本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)消除mecA質(zhì)粒的方法。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌是引起人類一系列感染性疾病的主要病原體之一，簡稱金葡菌，可引起皮膚感染、嚴(yán)重肺炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)化膿性炎，和食物中毒，嚴(yán)重者可以引起中毒性休克綜合征，極易導(dǎo)致患者致死亡。其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcμ s aμ reμ s，MRSA)因其更為嚴(yán)重的耐藥情況已成為院內(nèi)外感染及耐藥性監(jiān)測中的重要病原體。MRSA具有耐藥性的關(guān)鍵性原因是mecA基因。mecA基因存在于葡萄球菌的可移動性元件盒式染色體（Staphyloccoccal Cassette Chromosome mec，SCCmec）上。該可移動性元件還可以攜帶其他多種耐藥基因、轉(zhuǎn)座子、插入子等特殊結(jié)構(gòu)在菌株之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，從而造成了菌株之間耐藥基因的相互傳播，引起菌株多重耐藥。因此，mecA橫向基因轉(zhuǎn)移（Horizontal Gene Transfer，HGT）是使許多敏感金葡菌獲得耐藥基因而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄退嶮RSA菌的重要途徑。
目前，針對MRSA的新藥的研究主要有以下方法，一是在原有抗生素的基礎(chǔ)上改造結(jié)構(gòu)探索新型抗生素，例如特拉萬星（telavancin）就是通過對萬古霉素的改造形成的萬古霉素衍生物，并對MRSA具有良好的抗菌活性，但由于其對耐萬古霉素金葡菌效果較差及其明顯的毒副作用因此應(yīng)用并不廣泛；二是基于藥物對金葡菌細(xì)胞壁高效的水解作用表現(xiàn)出的良好抗菌作用研制出的抗菌蛋白，該方法作用明顯，特異性高，但是作為大分子蛋白質(zhì)其在體內(nèi)的代謝半衰期及其免疫原性的問題限制了其發(fā)展。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性高、效果明顯、無毒副作用的基于CRISPR/Cas9技術(shù)消除mecA質(zhì)粒的方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)消除mecA質(zhì)粒的方法，包括以下步驟：
（1）選擇MRSA菌株對mecA基因編碼轉(zhuǎn)肽酶C末端的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
（2）mecA基因凝膠回收；
（3）將步驟（2）所得的mecA基因與T-pMD19（simple）載體連接：
（4）制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞；
（5）將步驟（3）所得產(chǎn)物電轉(zhuǎn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞
取100μl所述 DH5α感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍；取11μl步驟（3）所得產(chǎn)物置于離心管中，將離心管和電轉(zhuǎn)杯一起置于冰上預(yù)冷10min；將100μl解凍的所述 DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到上述離心管中，冰上混勻后，繼續(xù)冰浴10min；
打開電轉(zhuǎn)儀，將上述混合物轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，在2500V電壓下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，并將1ml 含有抗性的BHI 培養(yǎng)基迅速加入電轉(zhuǎn)杯中，將其混勻后轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，37℃，250r/min 離心1.5h，進(jìn)行復(fù)蘇處理；取50μl上述混合物和50μl BHI培養(yǎng)基，混合均勻，然后涂在含有100μg/ml 氨芐西林的TSA平板上，置于37℃的保溫箱內(nèi)，過夜培養(yǎng)；
（6）T-pMD19-mecA質(zhì)粒的提取與測序驗證；
（7）T-pMD19-mecA質(zhì)粒的雙酶切處理和mecA基因的凝膠回收
T-pMD19-mecA質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，進(jìn)行凝膠電泳驗證和mecA基因凝膠回收；
（8）pET-21a(+) 質(zhì)粒的雙酶切處理和凝膠回收
pET-21a(+) 質(zhì)粒采用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒回收后進(jìn)行BamHⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶雙酶切處理后，進(jìn)行凝膠回收；
（9）pET-21a(+) 質(zhì)粒與mecA基因連接；
（10）oligos 的設(shè)計、合成、磷酸化及退火處理；
（11）pCas9∷mecA質(zhì)粒的構(gòu)建
pCas9凝膠回收產(chǎn)物與退火的雙鏈oligos連接體系：pCas9凝膠回收產(chǎn)物12μl ，稀釋后的oligos 1.5μl，T4連接酶1μl，T4連接酶buffer 2μl，雙蒸水3.5μl；
連接條件：16℃下過夜連接，之后電轉(zhuǎn)100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選擇單克隆菌落提取pCas9∷mecA質(zhì)粒；
（12）電轉(zhuǎn)pET-21a(+)-mecA質(zhì)粒到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（D3）中；
（13）電轉(zhuǎn)pCas9∷mecA質(zhì)粒和pCas9質(zhì)粒到BL21（D3）+pET-21a(+)- mecA感受態(tài)細(xì)菌中；
（14）電轉(zhuǎn)pCas9∷mecA質(zhì)粒和pCas9質(zhì)粒到BL21（D3）+pET-21a(+)感受態(tài)細(xì)菌中。
優(yōu)選的，步驟（1）中所述PCR擴(kuò)增過程中所需要的擴(kuò)增引物為：
F：CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG
R：CCCAAGCTTATTCATCTATATCGTATTTTTTATTA 。
優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的體系包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，擴(kuò)增引物F 1μl，擴(kuò)增引物R 1μl，MRSA DNA 2 μl，雙蒸水8.5 μl。
優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的過程是：
<1> 預(yù)變性：94℃下加熱5分鐘；
<2> 變性：94℃下加熱30秒；
<3> 退火：50℃下加熱30秒；
<4> 延伸：72℃下加熱1分鐘；
<5> 循環(huán)處理：循環(huán)<2>~<4>過程35次；
<6> 再延伸：72℃下繼續(xù)延伸10分鐘。
優(yōu)選的，步驟（10）中所述磷酸化的條件： 37℃水浴1h，再 65℃水浴20min，酶失活。
優(yōu)選的，步驟（10）中所述的退火處理為：加2.5μl 1M 的Nacl 到磷酸化的oligos 對中，然后將水浴鍋加熱到95℃后將體系放入，5分鐘后關(guān)閉水浴鍋電源，使其緩慢降溫至50℃時，緩慢向水浴鍋中添加冰水至溫度降至室溫。
優(yōu)選的，所述質(zhì)粒的提取過程是：選擇單克隆菌落，并置于含有100μg/ml 氨芐西林的無菌BHI液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行增菌，然后提取質(zhì)粒。
本試驗過程中使用的細(xì)菌菌株及質(zhì)粒來源：選擇2014年6月~2014年12月收集的來自鄭州市某綜合醫(yī)院臨床標(biāo)本，其中選MRSA mel-stap-a2014124 /zz菌株對mecA基因編碼轉(zhuǎn)肽酶的C末端的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段長度為1046bp；大腸桿菌DH5α菌株由本實驗室保存；大腸桿菌BL21(D3)購自康為世紀(jì)有限公司；T載體（PMD-19 simple）購自大連的寶生物工程公司；pCas9質(zhì)粒購自江蘇吉瑞公司；pET-21a(+) 為本實驗室保存；BsaI 內(nèi)切酶購自NEB公司；T4 PNK 購自NEB公司；BamHⅠ和Hind Ⅲ 購自NEB公司；T4 DNA 連接酶購自NEB公司。
本試驗過程中使用的主要試劑來源：溴化乙啶（Ethidium Bromide，EB）、氯霉素和TAE購自上海Solarbio公司，瓊脂糖購自西班牙BIOWEST公司，Loading buffer購自碧云天生物技術(shù)有限公司，PH精密試紙購自天津市金達(dá)化學(xué)試劑廠，酵母浸粉、胰蛋白胨購自英國Oxoid公司，TSA培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，細(xì)菌質(zhì)粒DNA小提試劑盒、微量DNA回收試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 相關(guān)試劑、DL2000 DNA maker（DL2000及DL15000）和氨芐西林購自上海萊楓生物科技有限公司，氫氧化鈉、氯化鈉購自洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司，瓊脂粉購自Sigma公司，丙三醇購自天津市凱通化學(xué)有限公司，細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，溶葡萄球菌酶購自SIGMA-ALDRICH。
本試驗過程中使用的主要試劑的配制：
溶葡萄球菌酶緩沖液：將2mM EDTA和20mM Tris-HCl加到1.2% Triton中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，在121℃下滅菌20min，冷卻至室溫后，再加入溶葡萄球菌酶至濃度為200μg/mL，然后分裝為180μl的小份，置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.5 %瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖1.5g加入到100mL 1×TAE工作液體中，攪拌均勻后置于電爐上加熱，直到液體沸騰后變?yōu)橥该?，冷卻到56℃，再加入5μl EB，混合均勻備用。
25mg/ml 的氯霉素溶液：稱取250mg氯霉素粉劑，加入到10ml 無水乙醇中混勻，使用22μm濾膜過濾，得到氯霉素溶液，分裝為1ml的小份于-20℃下保存?zhèn)溆?；使用時，將100ml LB、BHI、或BSA培養(yǎng)基置于121℃下滅菌20min，并降溫至60 ℃，然后加入100μl上述所得氯霉素溶液，使最終工作濃度為25μg/ml。
100mg/ml 氨芐西林水溶液：稱取1000 mg 氯霉素粉劑，加入到10ml去離子水中，混勻，使用22μm濾膜過濾，得到氨芐西林水溶液，分裝為1ml的小份于-20℃下保存?zhèn)溆?；使用時，將100ml LB、BHI、或BSA培養(yǎng)基置于121℃下滅菌20min，并降溫至60 ℃，然后加入100μl上述所得氨芐西林水溶液， 使最終濃度為100ug/ml。
LB液體培養(yǎng)基：稱取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉和1.0g氯化鈉溶于100mL蒸餾水中，用10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2，并于121℃下滅菌20min，然后置于4℃下保存?zhèn)溆?；使用時根據(jù)培養(yǎng)菌株所含電轉(zhuǎn)質(zhì)粒的抗性添加100μl上述配置好的氯霉素或氨芐西林抗生素溶液，混合均勻后使用。
LB固體培養(yǎng)基：稱取1.0g胰蛋白胨、0.5g酵母浸粉、1.0g氯化鈉和1.5g瓊脂粉，溶于100mL蒸餾水中，用10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2，并于121℃下滅菌20min，冷卻至50℃~60℃，使用時根據(jù)培養(yǎng)菌株所含電轉(zhuǎn)質(zhì)粒的抗性添加100ul上訴配置好的氯霉素或氨芐西林抗生素溶液傾注平板備用。
TSA培養(yǎng)基：稱4g 購買的TSA培養(yǎng)基加入到100mL去離子水中，在121℃下滅菌20min，并降溫至50℃~60℃，使用時根據(jù)電轉(zhuǎn)質(zhì)粒的抗性添加100ul上述配置好的氯霉素或氨芐西林抗生素溶液，混合均勻后倒入培養(yǎng)基平板，每板15ml，待晾干后置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
BHI培養(yǎng)基：稱取3.8g購買的BHI培養(yǎng)基加入到100mL去離子水中，在121℃下滅菌20min，降溫至50℃~60℃，使用時根據(jù)電轉(zhuǎn)質(zhì)粒的抗性添加100μl上述配置好的氯霉素或氨芐西林抗生素溶液，混合均勻后備用。
1M 的NaCl：稱取5.844g NaCl 到100mL 去離子水中，在21℃下滅菌20min，備用。
10%的甘油：取10mL丙三醇加入到80mL的去離子水中，定容至100ml，在21℃下滅菌20min，備用。
本試驗過程中使用的主要儀器設(shè)備來源：
LabcyCler basic 梯度PCR儀購自 德國SensoQuest公司，JW-2017H高速離心機(jī)購自安徽嘉文儀器裝備有限公司，HVE-50型自動電熱壓力蒸汽滅菌器購自日本Hirayama公司，海爾立式超低溫保存箱購自青島海爾股份有限公司，SK-1型快速混勻器購自 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，DYC31B型水平電泳槽購自北京市六一儀器廠，HH-42S數(shù)顯恒溫磁力攪拌循環(huán)水箱購自常州國華電器有限公司，ZD-85氣浴恒溫振蕩器購自金壇市精達(dá)儀器制造有限公司，Gene pulser XCell 電轉(zhuǎn)化儀購自Bio-Rad公司，微量可調(diào)節(jié)移液器購自美國Thermo公司，101-1B型電熱鼓風(fēng)干燥箱購自上海市實驗儀器總廠，WD—9403C紫外儀購自北京六一儀器廠，Gene-Genius bioimaging system購自基因有限公司，DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠。
未作特別說明的試驗材料和方法均為公知技術(shù)，可在常用工具書包括《分子克隆實驗指南》（J.薩姆布魯克、D.W拉塞爾著，第三版，科學(xué)出版社，2002）等中查找。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明通過構(gòu)建靶向mecA 基因的pCas9∷mecA 質(zhì)粒及含有mecA 基因的大腸桿菌質(zhì)粒pET-21a(+)-mecA 質(zhì)粒，將前者電轉(zhuǎn)入含有后者的大腸桿菌表達(dá)菌株中，從而實現(xiàn)清除mecA 所在質(zhì)粒的目的。該方法操作簡單，特異性強(qiáng)，針對類似于mecA 基因的傳播方式，不僅可以消除MRSA菌株，同時可以預(yù)防敏感菌株接受mecA 基因后轉(zhuǎn)變?yōu)镸RSA菌株；同時較傳統(tǒng)的基因編輯手段更為靈活，編輯效率更高。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明特征及其它相關(guān)特征作進(jìn)一步詳細(xì)說明，以便于同行業(yè)技術(shù)人員的理解：
本發(fā)明提供的基于CRISPR/Cas9技術(shù)消除mecA 質(zhì)粒的方法，包括以下步驟：
（1）DNA模板制備
使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒從MRSA mel-stap-a2014124/zz菌株中提取DNA；
（2）mecA 基因PCR擴(kuò)增
選擇MRSA菌株對mecA 基因編碼轉(zhuǎn)肽酶C末端的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
其中，擴(kuò)增引物為：
F：CGGGATCCACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAG
R：CCCAAGCTTATTCATCTATATCGTATTTTTTATTA ；
PCR擴(kuò)增的體系包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5μl，擴(kuò)增引物F 1μl，擴(kuò)增引物R 1μl，MRSA DNA 2 μl，雙蒸水8.5 μl；
PCR擴(kuò)增的過程包括：
<1> 預(yù)變性：94℃下加熱5分鐘；
<2> 變性：94℃下加熱30秒；
<3> 退火：50℃下加熱30秒；
<4> 延伸：72℃下加熱1分鐘；
<5> 循環(huán)處理：循環(huán)<2>~<4>過程35次；
<6> 再延伸：72℃下繼續(xù)延伸10分鐘；
（3）mecA 基因凝膠回收
將40μL PCR體系加入到凝膠電泳的加樣孔中，再加入DL2000 DNA marker，在90V電壓下處理40分鐘，然后放入WD—9403C紫外成像儀中，將上述所得物的對應(yīng)1000bp 左右的條帶迅速切割下來，切去多余的膠塊，采用微量DNA快速回收試劑盒回收，并用雙蒸MILLI-Q水洗脫，測量回收的DNA濃度，以便下一步連接實驗計算載體和目的片段比例；
（4）將步驟（3）所得的mecA 基因與T-pMD19（simple）載體連接
連接體系包含：T-pMD19（simple） 載體1μl，mecA 基因5μl，連接Takara Buffer 5μl；將所得連接體系置于隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱中在16℃下的進(jìn)行過夜連接；
（5）制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞
將DH5α細(xì)菌接種到無抗性無菌的LB固體培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃下進(jìn)行過夜培養(yǎng)；將5ml無抗生素的無菌BHI培養(yǎng)基裝入到20ml滅菌玻璃試管內(nèi)，選擇DH5α細(xì)菌的單克隆菌落，接種到上述無抗生素的無菌BHI培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃下，以250r/min的速率振搖過夜，進(jìn)行增菌；
將上述所得的DH5α細(xì)菌以1:100的比例加入到新的無菌無抗生素的BHI培養(yǎng)基中，在37℃下，以250r/min的速率振搖2.5小時，當(dāng)細(xì)菌的OD值達(dá)到0.3~0.4時停止培養(yǎng)，置于冰上進(jìn)行冰浴預(yù)冷，至菌液溫度降至3℃~4℃；
將50ml離心管和10%甘油在在121℃下滅菌處理20min，并冷卻至3℃~4℃，備用；將上述預(yù)冷過的菌液倒入離心管內(nèi)，在4℃下以6000r/min的速率進(jìn)行離心處理10min，除去上清液；再加入45ml預(yù)冷的MILLI-Q水，經(jīng)槍頭吹打混勻后，在4℃下以6000r/min的速率進(jìn)行離心處理10min，除去上清液；重復(fù)該步驟一次；
再取45ml上述甘油置于離心管內(nèi)，以6000r/min的速率在4℃下離心10分鐘，棄上清；
冰上操作：在離心管中加入500μl 上述甘油，混勻，得到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于-80℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?/p>
（6）將步驟（4）所得產(chǎn)物電轉(zhuǎn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞
取100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍；取11μl步驟（4）所得產(chǎn)物置于1.5ml的離心管中，將離心管和0.2cm電轉(zhuǎn)杯一起置于冰上預(yù)冷10min；將100μl解凍的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到上述1.5ml離心管中，冰上混勻后，繼續(xù)冰浴10min；
打開電轉(zhuǎn)儀，將上述混合物轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，在2500V電壓下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，并將1ml 含有抗性的BHI 培養(yǎng)基迅速加入電轉(zhuǎn)杯中，將其混勻后轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，37℃，250r/min 離心1.5h，進(jìn)行復(fù)蘇處理；取50μl上述混合物和50μl BHI培養(yǎng)基，混合均勻，然后涂在含有100μg/ml 氨芐西林的TSA平板上，置于37℃的保溫箱內(nèi)，過夜培養(yǎng)；
（7）T-pMD19-mecA 質(zhì)粒的提取與測序驗證
選擇步驟（6）所得產(chǎn)物中的單克隆菌落，并置于含有100μg/ml 氨芐西林的無菌BHI液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行增菌，然后提取T-pMD19-mecA 質(zhì)粒；
使用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，分兩次每次收集1ml菌液，分別離心各1min，棄上清，槍頭吸出殘余菌液，中間步驟按照說明書進(jìn)行，最后一步經(jīng)MILLI-Q水洗脫及溶解，加水體積為每柱60μl，第一次洗脫液再次加入柱中進(jìn)行第二次洗脫，以提高質(zhì)粒DNA濃度；
（8）將提取的T-pMD19-mecA 質(zhì)粒送至上海生工生物科技公司測序驗證；
（9）T-pMD19-mecA 質(zhì)粒的雙酶切處理和mecA 基因的凝膠回收
T-pMD19-mecA 質(zhì)粒在經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，進(jìn)行凝膠電泳驗證和mecA 基因凝膠回收；
酶切體系20μl：質(zhì)粒DNA5μl，BamHⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶各1μl，Cutsmart buffer 2μl，雙蒸水11μl；
將上述酶切體系在37℃下水浴4小時，完成T-pMD19-mecA 質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)，再放入DYY-6C型電泳儀，90V下電泳40min，其中電泳介質(zhì)為1.5%瓊脂糖凝膠；mecA 基因凝膠回收過程與步驟（3）一致；
（10）pET-21a(+) 質(zhì)粒的雙酶切處理和凝膠回收
pET-21a(+) 質(zhì)粒采用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒回收后進(jìn)行BamHⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶雙酶切處理后，進(jìn)行凝膠回收；
酶切體系（20μl）：pET-21a(+) 質(zhì)粒DNA 15μl，BamHⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶各1.5μl，Cutsmart buffer 2μl ；
酶切過程與步驟（10）一致，凝膠回收的過程與步驟（3）一致；
（11）pET-21a(+) 質(zhì)粒與mecA 基因連接
pET-21a(+) 質(zhì)粒雙酶切后凝膠回收片段（10ng/μl），與步驟（9）中凝膠回收的mecA 基因 (12ng/μl)連接；
連接體系（32μl）：pET-21a(+) 質(zhì)粒雙酶切后凝膠回收片段20μl，凝膠回mecA 基因片段8μl，T4連接酶1μl，T4 連接酶buffer 3μl；
連接反應(yīng)條件：將連接體系于16℃水浴下進(jìn)行過夜連接，之后，電轉(zhuǎn)300μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選擇單克隆菌落提取pET-21a(+)-mecA 質(zhì)粒后送上海生工生物科技公司測序。
（12）oligos 的設(shè)計、合成、磷酸化及退火處理
利用sgRNAcas9 軟件設(shè)計，挑選出6種對脫靶效率最低的oligos 序列，并參考文獻(xiàn)中的兩對oligos 序列，并參照oligos設(shè)計原則添加BsaI酶切位點后由上海生工生物科技公司合成。
oligos 磷酸化體系（50μl）： oligo I (100 μM) 1 μl，oligo II (100 μM) 1μl，10X T4 Ligase buffer (NEB) 5 μl， T4 PNK (NEB) 1 μl，ddH2O 42 μl；
去磷酸化條件： 37℃水浴1h，再 65℃水浴20min，酶失活；
Oligos 退火步驟：
加2.5μl 1M 的Nacl 到磷酸化的oligos 對中，然后將水浴鍋加熱到95℃后將體系放入，5分鐘后關(guān)閉水浴鍋電源，使其緩慢降溫至50℃時，緩慢向水浴鍋中添加冰水至溫度降至室溫；
Oligos序列見表1：
表1 Oligos序列
注：“F”代表正義鏈，“R”代表反義鏈。
（13）pCas9∷mecA 質(zhì)粒的構(gòu)建
pCas9質(zhì)粒Bsal內(nèi)切酶的酶切體系：pCas9質(zhì)粒15μl，Bsal內(nèi)切酶1μl，cutsmart buffer 2μl，雙蒸水2μl；
酶切條件：37℃水浴3h，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后凝膠回收；
pCas9凝膠回收產(chǎn)物與退火的雙鏈oligos連接體系：pCas9凝膠回收產(chǎn)物12μl，稀釋后的oligos 1.5μl，T4連接酶1μl，T4連接酶buffer 2μl，雙蒸水3.5μl；
連接條件：16℃下過夜連接，之后，電轉(zhuǎn)100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選擇單克隆菌落提取質(zhì)粒并送上海生工生物科技公司測序；
（14）電轉(zhuǎn)pET-21a(+)-mecA 質(zhì)粒到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（D3）中
采用步驟（7）的方法得到增菌液，將增菌液分為兩份，其中一份菌液直接提取質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，經(jīng)過凝膠電泳驗證細(xì)菌中是否具有質(zhì)粒pET-21a(+)-mecA ，另一份直接制作感受態(tài)細(xì)胞；
（15）電轉(zhuǎn)pCas9∷mecA 質(zhì)粒和pCas9質(zhì)粒到BL21（D3）+pET-21a(+)- mecA 感受態(tài)細(xì)菌中
電轉(zhuǎn)質(zhì)粒pCas9∷mecA 和對照質(zhì)粒pCas9 各2μl到100μl BL21（D3）+pET-21a(+)-mecA感受態(tài)細(xì)菌中；
取100μl上述菌液稀釋10倍，再取10μl 稀釋后的菌液涂布含有25μg/ml氯霉素的TSA平板，在37℃下過夜培養(yǎng)，并對平板上所有菌落進(jìn)行計數(shù)編號；
在每個平板上隨機(jī)選取10個菌落進(jìn)行液體增菌，提取質(zhì)粒；
所提取的質(zhì)粒利用hind III酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以判斷Cas9質(zhì)粒對pET-21a(+)-mecA 的作用；
（16）電轉(zhuǎn)pCas9∷mecA 質(zhì)粒和pCas9質(zhì)粒到BL21（D3）+pET-21a(+)感受態(tài)細(xì)菌中
取100μl菌液稀釋10倍，再取10μl 稀釋后的菌液涂布含有25μg/ml的氯霉素的TSA平板，在37℃下過夜培養(yǎng)，并對平板上所有菌落進(jìn)行計數(shù)編號；
在每個平板上隨機(jī)選取10個菌落進(jìn)行液體增菌，提取質(zhì)粒；
所提取的質(zhì)粒利用BamHⅠ酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以判斷Cas9質(zhì)粒對pET-21a(+)的作用。
9種不同Cas9質(zhì)粒對pET-21a(+)-mecA 質(zhì)粒和pET-21a(+)質(zhì)粒的清除效率，如表2和表3：
由表2 可見，9種Cas9質(zhì)粒對pET-21a(+)-mecA質(zhì)粒的清除作用總體上存在差異，各組與對照組質(zhì)粒pCas9的作用通過兩兩對比以后發(fā)現(xiàn)每次比較的P 值均為0.00小于調(diào)整后的檢驗水準(zhǔn)α=0.006，因此除對照組pCas9質(zhì)粒以外，剩余8組pCas9-mecA 質(zhì)粒均對質(zhì)粒pET-21a(+)-mecA 具有明顯的清除作用。由表3可見包括對照組pCas9在內(nèi)的90個菌落的檢測結(jié)果均表明，PCas9-mecA 質(zhì)粒對于不包含mecA 基因的pET-21a(+)質(zhì)粒均沒有消除作用。
表2 9種Cas9 質(zhì)粒對pET-21a(+)-mecA 質(zhì)粒消除作用效率
注：“*”為經(jīng)Fisher 確切概率法雙側(cè)檢驗水準(zhǔn)α=0.05，“^”因樣本量小于40，故采用2×2四格表Fisher確切概率法，經(jīng)雙側(cè)檢驗，校正后檢驗水準(zhǔn)α=0.006。
表3 9種Cas9質(zhì)粒對質(zhì)粒pET-21a(+)消除作用效率
以上通過實施例對本發(fā)明的進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。