨基酸序列；(b)依據(jù)SEQIDNO：1、3、4、5進(jìn)行20％以下氨基酸取代、刪除或添加的氨基酸序列；(c)依據(jù)SEQIDNO：2進(jìn)行40％以下氨基酸取代、刪除或添加的氨基酸序列；以及(d)依據(jù)(a)至(c)氨基酸序列的片段；其中，依據(jù)(b)至(d)氨基酸序列的多肽具有免疫刺激活性。前述SEQIDNO：1至5的氨基酸序列請(qǐng)參見(jiàn)序列表。在一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種對(duì)抗鮑氏不動(dòng)桿菌的抗體，該抗體可專一性地與前述的多肽抗原相結(jié)合。其中，該抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體。此外，該抗體除了具二輕鏈、二重鏈的一般完整抗體結(jié)構(gòu)外，其亦可為經(jīng)重組克隆但具有相同抗原識(shí)別專一性的抗體片段(antibodyfragment)，例如Fab、F(ab’)2、Fv或ScFv片段抗體。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種醫(yī)藥組合物，包括前述對(duì)抗鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原的抗體以及一藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明再一實(shí)施例中，提供一種檢測(cè)鮑氏不動(dòng)桿菌的方法，其步驟包括：提供一如前述可專一性地與前述的多肽抗原相結(jié)合的抗體，將其與待測(cè)樣品接觸后，利用檢測(cè)試劑或儀器，分析該抗體的結(jié)合狀況，以判定待測(cè)樣品中是否存有鮑氏不動(dòng)桿菌。該檢測(cè)方式可為西方墨點(diǎn)法或ELISA等常用的免疫反應(yīng)檢測(cè)方法。在本發(fā)明一實(shí)施例中，同時(shí)提供一種檢測(cè)鮑氏不動(dòng)桿菌的試劑盒，其包括如前所述的抗體。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種利用如前所述的鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原作為疫苗的用途，以及一種包括至少一前述鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原的疫苗組合物。該疫苗組合物，可進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受載體與/或佐劑。其中，“藥學(xué)上可接受載體”是指不影響有效成分藥理活性且對(duì)于投予的生物體無(wú)毒性的任何載體，除依據(jù)劑型種類所選用的賦形劑外，可包括但不限于：稀釋劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑、分散劑、增溶劑、抗菌劑、抗真菌劑與佐劑等免疫刺激劑，以及以上之組合。“佐劑”則是指不同于疫苗所使用的抗原組份，但可增加抗原反應(yīng)的物質(zhì)。佐劑可為但不限于戈布佐劑(Gerbuadjuvant)、分枝桿菌或棒狀桿菌、霍亂毒素、破傷風(fēng)類毒素或各種油水乳化物(例如：IDEC-AF)。此外該佐劑也可包括礦物鹽或礦物凝膠(例如：氫氧化鋁、磷酸鋁和鈣磷酸鹽)、表面活性物質(zhì)(例如：卵磷脂)以及免疫刺激物質(zhì)(例如：皂甙)、寡核苷酸、白細(xì)胞介素-2等。為了制備如前所述的多肽抗原，本發(fā)明在一實(shí)施例中，更提供一種分離的核酸，其編碼至少一選自下列群組中的氨基酸序列，該氨基酸序列為鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)多肽抗原：(a)SEQIDNO：1至5之氨基酸序列；(b)依據(jù)SEQIDNO：1、3、4、5進(jìn)行20％以下氨基酸取代、刪除或添加的氨基酸序列；(c)依據(jù)SEQIDNO：2進(jìn)行40％以下氨基酸取代、刪除或添加的氨基酸序列；以及(d)依據(jù)(a)至(c)氨基酸序列的片段；其中，依據(jù)(b)至(d)氨基酸序列的多肽具有免疫刺激活性。在一實(shí)施例中，前述的分離的核酸可包括至少一選自由SEQIDNO：6至10所組成的群組的序列。進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，可將前述的核酸克隆于該載體中，并連接有一可調(diào)控其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，借以表達(dá)多肽抗原。此處“調(diào)控”可直接調(diào)控、調(diào)節(jié)啟動(dòng)子(例如lacoperon)以啟動(dòng)DNA的轉(zhuǎn)錄以及后續(xù)的轉(zhuǎn)譯，或是間接調(diào)控、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯過(guò)程所需酶(例如聚合酶)或其他調(diào)節(jié)子的表達(dá)，以使DNA之轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯能夠進(jìn)行，而最后表達(dá)出多肽抗原。在一實(shí)施例中，本發(fā)明再提供一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞可轉(zhuǎn)染以前述的表達(dá)載體或是導(dǎo)入前述可表達(dá)多肽抗原的核酸，而使該宿主細(xì)胞表達(dá)出所需的多肽抗原。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明再提供一種檢測(cè)鮑氏不動(dòng)桿菌的試劑盒，其包括一引物對(duì)，該引物對(duì)可經(jīng)由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)針對(duì)含有鮑氏不動(dòng)桿菌的待測(cè)樣品中的模板核酸擴(kuò)增產(chǎn)生前述的分離的核酸或該核酸的片段，亦即，該引物對(duì)可擴(kuò)增該核酸的全長(zhǎng)或其中的片段。借此，除前述以抗體檢測(cè)鮑氏不動(dòng)桿菌菌體的存在外，亦可從分子層面檢測(cè)是否存有鮑氏不動(dòng)桿菌的核酸，而達(dá)到篩檢鮑氏不動(dòng)桿菌的目的。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中，經(jīng)二維電泳后利用西方墨點(diǎn)法與銀染檢測(cè)鮑氏不動(dòng)桿菌外膜具免疫誘導(dǎo)活性的抗原的結(jié)果圖。其中，(a)與(b)圖是分別以不同的人類血清進(jìn)行反應(yīng)，各圖中左側(cè)是西方墨點(diǎn)法分析結(jié)果圖，右側(cè)則為銀染結(jié)果圖，而箭頭所指處表示相對(duì)應(yīng)的蛋白位置。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中pET-NcsP與pET-TonB-R質(zhì)體表達(dá)的重組蛋白質(zhì)經(jīng)以孔雀藍(lán)染色與人體血清進(jìn)行西方墨點(diǎn)法分析的結(jié)果圖。其中，(a)圖是pET-NcsP質(zhì)體的表達(dá)；(b)圖是pET-TonB-R質(zhì)體的表達(dá)；“M”表示蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；“-”表示未加入IPTG，“+”表示有加入IPTG以誘導(dǎo)后續(xù)蛋白質(zhì)的表達(dá)；CB表示孔雀藍(lán)；HS-AB表示人類血清；“*”表示表達(dá)的重組蛋白。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中分別以抗原NcsP、TonB-R、Pase1與Pase2免疫小鼠后的存活率測(cè)試結(jié)果的比較圖。其中，(a)為施打TonB-R，(b)為NcsP，(c)為Pase1，而(d)則為Pase2，其中PBS為對(duì)照組。圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中多肽抗原關(guān)于MTT測(cè)試的結(jié)果圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例6中anti-GPI抗血清之殺菌力測(cè)試結(jié)果圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例6中以人體血清對(duì)重組GP1抗原進(jìn)行西方墨點(diǎn)法分析是結(jié)果圖。其中，行1為鮑氏不動(dòng)桿菌外膜蛋白A(控制組)，行2為T(mén)onB-R抗原，行3為GP1抗原。左圖為正常人血清(對(duì)照組)，右圖為鮑氏不動(dòng)桿菌感染的病人血清。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明所提供的分離的鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)多肽抗原，其中，該多肽抗原包括至少一選自下列群組中的氨基酸序列：(a)SEQIDNO：1至5的氨基酸序列；(b)依據(jù)SEQIDNO：1、3、4、5進(jìn)行20％以下氨基酸取代、刪除或添加的氨基酸序列；(c)依據(jù)SEQIDNO：2進(jìn)行40％以下氨基酸取代、刪除或添加的氨基酸序列；以及(d)依據(jù)(a)至(c)氨基酸序列的片段；其中，依據(jù)(b)至(d)氨基酸序列的多肽具有免疫刺激活性。前述關(guān)于多肽抗原的氨基酸序列以及相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列的序列識(shí)別號(hào)(SEQIDNO)，對(duì)照以多肽抗原名稱如下述表1所示。各序列識(shí)別號(hào)的氨基酸或核苷酸序列，請(qǐng)參見(jiàn)序列表。表1多肽抗原名稱氨基酸序列核苷酸序列NcsPSEQIDNO：1SEQIDNO：6TonB-RSEQIDNO：2SEQIDNO：7Pase1SEQIDNO：3SEQIDNO：8Pase2SEQIDNO：4SEQIDNO：9GP1SEQIDNO：5SEQIDNO：10其中，SEQIDNO：1至5是本發(fā)明實(shí)施例中可作為多肽抗原的氨基酸序列，而SEQIDNO：6至10則是其分別相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。作為本發(fā)明鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原的實(shí)施例，該多肽抗原可為(a)至(d)氨基酸序列群組中任一氨基酸序列或其組合的具有免疫刺激活性的多肽抗原，其中，除可包括SEQIDNO：1至5中任一氨基酸序列外，亦可包括進(jìn)行20％以下序列修飾的SEQIDNO：1、3、4、5，或是進(jìn)行40％以下序列修飾的SEQIDNO：2，抑或是SEQIDNO：1至5或前述經(jīng)修飾序列的片段。關(guān)于氨基酸序列選用的方式或組合及其比例，在此僅為例示，并未設(shè)有特別的限制。本專利說(shuō)明書(shū)中所稱的“分離的”，是指該物質(zhì)的型態(tài)與所伴隨的組份與自然界中所存在者并不相同，該物質(zhì)是經(jīng)分離或純化而與自然存在形態(tài)下所伴隨的組份分離，或是借由人工方式產(chǎn)生或制造者。本說(shuō)明書(shū)中所提及的“抗原”，是指一種能夠刺激生物體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)，亦即，是一種具有“免疫刺激活性”(immunostimulatoryactivity)的物質(zhì)?！懊庖叽碳せ钚浴?，則是指該抗原進(jìn)入生物體后，能夠引起體液性(humoral)反應(yīng)產(chǎn)生抗體，或是產(chǎn)生細(xì)胞性(cellular)反應(yīng)啟動(dòng)T細(xì)胞的作用，而使其能辨識(shí)并與該抗原結(jié)合作用，以及產(chǎn)生相關(guān)免疫分子等免疫反應(yīng)的特性。此等免疫反應(yīng)可由該抗原徑自誘導(dǎo)產(chǎn)生，或是通過(guò)佐劑的輔助而引起。因此，“鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原”，是指一種能在生物體內(nèi)針對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌多肽或與該多肽類似的氨基酸序列，而引起上述免疫反應(yīng)的抗原，且該抗原是一種多肽(polypeptide)。本專利說(shuō)明書(shū)中所稱的“氨基酸取代、刪除或添加”，是指以其他氨基酸取代原本氨基酸序列中的氨基酸，或刪除某些位置的氨基酸序列，或于某些位置插入一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸使序列變長(zhǎng)，或以上任何修飾后組合的類似物。該些類似物與原氨基酸序列經(jīng)比對(duì)后具有一定比例的相似度。其中，依據(jù)SEQIDNO：1、3、4、5可進(jìn)行20％以下氨基酸的取代、刪除或添加，較佳為10％以下，更佳為5％以下，最佳為1至5個(gè)氨基酸的取代、刪除或添加，使具有80％以上的相似度。而在SEQIDNO：2則可進(jìn)行40％以下氨基酸的取代、刪除或添加，較佳為20％以下，更佳為5％以下，最佳為1至5個(gè)氨基酸的取代、刪除或添加，使具有60％以上的相似度。本專利說(shuō)明書(shū)中所稱的“氨基酸序列之片段”，是指原氨基酸序列中所截取的某區(qū)段部分，其可為原序列中任何區(qū)域的截取，或截取后的組合，其態(tài)樣在此不包括前述20％或40％以下氨基酸的刪除。關(guān)于氨基酸序列的相似度，可利用現(xiàn)有計(jì)算機(jī)程序加以比對(duì)分析。例如Altschul等人(NucleicAcidsRes.25：3389-3402，1997)所描述的BLAST方式進(jìn)行。BLAST分析軟件可通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NationalCenterforBiotechnologyInformation，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)執(zhí)行之。本發(fā)明是利用tBLAST進(jìn)行氨基酸分析，比對(duì)時(shí)所設(shè)定的參數(shù)為：期望值(Expectthreshold)：10；字長(zhǎng)(wordsize)：3；查詢范圍內(nèi)的最大匹配(Maxmatchesinaqueryrange)：0；計(jì)分矩陣(Matrix)：BLOSUM62；既存(Existence)：11，延伸(Extension)：1；組成調(diào)整(Compositionaladjustments)：依條件成分得分矩陣調(diào)整(conditionalcompositionalscorematrixadjustment)；篩選(Filter)：低復(fù)雜性區(qū)域選定(Lowcomplexityregionsselected)；屏蔽(Mask)：未選擇(notselected)。本專利說(shuō)明書(shū)中所稱的“鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)”，是指依據(jù)AcinetobacterMolecularBiology(Ed.：UlrikeGerischer，CaisterAcademicPress，2008)所分類的Acinetobacterbaumannii種，其可包括ATCC17978以及下述表2中的6200、SDF等菌株(各株菌詳細(xì)資料請(qǐng)參網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？mode＝Undef&id＝470&IvI＝3&keep％20＝1&srchmode＝1&unlock)。表2是本發(fā)明鮑氏不動(dòng)桿菌中NcsP、TonB-R、Pase1、Pase2以及GP1五種多肽抗原與其他29株鮑氏不動(dòng)桿菌菌株中同源多肽保留序列相似度的比較。由表2的相似度比較結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，多肽抗原NcsP、TonB-R、Pase1、Pase2以及GP1，與大部分的鮑氏不動(dòng)桿菌株的相似度高達(dá)98～99％以上，僅其中多肽抗原TonB-R少部分為60％以上的相似度。由于序列相似度極高，且經(jīng)由后續(xù)殺菌力以及小鼠免疫保護(hù)力的測(cè)試，可證明本發(fā)明中的五種多肽抗原確實(shí)可作為鮑氏不動(dòng)桿菌間共有的多肽抗原，而可用以制備疫苗組合物以預(yù)防鮑氏不動(dòng)桿菌的感染。表2鮑氏不動(dòng)桿菌抗原的多肽可借由一般基因工程技術(shù)所制備。借由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)擴(kuò)增表達(dá)該多肽相對(duì)應(yīng)的DNA序列，再將其克隆至表達(dá)載體表達(dá)即可(可參Sambrooketal.，MolecularCloning：A-LaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，N.Y.，Second(1998)andThird(2000)Edition；GeneExpressionTechnology，MethodsinEnzymology，GeneticsandMolecularBiology，Methods，inEnzymology，Guthrie&Fink，AcademicPress，SanDiego，Calif.，1991，以及Hitzemanetal.，J.Biol.Chem.，255：12073-12080，1990)。此外亦可利用合成方式，制備出所需序列的多肽，相關(guān)制備方式可利用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
現(xiàn)有的方法為之。本發(fā)明分別采用免疫蛋白質(zhì)體技術(shù)與反向疫苗學(xué)的策略尋找出符合所需的鮑氏不動(dòng)桿菌抗原。以下將進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明鮑氏不動(dòng)桿菌多肽抗原的篩選、確認(rèn)，以及該抗原的免疫效果。實(shí)施例1抗原NcsP與TonB-R的篩選與確認(rèn)本實(shí)施例是以免疫蛋白質(zhì)體技術(shù)鑒定出抗原NcsP與TonB-R。首先，采取醫(yī)院中數(shù)個(gè)病患的血液，并分離出血清。以前述血清對(duì)臺(tái)灣分離的鮑氏不動(dòng)桿菌菌株的菌體總蛋白質(zhì)進(jìn)行西方墨點(diǎn)法分析(Westernblot)，初步篩選出內(nèi)含對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌具專一性的抗體的血清(以下稱：HS-AB)。另外，萃取、分離鮑氏不動(dòng)桿菌的外膜蛋白質(zhì)，進(jìn)行二維電泳分析，一式兩份，然后將其中一份膠片進(jìn)行銀染，另一份則以HS-AB進(jìn)行免疫檢測(cè)，其結(jié)果如圖1所示。對(duì)照免疫檢測(cè)墨點(diǎn)以及銀染的膠片，將相對(duì)應(yīng)位置的蛋白質(zhì)加以分離，再將該蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜儀分析。分析結(jié)果中，該蛋白質(zhì)樣品分?jǐn)?shù)最高的目標(biāo)蛋白質(zhì)分別為ABSDF品系的“推定LysM結(jié)構(gòu)域超族群(putativeLysMdomainsuperfamily)蛋白質(zhì)”(YP_001707847)以及ABACICU品系的“外膜受器(outermembranereceptor)”(YP_001845144)。依序列性質(zhì)分析，推測(cè)YP_001707847應(yīng)是一非典型的分泌性蛋白(nonclassicalsecretoryprotein)，而YP_001845144則為推定鐵載體受體蛋白(putativeferricsiderophorereceptorprotein)。為進(jìn)一步確認(rèn)此二抗原確實(shí)能為HS-AB所辨識(shí)，遂進(jìn)行以下基因克隆與表達(dá)蛋白的確認(rèn)反應(yīng)。首先，分別根據(jù)編碼YP_001707847與YP_001845144蛋白質(zhì)的基因序列設(shè)計(jì)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物，并以前述臺(tái)灣的鮑氏不動(dòng)桿菌臨床分離株為模板進(jìn)行菌落-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(colony-PCR)，將編碼此二抗原的DNA擴(kuò)增后克隆于pGEM-TEasy載體后進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果中，前者所擴(kuò)增的DNA序列(SEQIDNO：6)與YP_001707847基因序列間的相似度達(dá)98％，而后者所擴(kuò)增的DNA序列(SEQIDNO：7)與YP_001845144基因序列間的相似度則達(dá)99％。進(jìn)一步比對(duì)前述DNA序列所轉(zhuǎn)譯后的氨基酸序列，前者(SEQIDNO：1)與YP_001707847氨基酸序列間的相似度達(dá)99％，而后者(SEQIDNO：2)與YP_001845144氨基酸序列間的相似度一樣高達(dá)99％。證明所篩選到可表達(dá)的蛋白質(zhì)樣品應(yīng)即為YP_001707847與YP_001845144，故以下將具有SEQIDNO：1與2氨基酸序列的蛋白質(zhì)分別稱為“NcsP”與“TonB-R”。之后，另外將前述PCR擴(kuò)增后的DNA片段再分別克隆于pET-21表達(dá)質(zhì)體(克隆后分別命名為pET-NcsP與pET-TonB-R質(zhì)體)，送入大腸桿菌BL21(DE3)中，并以IPTG間接調(diào)控以進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，最后再以西方墨點(diǎn)法分析，分別以人體血清HS-AB檢測(cè)，確認(rèn)其表達(dá)狀況，其結(jié)果如圖2所示。由圖中可知，由NcsP與TonB-R的基因所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)皆可為人體血清HS-AB所辨識(shí)，因此可證實(shí)NcsP與TonB-R確實(shí)為HS-AB的目標(biāo)抗原。此結(jié)果更首度證實(shí)YP_001707847/NcsP與YP_001845144/TonB-R此二蛋白質(zhì)確系能表達(dá)而存在于鮑氏不動(dòng)桿菌中，且具抗原性而為病人抗血清所能辨識(shí)。此外，為確認(rèn)NcsP與TonB-R的基因是否存在于不同鮑氏不動(dòng)桿菌菌株間，遂將臺(tái)灣所搜集數(shù)百株的臨床菌株進(jìn)行西方墨點(diǎn)法分析，發(fā)現(xiàn)所有的菌株都可檢測(cè)到此蛋白質(zhì)，從中隨機(jī)挑取十株菌進(jìn)行PCR與測(cè)序分析，也確認(rèn)該些菌株都有此二基因序列。進(jìn)一步將NcsP與TonB-R的氨基酸序列分別與GenBank中的29株鮑氏不動(dòng)桿菌的序列比較后，更確認(rèn)了其序列于該些鮑氏不動(dòng)桿菌間有著相當(dāng)高的相似度。請(qǐng)參閱表2，NcsP(SEQIDNO：1)間的比對(duì)有高達(dá)99％的相似度，而TonB-R(SEQIDNO：2)間的比對(duì)也大多具有99％的相似度，僅其中部分為60％以上的相似度。因此，NcsP與TonB-R系普遍存在于不同鮑氏不動(dòng)桿菌菌株間，且具有極高的相似度。實(shí)施例2抗原Pase1與Pase2的篩選與確認(rèn)本實(shí)施例是以反向疫苗學(xué)策略篩選出抗原Pase1與Pase2。首先，以protease為關(guān)鍵詞搜尋ATCC17978的基因，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)分別被批注為“分泌性類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶(secretedtrypsin-likeserineprotease)”的A1S_2546(以下稱“Pase1”)與“推定醣蛋白內(nèi)切酶金屬蛋白酶(putativeglycoproteinendopeptidasemetalloprotease)”的A1S_0699(以下稱“Pase2”)。經(jīng)比對(duì)，A1S_2546/Pase1與A1S_0699/Pase2在各個(gè)鮑氏不動(dòng)桿菌的基因體中均有與其序列相似度達(dá)約96％以上的序列，但因功能未知，命名不盡相同。為驗(yàn)證此二DNA序列是否有表達(dá)，首先根據(jù)鮑氏不動(dòng)桿菌ATCC17978的基因組序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，將預(yù)期大小的產(chǎn)物克隆于pGEM-TEasy載體后進(jìn)行測(cè)序分析。由于可以獲得RT-PCR產(chǎn)物，因此證實(shí)了此兩個(gè)依序列所批注的Pase1與Pase2的基因確實(shí)會(huì)被轉(zhuǎn)錄表達(dá)出來(lái)。進(jìn)一步將Pase1與Pase2其氨基酸序列分別與GenBank中的29株鮑氏不動(dòng)桿菌的序列相比較，發(fā)現(xiàn)其序列于該些鮑氏不動(dòng)桿菌間也有著相當(dāng)高的相似度。請(qǐng)參閱表2，Pase1(SEQIDNO：3)間的比對(duì)有高達(dá)95％～99％的相似度，而Pase2(SEQIDNO：4)間的比對(duì)則具有92～100％的相似度。因此，Pase1與Pase2同樣普遍存在于不同鮑氏不動(dòng)桿菌菌株間，且有極高的相似度。之后，將前述PCR擴(kuò)增后的DNA片段分別克隆于pET-21表達(dá)質(zhì)體(克隆后分別命名為pET-Pase1與pET-Pase2質(zhì)體)中，于下述實(shí)施例中表達(dá)該些基因。實(shí)施例3以抗原NcsP、TonB-R、Pase1與Pase2免疫小鼠的存活率測(cè)試為了評(píng)估上述四個(gè)鮑氏不動(dòng)桿菌的蛋白質(zhì)是否可作為鮑氏不動(dòng)桿菌疫苗的組份，將分別克隆有pET-NcsP、pET-TonB-R、pET-Pase1與pET-Pase2表達(dá)載體的大腸桿菌BL21(DE3)，培養(yǎng)至OD600達(dá)0.8～1之間時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)間接誘導(dǎo)以進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。之后以Ni2+-親和管柱純化前述表達(dá)載體所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)(NcsP、TonB-R、Pase1與Pase2)，并以SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，利用于免疫小鼠。另外，則以西方墨點(diǎn)法及酶聯(lián)免疫分析法確定抗血清對(duì)各重組蛋白質(zhì)的專一性后，以鮑氏不動(dòng)桿菌ATCC17978進(jìn)行肺部攻毒試驗(yàn)，觀察小鼠之存活情形，其存活率結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，施打本發(fā)明實(shí)施例抗原的小鼠存活率明顯高于僅施打PBS的對(duì)照組，而各組的五天存活率分別為：PBS(10～30％)、NcsP(90％)、TonB-R(80％)、Pase1(80％)、Pase2(90％)。很明顯可以看出本發(fā)明的多肽抗原能夠?qū)κ┐虻男∈螽a(chǎn)生優(yōu)秀的免疫保護(hù)力，故其是足以作為疫苗組合物的多肽抗原。特別的是，雖然攻毒的菌株ATCC17978其相當(dāng)于TonB-R的氨基酸序列與施打的重組TonB-R序列的相似度只有61％，仍具有顯著的保護(hù)效果。實(shí)施例4抗原NcsP、TonB-R、Pase1與Pase2的安全性測(cè)試為確認(rèn)本發(fā)明多肽抗原是否對(duì)生物體具有毒性，遂取先前所純化的重組蛋白質(zhì)NcsP、TonB-R、Pase1與Pase2進(jìn)行細(xì)胞存活率測(cè)試(MTTassay)。MTT測(cè)試是以一般所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
所常用的方法進(jìn)行，例如利用前揭Sambrook等人所著Molecularcloning書(shū)中所描述的方法，并以人類A549細(xì)胞為受測(cè)細(xì)胞，其結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示上述四種蛋白對(duì)人類A549細(xì)胞并沒(méi)有毒性，因此是具安全性的抗原多肽，適于作為疫苗的組合物，而應(yīng)用于鮑氏不動(dòng)桿菌感染的預(yù)防。此外，雖然Pase1和Pase2被批注為“tyrpsin-likeprotease(類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶)”，但以QuantiCleaveTM檢測(cè)試劑盒(ThermoScientificPierce)進(jìn)行測(cè)試后發(fā)現(xiàn)，在0.5mg/mL的濃度下仍未檢測(cè)到此二蛋白質(zhì)具有蛋白酶的酶活性，以此結(jié)果配合前述MTT測(cè)試結(jié)果，更可確認(rèn)此二蛋白質(zhì)并不具細(xì)胞毒性。綜合以上結(jié)果，可確認(rèn)NcsP、TonB-R、Pase1與Pase2這四個(gè)多肽抗原在各鮑氏不動(dòng)桿菌菌株中應(yīng)是可表達(dá)的蛋白，且由于序列的相似度極高，對(duì)于不同鮑氏不動(dòng)桿菌的感染應(yīng)皆同具有極佳的保護(hù)效果，加上其不具細(xì)胞毒性的高安全性，顯示此四個(gè)多肽均足以作為廣效性鮑氏不動(dòng)桿菌疫苗的優(yōu)良抗原。實(shí)施例5抗原GP1的篩選與確認(rèn)本實(shí)施例同樣是以反向疫苗學(xué)策略篩選出抗原GP1。首先，以細(xì)菌脂蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(DOLOP)分析AIS_0556(以下稱GP1)，顯示其N端帶有一個(gè)脂化訊號(hào)的前導(dǎo)序列，應(yīng)系一脂蛋白，除此之外，Iwashkiw等人(IwashkiwJA，Seper2A，WeberBS，.ScottNE，VinogradovE，StratiloC，ReizBetal.，2012.IdentificationofageneralO-linkedproteinglycosylationsysteminAcinetobacterbaumanniianditsroleinvirulenceandbiofilmformation.PLoSPathogens，2012)發(fā)現(xiàn)在鮑氏不動(dòng)桿菌ATCC17978中此蛋白是具有糖化修飾的。本實(shí)施例以PCR擴(kuò)增GP1中第39-313氨基酸編碼的DNA片段，再將其克隆于pET21表達(dá)質(zhì)體中，送入E.coliBL21(DE3)后以IPTG間接誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，再以Ni2+-親和管柱純化的重組蛋白質(zhì)對(duì)小鼠進(jìn)行免疫注射，以取得的抗血清對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌的菌體蛋白質(zhì)進(jìn)行西方墨點(diǎn)法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有測(cè)試的菌株都可檢測(cè)到GP1蛋白質(zhì)。此外，將GP1氨基酸序列與GenBank中的29株鮑氏不動(dòng)桿菌的序列相比較，發(fā)現(xiàn)該些菌株的GP1間有高達(dá)95％～99％的相似度(請(qǐng)參閱表2)，證明GP1蛋白質(zhì)也是鮑氏不動(dòng)桿菌的保守抗原。實(shí)施例6以抗原GP1免疫小鼠后取得的抗血清的殺菌力分析為了評(píng)估GP1所表達(dá)的多肽抗原是否可作為鮑氏不動(dòng)桿菌疫苗的組份，除前述可利用鮑氏不動(dòng)桿菌直接感染小鼠進(jìn)行存活率分析的體內(nèi)試驗(yàn)外，在生物體外利用該抗原所誘發(fā)的抗體，對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌進(jìn)行殺菌力測(cè)試，分析其存活率，亦是一確認(rèn)疫苗有效性常用的方式。因此，在本實(shí)施例中，是以經(jīng)Ni2+-親和管柱純化后的重組蛋白GP1免疫小鼠后，以取得的抗血清(anti-GP1)進(jìn)行殺菌力分析。測(cè)試時(shí)，取約100CFU的鮑氏不動(dòng)桿菌置于含有50％抗血清的PBS中，在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)，觀察存活的菌數(shù)，其結(jié)果如圖5所示。以免疫前的血清為對(duì)照組，可發(fā)現(xiàn)anti-GP1處理后的菌數(shù)存活率明顯低于對(duì)照組，其效果甚至高于anti-NcsP，而僅剩18％，顯示anti-GP1具有優(yōu)異的殺菌效果，可證明GP-1能誘發(fā)具有保護(hù)效果的免疫反應(yīng)，因此可作為一個(gè)有效的疫苗抗原。此外，以鮑氏不動(dòng)桿菌感染的病人血清對(duì)此重組蛋白進(jìn)行西方墨點(diǎn)法分析后，如圖6所示，可發(fā)現(xiàn)有專一辨識(shí)訊號(hào)，顯示此蛋白質(zhì)的確可誘發(fā)人類的免疫反應(yīng)，更進(jìn)一步證明GP1是一可用做疫苗組份的多肽抗原。實(shí)施例7單克隆抗體的制備將前述各重組蛋白/多肽抗原，分別以Ni2+管柱純化后，取之進(jìn)行BALB/c小鼠的免疫注射，每個(gè)月間隔進(jìn)行3次，每次劑量為10-15μg。首次免疫時(shí)是加入以佛氏完全佐劑(Freund’scompleteadjuvant)，后續(xù)則以佛氏不完全佐劑進(jìn)行。在最后一次注射的4天后，將小鼠的脾臟取出，再將其中的脾臟細(xì)胞與Sp2/0-Ag14骨髓瘤(myeloma)細(xì)胞融合。進(jìn)行篩選，對(duì)于存活的融合細(xì)胞以ELISA以及西方墨點(diǎn)法進(jìn)一步篩選出具專一性的細(xì)胞株。該些個(gè)別針對(duì)本發(fā)明多肽抗原所篩選出的單克隆抗體，可進(jìn)一步作為試劑盒的組成，用以檢測(cè)鮑氏不動(dòng)桿菌的存在。檢測(cè)時(shí)，可利用所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
所熟知的方式進(jìn)行，將前述的單克隆抗體與待測(cè)樣品混合后，利用檢測(cè)試劑的呈色或儀器檢測(cè)吸光值、熒光值，分析該抗體的結(jié)合狀況，以判定待測(cè)樣品中是否存有鮑氏不動(dòng)桿菌。前述試劑盒中的單克隆抗體，可使用針對(duì)本發(fā)明中其中一種多肽抗原的單一單克隆抗體，亦可使用兩種以上針對(duì)其中一種多肽抗原或兩種以上多肽抗原所產(chǎn)生制備的多種單克隆抗體，以能多重確認(rèn)辨識(shí)關(guān)系，增加檢測(cè)之準(zhǔn)確性。另一方面，無(wú)論是針對(duì)本發(fā)明多肽抗原的單克隆抗體，或是多克隆抗體或是其抗體片段，亦可用于鮑氏不動(dòng)桿菌感染的治療，以所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
所熟知的一般方法，加上適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體，制備成可治療鮑氏不動(dòng)桿菌感染所引起疾病的醫(yī)藥組合物。利用于治療鮑氏不動(dòng)桿菌感染的醫(yī)藥組合物時(shí)，該些抗體以單克隆抗體為較佳。同樣地，所使用的單克隆抗體可為針對(duì)本發(fā)明中其中一種多肽抗原的單一單克隆抗體，亦可使用兩種以上針對(duì)其中一種多肽抗原或兩種以上多肽抗原所產(chǎn)生制備的多種單克隆抗體加以組合治療。以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3