本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種敲除Wnt3a基因的過程及其驗證方法。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，位列腫瘤相關(guān)死因的第三位。HCC的發(fā)生發(fā)展是多病因、多基因、多步驟及多因子協(xié)同的復(fù)雜過程，涉及到癌基因激活，抑癌基因失活及胚胎期某些癌基因重新復(fù)活等多信號通路和基因調(diào)控。肝細(xì)胞肝癌以手術(shù)治療為主，輔之化學(xué)治療、局部治療等。早期肝癌可選擇切除術(shù)及肝臟移植，但大部分患者就診時已失去手術(shù)治療機會。因此，早期診斷和有效治療至關(guān)重要。

Wnt信號通路被認(rèn)為與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號途徑的異常激活，是HCC發(fā)病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作為經(jīng)典途徑中的Wnt3a蛋白過表達(dá)即可作為肝癌早期診斷標(biāo)志，又可作為肝癌預(yù)后相關(guān)的新靶點，具有開發(fā)與應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，現(xiàn)提供一種具有開發(fā)與應(yīng)用前景的敲除Wnt3a基因的過程及其驗證方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：敲除Wnt3a基因的過程及其驗證方法，其創(chuàng)新點在于：經(jīng)過構(gòu)建針對Wnt3a基因的Cas9慢病毒載體、HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代、目的細(xì)胞慢病毒感染與篩選、錯配酶法驗證基因敲除效率、細(xì)胞蛋白分析、CCK-8法檢測細(xì)胞增殖的步驟完成對Wnt3a基因的敲除及驗證；

所述構(gòu)建針對Wnt3a基因的Cas9慢病毒載體的具體步驟為：構(gòu)建Cas9雙載體慢病毒，包含Lenti-sgRNA-EGFP病毒2個，分別表達(dá)靶基因sgRNA序列及對照sgRNA序列，滴度在1E+8以上； Lenti-CAS9-puro病毒1個，表達(dá)CAS9蛋白，帶puro抗性，滴度在1E+8 以上；

所述HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代的具體步驟包括細(xì)胞復(fù)蘇和細(xì)胞傳代。

進(jìn)一步的，所述HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代步驟中的細(xì)胞復(fù)蘇的具體步驟為：

（1）從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴中，并不時搖動使其盡快解凍；

（2）完全解凍后，在1000rpm環(huán)境下，離心2min；

（3）然后采用70%酒精擦拭凍存管消毒后，移至超凈臺；

（4）吸去凍存液上清，加入1ml新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種至含有3ml完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻后置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（5）次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，所述HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代步驟中的細(xì)胞傳代的具體步驟為：

1）將生長90%匯合的細(xì)胞進(jìn)行傳代，棄去舊培養(yǎng)液，加入2ml滅菌的D-Hanks溶液，洗滌細(xì)胞生長面；

2）然后棄去該溶液，加入1ml胰酶消化液，在37℃環(huán)境下消化1-2 min，直到細(xì)胞完全消化下來；

3）加入完全培養(yǎng)基2ml，用刻度吸管吹打，將壁上的細(xì)胞沖洗下來；

4）混勻細(xì)胞后分至兩個新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補足完全培養(yǎng)基至4ml，繼續(xù)培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，所述目的細(xì)胞慢病毒感染與篩選的具體步驟為：

a.將未感染慢病毒待篩選空細(xì)胞接種于6孔板中至70-80%融合度；

b.待細(xì)胞貼壁后，加入puromycin藥物進(jìn)行空細(xì)胞致死最低濃度篩選，1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml進(jìn)行篩選，得出藥物處理48h后細(xì)胞全部死亡的最低藥物濃度；

c.培養(yǎng)至對數(shù)生長期的目的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液；

d.將細(xì)胞數(shù)為5×10⁴/ml的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，在37℃環(huán)境下5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到30%；

e.根據(jù)細(xì)胞MOI值，加入病毒，12h后觀察細(xì)胞狀態(tài)：如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基；

f.48小時后，加入puromycin藥物篩選48h，得到穩(wěn)定表達(dá)CAS9的混合克?。?/p>

g.篩選后的細(xì)胞即時觀察細(xì)胞狀態(tài)，保證細(xì)胞狀態(tài)良好；

h.再次鋪板，按照慢病毒感染細(xì)胞步驟感染表達(dá)sgRNA的慢病毒；

i.染3天后觀察慢病毒上報告基因GFP的表達(dá)情況，熒光效率在80%左右的細(xì)胞開始進(jìn)行后續(xù)實驗。

進(jìn)一步的，所述錯配酶法驗證基因敲除效率的具體步驟為：

（一）DNA抽提：收集成功感染的細(xì)胞，使用基因組DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA；

（二）PCR擴增：圍繞sgRNA結(jié)合位點，設(shè)計一對基因組PCR引物，按照如下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)：2×Taq Plus Master Mix 10μL，引物F 0.5μL，引物R 0.5μL，基因組DNA30ng，加雙蒸水至20μL；

PCR反應(yīng)程序設(shè)置：94℃預(yù)變性90s，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s/kb，重復(fù)變性，退火，延伸步驟35個循環(huán)，72-98℃融解，自然冷卻至40℃以下；

（三）酶切篩選陽性克?。涸跍缇鶳CR管中配制如下反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物2μL，Detecase Buffer 2μL，Detecase 2μL，加雙蒸水至10 μL，45℃反應(yīng)20min，然后立即向上述10μL體系內(nèi)加入2μL終止緩沖液，隨后進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳105V，45min，電泳結(jié)束后，凝膠成像分析儀拍照。

進(jìn)一步的，所述細(xì)胞蛋白分析的具體步驟為：

I.蛋白抽提和濃度測定：用PBS沖洗貼壁細(xì)胞，用刮板刮下，每個樣本取2×10⁶個細(xì)胞于冰上裂解，按蛋白抽提試劑盒操作步驟提取總蛋白，以BCA法測定濃度，稀釋到最佳上樣量2μg/μL，收集到的蛋白立即使用或者-80℃環(huán)境下保存待用；

II.免疫印跡試驗：制備10%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離膠和5%濃縮膠，取20μg待測蛋白樣品放入EP管中加5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性，向電泳槽內(nèi)加入足量電泳緩沖液，所述電泳緩沖液的配方為：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10mL，ddH₂O1000mL，上樣，電泳恒壓60 V×40 min，后110V ×60 min，結(jié)束后將樣品放入有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移槽內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，所述轉(zhuǎn)膜緩沖液的配方為：Tris 3.02g，甘氨酸14.4g，100%甲醇200 mL，ddH₂O 800mL，恒流300mA×110min；待蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后拿出，用洗滌緩沖液漂洗5min ，共漂洗4次，所述洗滌緩沖液的配方為：TBS-T，Tris 2.42g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5mL，ddH₂O 1000mL，加濃HCl 120mL 使其pH值為 7.5，室溫下5%脫脂牛奶封閉液脫色搖床封閉1h；TBS-T漂洗5 min ，共漂洗4次，加入采用Dako抗體稀釋液稀釋1000倍的鼠抗人Wnt3a 及采用Dako抗體稀釋液稀釋2000倍的鼠抗人β-actin抗體作為內(nèi)參，4℃環(huán)境下過夜，TBS-T漂洗5min，漂洗4次，采用Dako抗體稀釋液稀釋1000倍的辣根過氧化物酶HP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗37 ℃孵育1 h，洗滌后ECL顯色并拍照。

進(jìn)一步的，所述CCK-8法檢測細(xì)胞增殖的具體步驟為：設(shè)空白組，陰性對照組，實驗組，取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液，分別接種于96孔板，每孔100μL，將培養(yǎng)板放在37℃，5% CO₂的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，分別于既定時間點取出換液，每孔添加10μLCCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-4 h，采用酶標(biāo)儀檢測A₄₅₀值。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明通過首次構(gòu)建Cas9雙載體慢病毒系統(tǒng)敲除Wnt3a基因, Crispr/Cas9是一種能夠?qū)θ魏挝锓N基因組的特定位點進(jìn)行精確編輯的技術(shù)，使用該技術(shù)能夠進(jìn)行細(xì)胞水平單基因或多基因敲除，該方法比其它基因編輯技術(shù)靶向精確性更高，RNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配，Cas9才會對DNA進(jìn)行剪切，并可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除，載體構(gòu)建實驗周期短，節(jié)省大量時間和成本，并且無物種限制。

附圖說明

圖1為肝癌組織及癌旁組織中Wnt3a免疫組化結(jié)果對比圖；

圖2為第一次感染帶嘌呤霉素標(biāo)記的Cas9病毒及其篩選結(jié)果；

圖3為第二次感染帶熒光標(biāo)記的sgRNA病毒；

圖4為錯配酶法檢測基因敲除效率—瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；

圖5為Western結(jié)果分析圖；

圖6為CCK8結(jié)果分析圖。

具體實施方式

以下由特定的具體實施例說明本發(fā)明的實施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點及功效。

實施例1

下列實施例為本發(fā)明的敲除Wnt3a基因的過程及驗證步驟。

敲除Wnt3a基因的過程及其驗證方法，經(jīng)過構(gòu)建針對Wnt3a基因的Cas9慢病毒載體、HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代、目的細(xì)胞慢病毒感染與篩選、錯配酶法驗證基因敲除效率、細(xì)胞蛋白分析、CCK-8法檢測細(xì)胞增殖的步驟完成對Wnt3a基因的敲除及驗證；

構(gòu)建針對Wnt3a基因的Cas9慢病毒載體的具體步驟為：構(gòu)建Cas9雙載體慢病毒，包含Lenti-sgRNA-EGFP病毒2個，分別表達(dá)靶基因sgRNA序列及對照sgRNA序列，滴度在1E+8以上，靶基因sgRNA序列具體如表1所示； Lenti-CAS9-puro病毒1個，表達(dá)CAS9蛋白，帶puro抗性，滴度在1E+8 以上；

表1為SgRNA模板序列

表1

HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代的具體步驟包括細(xì)胞復(fù)蘇和細(xì)胞傳代；HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代步驟中的細(xì)胞復(fù)蘇的具體步驟為：

（1）從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴中，并不時搖動使其盡快解凍；

（2）完全解凍后，在1000rpm環(huán)境下，離心2min；

（3）然后采用70%酒精擦拭凍存管消毒后，移至超凈臺；

（4）吸去凍存液上清，加入1ml新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種至含有3ml完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻后置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（5）次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。

HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代步驟中的細(xì)胞傳代的具體步驟為：

1）將生長90%匯合的細(xì)胞進(jìn)行傳代，棄去舊培養(yǎng)液，加入2ml滅菌的D-Hanks溶液，洗滌細(xì)胞生長面；

2）然后棄去該溶液，加入1ml胰酶消化液，在37℃環(huán)境下消化1-2 min，直到細(xì)胞完全消化下來；

3）加入完全培養(yǎng)基2ml，用刻度吸管吹打，將壁上的細(xì)胞沖洗下來；

4）混勻細(xì)胞后分至兩個新的6-cm dish中，補足完全培養(yǎng)基至4ml，繼續(xù)培養(yǎng)。

目的細(xì)胞慢病毒感染與篩選的具體步驟為：

a.將未感染慢病毒待篩選空細(xì)胞接種于6孔板中至70-80%融合度；

b.待細(xì)胞貼壁后，加入puromycin藥物進(jìn)行空細(xì)胞致死最低濃度篩選，1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml進(jìn)行篩選，得出藥物處理48h后細(xì)胞全部死亡的最低藥物濃度；

c.培養(yǎng)至對數(shù)生長期的目的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液；

d.將細(xì)胞數(shù)為5×10⁴的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，在37℃環(huán)境下5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到30%；

e.根據(jù)細(xì)胞MOI值，加入病毒，12h后觀察細(xì)胞狀態(tài)：如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基；

f.48小時后，加入puromycin藥物篩選48h，得到穩(wěn)定表達(dá)CAS9的混合克??；

g.篩選后的細(xì)胞即時觀察細(xì)胞狀態(tài)，保證細(xì)胞狀態(tài)良好；

h.再次鋪板，按照慢病毒感染細(xì)胞步驟感染表達(dá)sgRNA的慢病毒；

i.感染3天后觀察慢病毒上報告基因GFP的表達(dá)情況，熒光效率在80%左右的細(xì)胞開始進(jìn)行后續(xù)實驗。

表2為靶點對應(yīng)的引物信息

表2

如圖2所示為第一次感染帶嘌呤霉素標(biāo)記的Cas9病毒及其篩選結(jié)果，A組為感染組，B組為對照組，加入嘌呤霉素篩選后感染組存活，對照組死亡；如圖3所示為第二次感染帶熒光標(biāo)記的sgRNA病毒，A1-3為sgRNA（+）病毒感染組，A4為sgRNA（-）病毒感染組，B1-4熒光效率達(dá)80%以上代表感染成功。

錯配酶法驗證基因敲除效率的具體步驟為：

（一）DNA抽提：收集成功感染的細(xì)胞，使用基因組DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA；

（二）PCR擴增：圍繞sgRNA結(jié)合位點，設(shè)計一對基因組PCR引物，按照如下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)：2×Taq Plus Master Mix 10μL，引物F 0.5μL，引物R 0.5μL，基因組DNA30ng，加雙蒸水至20μL；

PCR反應(yīng)程序設(shè)置：94℃預(yù)變性90s，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s/kb，重復(fù)變性，退火，延伸步驟35個循環(huán)，72-98℃融解，自然冷卻至40℃以下。

（三）酶切篩選陽性克隆：在滅菌PCR管中配制如下反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物2μL，Detecase Buffer2μL，Detecase2μL，加雙蒸水至10μL，45℃反應(yīng)20min，然后立即向上述10μL體系內(nèi)加入2μL終止緩沖液，隨后進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳105V，45min，電泳結(jié)束后，凝膠成像分析儀拍照。如圖4所示為錯配酶法檢測基因敲除效率—瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

細(xì)胞蛋白分析的具體步驟為：

I.蛋白抽提和濃度測定：用PBS沖洗貼壁細(xì)胞，用刮板刮下，每個樣本取2×10⁶個細(xì)胞于冰上裂解，按蛋白抽提試劑盒操作步驟提取總蛋白，以BCA法測定濃度，稀釋到最佳上樣量2μg/μL，所收集到的蛋白立即使用或者-80 ℃環(huán)境下保存待用；

II.免疫印跡試驗：制備10%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離膠和5%濃縮膠，取20μg待測蛋白樣品放入EP管中加5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性，向電泳槽內(nèi)加入足量電泳緩沖液，所述電泳緩沖液的配方為：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10mL，ddH₂O1000mL，上樣，電泳恒壓60 V×40 min，后110 V ×60 min，結(jié)束后將樣品放入有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移槽內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，所述轉(zhuǎn)膜緩沖液的配方為Tris 3.02g，甘氨酸14.4g，100%甲醇200 mL，ddH₂O 800mL，恒流300mA×110min；待蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后拿出，用洗滌緩沖液漂洗5min ，共漂洗4次，所述洗滌緩沖液的配方為：TBS-T，Tris2.42 g，NaCl8.0g，Tween-20 0.5mL，ddH₂O 1000mL，加濃HCl120mL 使其pH值為 7.5，室溫下5%脫脂牛奶封閉液脫色搖床封閉1 h；TBS-T漂洗5 min ，共漂洗4次，加入采用Dako抗體稀釋液稀釋1000倍的鼠抗人Wnt3a 及采用Dako抗體稀釋液稀釋2000倍的鼠抗人β-actin抗體作為內(nèi)參，4℃環(huán)境下過夜，TBS-T漂洗5min，漂洗4次，采用Dako抗體稀釋液稀釋1000倍的辣根過氧化物酶HP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗37 ℃孵育1 h，洗滌后ECL顯色并拍照。如圖5所示為Western的結(jié)構(gòu)分析，由圖可知，sgRNA2靶點對應(yīng)的肝癌細(xì)胞Wnt3a表達(dá)明顯下調(diào)。

CCK-8法檢測細(xì)胞增殖的具體步驟為：設(shè)空白組，陰性對照組，實驗組，取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液，分別接種于96孔板，每孔100μL，將培養(yǎng)板放在37℃，5% CO₂的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，分別于既定時間點取出換液，每孔添加10μLCCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-4 h，采用酶標(biāo)儀檢測A₄₅₀值。如圖6所示為CCK-8法檢測結(jié)果，由圖可知，成功敲除Wnt3a基因后的肝癌細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制。

本發(fā)明通過首次構(gòu)建Cas9雙載體慢病毒系統(tǒng)敲除Wnt3a基因, Crispr/Cas9是一種能夠?qū)θ魏挝锓N基因組的特定位點進(jìn)行精確編輯的技術(shù)，使用該技術(shù)能夠進(jìn)行細(xì)胞水平單基因或多基因敲除，原理是核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白通過導(dǎo)向性RNA識別特定基因組位點并對雙鏈 DNA 進(jìn)行切割，該方法比其它基因編輯技術(shù)靶向精確性更高，RNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配，Cas9才會對DNA進(jìn)行剪切，并可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除，載體構(gòu)建實驗周期短，節(jié)省大量時間和成本，并且無物種限制。

上述實施例只是本發(fā)明的較佳實施例，并不是對本發(fā)明技術(shù)方案的限制，只要是不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動即可在上述實施例的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的技術(shù)方案，均應(yīng)視為落入本發(fā)明專利的權(quán)利保護范圍內(nèi)。