本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種阿德福韋單硫代L-氨基酸酯單膽酸酯衍生物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，是最易感染人類的病毒之一。WHO報(bào)告目前全世界約有3.5-4億為HBV感染者，而在他們之中有近30％可能發(fā)展為肝硬化，原發(fā)性肝癌。這兩種病變每年導(dǎo)致約有50-100萬慢性乙型肝炎患者死亡(DienstagJ.L.etal.N.Engl.J.Med.2008,359,1486-1500)。阿德福韋酯(Adefovirdipivoxil)為FDA在2002年批準(zhǔn)上市的由GileadScience公司研制的第一個(gè)非環(huán)核苷膦酸酯類抗HBV藥物。臨床研究表明阿德福韋酯的優(yōu)點(diǎn)為：明顯改善慢性乙型肝炎患者肝臟組織學(xué)性質(zhì)，降低血清乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)及轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平，增加e抗原(HBeAg)轉(zhuǎn)化率；能有效繞過病毒編碼激酶催化的首次磷酸化過程，因此對拉米呋啶(lamivudine)，泛昔洛維(famcicloir)及恩曲他濱(emtricitabine)等核苷類似物產(chǎn)生耐藥的變異HBV能產(chǎn)生較好的抑制效果(AnnekeKR.etal.ExpertOpinInvestigDrugs.2003,12,1281-1295；SegoviaM.C.etal.ExpertOpinPharmacother.2012,13,245-254)。但是阿德福韋酯臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其主要不足是產(chǎn)生劑量依賴性腎毒性包括Fanconi綜合癥，血清肌酐增高，腎性糖尿及蛋白尿等(LawS.T.etal.AmJTher.2013,20,713-716；TanjiN.etal.HumanPathology2001,32,734-740)，另外其口服給藥生物利用度較低，藥物在胃腸道中穩(wěn)定性較差，釋放原藥過程中產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的特戊酸和甲醛，同時(shí)由于分解產(chǎn)生的原藥肝細(xì)胞攝取率較低，使該藥僅具有中等抗HBV活性(SweetD.H.etal.AmJPhysiolRenalPhysiol.2001,281,F197-F205)，這些不足限制了阿德福韋酯在臨床上的應(yīng)用。由于阿德福韋酯的上述不足，目前世界主要制藥公司正致力于研制、開發(fā)新型抗病毒非環(huán)核苷膦酸類前藥，這些侯選藥物包括：Mitsubishi-Lilly公司研制的阿拉莫韋(Alamifovir)；GileadScience公司研制的替諾福韋酯(Tenofovirdiisoproxil)與阿德福韋苯基膦酰丙氨酸酯(Phenylphosphoralaninate,PMEA)；Ribapharm公司研制的瑞莫福韋(Remofovir)，以及由LGLifeSciences公司研制的PMCDGdipivoxil(LB80380)等，目前替諾福韋酯與瑞莫福韋已經(jīng)上市，阿拉莫韋、PMCDGdipivoxil已分別進(jìn)入II期臨床研究。盡管這些前藥相對于阿德福韋酯抗HBV活性有所提高、細(xì)胞毒性有所降低，但是這些前藥仍存在不足。它們設(shè)計(jì)上的共同特點(diǎn)表現(xiàn)為：1)將不同的外源性片段與非環(huán)核苷膦酸通過膦酯或膦酰胺鍵相連接，以改善分子親脂性，提高生物利用度，但是所設(shè)計(jì)的前藥在釋放原藥的過程中仍然可能會(huì)產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的載體分子；2)前藥設(shè)計(jì)上沒有考慮到是否可以利用其結(jié)構(gòu)中引入的載體片段來實(shí)現(xiàn)藥物的肝靶向性傳輸，降低其在非靶器官(腎臟、骨髓)濃度，從而降低其毒副作用。這些不足的存在一定程度上可能限制這些前藥的臨床應(yīng)用。鑒于以上情況，設(shè)計(jì)含有內(nèi)源性載體，能實(shí)現(xiàn)藥物肝靶向性富集，同時(shí)毒副作用降低的阿德福韋前藥對于研制、開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型抗HBV藥物具有重要價(jià)值。膽汁酸(包括膽酸、去氧膽酸與熊去氧膽酸等)是內(nèi)源性的肝細(xì)胞特異性天然配基。膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)生成后隨膽汁流入小腸，參與脂類物質(zhì)吸收，之后在回腸末端被迅速重吸收，通過門靜脈重新進(jìn)入肝臟，形成肝腸循環(huán)(Enterohepaticcirculation,EC)(MeierP.J.etal.AnnuRevPhysiol.2002,64,635-661)，該過程中其僅有少量膽汁酸(＜5％)進(jìn)入血液，因此膽汁酸具有高度的器官特異性。成人體內(nèi)肝腸循環(huán)每天重復(fù)6～15次，參與循環(huán)的膽酸總量達(dá)到17～40克，表明膽汁酸同時(shí)具有極高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。報(bào)道顯示，膽汁酸是目前唯一口服有效的小分子肝靶向性藥物載體，其作為藥物投送載體最大的優(yōu)勢在于肝腸循環(huán)效率高、器官特異性高，藥物與膽汁酸偶聯(lián)后，由于可被膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識(shí)別，參與進(jìn)膽汁酸的肝腸循環(huán)，從而能夠提高藥物的吸收及在肝臟中的濃度，賦予藥物肝臟的選擇性。同時(shí)由于膽酸作為內(nèi)源性的天然配基，具有良好的生物相容性，適合于作為靶向性藥物的載體(TraunerM.etal.PhysiolRev.2003,83,633-671；EnhsenA.etal.DrugDiscov.Today1998,3,409-418)。在膽汁酸的腸肝循環(huán)中位于回腸末端上皮細(xì)胞頂端刷狀緣膜中的鈉離子依賴性膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(humanapicalsodium-dependentbileacidtransporter,hASBT)介導(dǎo)膽酸由回腸重吸收進(jìn)入門靜脈血液，位于肝細(xì)胞表面的鈉離子-?；悄懰徂D(zhuǎn)運(yùn)多肽(Na+/taurocholatecotransportingpolypeptide,NTCP)介導(dǎo)血液中的膽酸吸收進(jìn)入肝細(xì)胞，這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是膽汁酸腸肝循環(huán)中最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)載體(SchaapF.G.etal.NatRevGastroenterolHepatol.2014,11,55-67；BalakrishnanA.etal.MolPharm.2006,3,223-230)。研究表明藥效基團(tuán)與膽酸的偶聯(lián)物可以被這兩種蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高藥物被腸道和肝臟吸收的能力。以膽汁酸為載體的前藥設(shè)計(jì)策略在藥物設(shè)計(jì)上的成功應(yīng)用表現(xiàn)在以下方面：Kullak-Ublick等將苯丁酸氮芥連接到?；悄懰岬?位羥基上，得到膽酸-苯丁酸氮芥偶合物。肝細(xì)胞膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)研究結(jié)果表明，藥物膽酸偶合物能被肝癌細(xì)胞表面高度表達(dá)的鈉離子-?；悄懰徂D(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝腫瘤細(xì)胞內(nèi)，相對于原藥能夠更迅速地被肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，兩者對肝腫瘤細(xì)胞半數(shù)抑制濃度存在明顯差異：藥物膽汁酸偶合物IC50＝3～5μmol/L，原藥>100μmol/L，這顯示偶合物具有膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)特性，賦予藥物肝靶向性富集能力(Kullak-UblickG.A.etal.Gastroenterology.1997,113,1295-1305)。Fiorucci等設(shè)計(jì)合成的目前正處于II臨床研究階段的硝基化阿魏酸與熊去氧膽酸(Ursodeoxycholicacid,UA)的偶聯(lián)物NCX1000也采用了膽汁酸載體前藥策略，該化合物能夠通過膽酸的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，選擇性地在肝細(xì)胞內(nèi)代謝釋放出一氧化氮，在發(fā)揮治療作用的同時(shí)，減少或避免一氧化氮的全身作用(FiorucciS.etal.JHepatol.2003,39,932-939)。另外，膽汁酸載體的引入還表現(xiàn)在增加藥物口服生物利用度上，例如抗焦慮藥加巴噴丁(Gabapentin)口服給藥后生物利用度低，代謝半衰期短。Rais等設(shè)計(jì)合成了熊去氧膽酸載體偶聯(lián)的加巴噴丁衍生物，其能通過回腸末端上皮細(xì)胞的鈉離子依賴性膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(ASBT)介導(dǎo)作用進(jìn)入膽汁酸的腸肝循環(huán)，明顯提高了藥物口服生物利用度，同時(shí)提高了藥物代謝穩(wěn)定性(RaisR.etal.JPharmSci.2011,100,1184-95)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本申請所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中阿德福韋類藥物毒副作用較大，口服生物利用度低。提供一種阿德福韋單硫代L-氨基酸酯單膽酸酯衍生物及其制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了具有下列化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、鹽結(jié)晶水合物、鹽結(jié)晶溶劑合物，其中：R1是H或OH；R2是H或OH；R3是碳原子數(shù)為1-4的烴基。進(jìn)一步的，所述化合物具體為：9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-丙氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯；(化合物1)9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-纈氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯；(化合物2)9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤單硫代L-異亮氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯；(化合物3)9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-亮氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯；(化合物4)9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-丙氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯；(化合物5)9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-纈氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯；(化合物6)9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-異亮氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯；(化合物7)9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-亮氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯。(化合物8)上述化合物的結(jié)構(gòu)式見表1表1化合物1-8結(jié)構(gòu)式化合物編號(hào)R1R2R31-H-OH-CH32-H-OH-CH(CH3)23-H-OH-CH(CH3)CH2CH34-H-OH-CH2CH(CH3)25-OH-H-CH36-OH-H-CH(CH3)27-OH-H-CH(CH3)CH2CH38-OH-H-CH2CH(CH3)2本發(fā)明還公開了上述化合物的制備方法，包括以下步驟：1)制備N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸-3-溴-1-丙基酯取N-叔丁氧羰基-L-氨基酸和硫化氫在N-甲基嗎啉和異丁基氯甲酸酯條件下，-20℃～-10℃反應(yīng)制備得到N-叔丁氧羰基硫代-L-氨基酸，所述N-叔丁氧羰基硫代-L-氨基酸與1,3-二溴丙烷在氫化鈉條件下制備得到N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸-3-溴-1-丙基酯；2)制備膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)-3-溴-1-丙基酯取膽酸(去氧膽酸或熊去氧膽酸)和3-溴-1-丙醇為反應(yīng)原料，在對-二甲氨基吡啶(DMAP)與N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)條件下通過縮合反應(yīng)制備得到膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)-3-溴-1-丙基酯；3)阿德福韋單L-氨基酸酯，單羧酸酯類前藥的制備采用“一鍋法(OnePotSynthesis)”合成目標(biāo)化合物，取9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)與所述膽酸(熊去氧膽酸、去氧膽酸)-3-溴-1-丙基酯在極性非質(zhì)子溶劑中，以N,N′-二環(huán)己基-4-嗎啉基-脒(DCMC)或1,8-二氮雜雙環(huán)[5、4、0]十一烷-7烯(DBU)為縮合劑，反應(yīng)得到化合物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯；得到的化合物后不經(jīng)分離，即加入適當(dāng)比例的N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸-3-溴-1-丙基酯，升高反應(yīng)溫度得到的9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸丙基酯，單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯；9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸丙基酯，單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯在極性或非極性溶劑中加入適量的磷酸溶液，反應(yīng)得到終產(chǎn)物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-氨基酸丙基酯，單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯。步驟3)流程如下：進(jìn)一步的，所述膽酸為去氧膽酸或熊去氧膽酸。進(jìn)一步的，所述步驟2)為：膽酸與3-溴-1-丙醇的比例為1.0～3.5:1mol，以DMAP和DCC為縮合劑，以無水四氫呋喃為溶劑，在0～4℃條件下反應(yīng)12～24小時(shí)，得到膽酸-3-溴-1-丙基酯。優(yōu)選的，步驟2)中所述膽酸與3-溴-1-丙醇的比例為1.0～2.0:1mol。進(jìn)一步的，步驟3)中所述膽酸-3-溴-1-丙基酯與9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤的比例為1.0～5.5:1mol，在極性非質(zhì)子溶劑中，以DCMC或DBU為縮合劑，在30～90℃下反應(yīng)24～96小時(shí)，得到9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯。進(jìn)一步的，步驟3)中所述膽酸-3-溴-1-丙基酯與9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤的比例為1.0～2.0:1mol，以DCMC為縮合劑，以N,N-二甲基甲酰胺為溶劑，在30～60℃下反應(yīng)36～72小時(shí)，得到9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯。進(jìn)一步的，步驟3)中所述N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸-3-溴-1-丙基酯與9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤比例為1.0～5.5:1mol，體系在60～120℃下反應(yīng)12～96小時(shí)，得到9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸丙基酯，單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯；9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸丙基酯，單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯在極性或非極性溶劑中加入適量60～85％的磷酸溶液，在-10～25℃下，反應(yīng)0.2～16小時(shí)，到終產(chǎn)物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-氨基酸丙基酯，單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯。進(jìn)一步的，步驟3)中所述N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸-3-溴-1-丙基酯與9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤比例為1.0～2.0:1mol，體系在60～100℃反應(yīng)36～72小時(shí)，得到9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸丙基酯，單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯；所述9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤單N-叔丁氧羰基硫代L-氨基酸丙基酯，單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯以氯仿為溶劑，加入60～85％磷酸，在-5℃～25℃反應(yīng)8～12小時(shí)，到終產(chǎn)物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-氨基酸丙基酯，單膽酸(去氧膽酸、熊去氧膽酸)丙基酯。本發(fā)明還公開了上述化合物在制備用于治療乙型肝炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。除非特別注明，本文所用的術(shù)語具有以下定義：“烴基”表示飽和或不飽和的、取代或非取代的直鏈、支鏈烷烴鏈，具體的可列舉如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、2-甲基丙基、己基、異己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基等。這些基團(tuán)中，以甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基等碳原子數(shù)為1-4個(gè)的烷基為佳，以甲基、異丙基、2-甲基丙基、3-甲基丙基、羧甲基與羧乙基為最佳。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：1)本發(fā)明針對阿德福韋酯抗HBV治療中存在的不足，以前期研究發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)抗病毒活性與較低細(xì)胞毒性的阿德福韋雙硫代L-氨基酸酯為先導(dǎo)化合物，根據(jù)膽汁酸具有的腸肝循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑在提高藥物的肝細(xì)胞靶向性富集能力、減少副作用以及改善腸道對藥物吸收上取得的成功經(jīng)驗(yàn)，采用拼合設(shè)計(jì)原理將其膦酸基團(tuán)上的一個(gè)硫代L-氨基酸酯置換為膽酸酯結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)、合成新型肝靶向性非環(huán)核苷膦酸單硫代L-氨基酸酯，單膽酸酯前藥。2)本發(fā)明利用阿德福韋單硫代L-氨基酸酯，單膽酸酯前藥結(jié)構(gòu)中的L-氨基酸酯片段提高其抗HBV活性與作用選擇性，利用膽汁酸酯片段提高藥物肝細(xì)胞靶向性富集能力與口服吸收生物利用度，以發(fā)現(xiàn)具有較高肝細(xì)胞靶向性富集能力與抗病毒活性、口服生物利用度提高同時(shí)毒副作用明顯降低的抗HBV非環(huán)核苷膦酸酯前藥。3)本發(fā)明解決了阿德福韋酯臨床應(yīng)用中存在的肝靶向性富集能力差，非靶器官毒性較大的不足，從而為創(chuàng)制新型抗乙型肝炎病毒感染阿德福韋前藥奠定重要的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。4)本發(fā)明針對上市或進(jìn)入臨床研究的阿德福韋前藥存在的體內(nèi)過程中釋放細(xì)胞毒性的載體分子、非靶器官毒性較大的不足，設(shè)計(jì)含有內(nèi)源性載體，能實(shí)現(xiàn)藥物肝靶向性富集，同時(shí)毒副作用降低的阿德福韋單硫代L-氨基酸酯，單膽酸酯前藥，其實(shí)施對于研制、開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型抗HBV非環(huán)核苷膦酸酯類藥物具有重要價(jià)值。當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品必不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：圖1為本發(fā)明實(shí)施例10中不同時(shí)間對濃度為100μM受試化合物(1-4)攝取的影響圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例10中不同濃度受試化合物(1-4)對肝細(xì)胞攝取的影響圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例10中不同溫度對阿德福韋酯細(xì)胞攝取的影響圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例10中不同溫度對受試化合物1細(xì)胞攝取的影響圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例10中不同溫度對受試化合物2細(xì)胞攝取的影響圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例10中不同溫度對受試化合物3細(xì)胞攝取的影響圖；圖7為本發(fā)明實(shí)施例10中不同溫度對受試化合物4細(xì)胞攝取的影響圖；圖8為本發(fā)明實(shí)施例10中去氧膽酸抑制對阿德福韋酯細(xì)胞攝取的影響圖；圖9為本發(fā)明實(shí)施例10中去氧膽酸抑制對受試化合物1細(xì)胞攝取的影響圖；圖10為本發(fā)明實(shí)施例10中去氧膽酸抑制對受試化合物2細(xì)胞攝取的影響圖；圖11為本發(fā)明實(shí)施例10中去氧膽酸抑制對受試化合物3細(xì)胞攝取的影響圖；圖12為本發(fā)明實(shí)施例10中去氧膽酸抑制對受試化合物4細(xì)胞攝取的影響圖。具體實(shí)施方式以下將配合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。實(shí)施例19-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-丙氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯的制備(化合物1)(1)N-叔丁氧羰基硫代L-丙氨酸-3-溴-1-丙基酯的制備將N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸(5g，0.031mol)溶解于40mL干燥四氫呋喃中，以冰-鹽浴降溫至-20℃，加入N-甲基嗎啉(22g，0.15mol)及異丁基氯甲酸酯(3.1g，0.025mol)，體系保溫?cái)嚢?0分鐘。在反應(yīng)體系內(nèi)溫保持在-15℃以下，通入自制硫化氫氣體，通氣時(shí)間持續(xù)1.5-2小時(shí)，至體系中硫化氫氣體吸收至飽和后，再保溫反應(yīng)2小時(shí)使反應(yīng)進(jìn)行完全。加入40mL無水乙醚，以0.1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)體系pH至3，分取有機(jī)層，以2×20mL水，2×20mL飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干溶劑，得淡黃色油狀產(chǎn)物N-叔丁氧羰基硫代-L-丙氨酸4.57g，收率87.56％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ5.12(d,J＝6.4Hz,1H),4.31(t,J＝7.0Hz,2H),3.95(d,J＝5.0Hz,2H),3.52(m,2H),2.23(m,2H),1.45(s,9H)；IR(KBr)σ/cm-1:3369,2978,1749,1685,1520,1305,1256,1165,580。將氫化鈉(0.20g，5.15mmoL)加入10ml四氫呋喃中，攪拌并使體系降溫至-20℃，緩慢滴加入N-叔丁氧羰基硫代-L-丙氨酸(1.00g，4.29mmol)的2ml四氫呋喃溶液，保溫反應(yīng)1.5小時(shí)，自然升高至室溫后反應(yīng)2小時(shí)，緩慢滴加入1,3-二溴丙烷(1.54g，8.58mol)的5ml四氫呋喃溶液，體系室溫反應(yīng)12小時(shí)。過濾，濾液用2×20ml水，2×20ml飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮，殘留物柱層析分離(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯＝20:1)，得白色固體產(chǎn)物N-叔丁氧羰基硫代L-丙氨酸-3-溴-1-丙基酯0.61g，收率40.82％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ4.95(d,J＝8.95Hz,1H),4.26(m,1H),3.42(t,J＝7.34Hz,2H),3.29(t,J＝6.6Hz,2H)2.31-2.25(m,2H),1.46(s,9H),1.37(d,J＝6.4Hz,3H)；m.p71-73℃。(2)熊去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯的制備將熊去氧膽酸(3.92g，0.1mol)與3-溴-1-丙醇(1.6g，0.12mol)及DMAP(0.1g，0.08mol)加于100mL干燥的旋瓶中，加入40mL干燥的四氫呋喃(THF)，室溫下攪拌至溶液澄清，后于冰浴條件下緩慢滴加10mL溶解有DCC(2.67g，1.3moL)的THF溶劑，滴畢，冰浴-室溫條件下反應(yīng)20h，然后抽濾除去不溶物，濾液減壓旋干后加入乙酸乙酯20mL，置于4℃冰箱過夜后抽濾除去不溶物，濾液減壓旋干后的殘余物以石油醚:乙酸乙酯＝2:1體系柱層析得到標(biāo)題化合物。1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ4.46(t,J＝7.2Hz,2H),3.65-3.62(m,3H),3.15-3.12(m,2H),2.27-2.24(m,2H),1.99-1.85(m,4H),1.83-1.07(m,20H),1.01(s,2H),0.97(d,J＝5.6Hz,3H).ESI-MS(m/z)[M+H]+:513.2。(3)阿德福韋單硫代L-丙氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯(化合物1)的制備將9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)(0.47mmol)，N,N′-二環(huán)己基-4-嗎啉基-脒(DCMC)(0.94mmol)，懸浮于40mL干燥N,N-二甲基甲酰胺中，35-40℃攪拌至體系澄清后，將含有熊去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯1.5mmol的5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液滴加入上述體系中，并于40-50℃反應(yīng)48h。TLC監(jiān)測至阿德福韋單熊去氧膽酸-3-溴丙酯轉(zhuǎn)化充分后(TLC展開劑：乙酸乙酯/甲醇＝1:2V/V)，再滴加含有N-叔丁氧羰基硫代L-丙氨酸-3-溴-1-丙基酯1.5mmol的5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液，滴畢，將體系升溫至80-85℃，并于該條件下反應(yīng)48h，TLC監(jiān)測至阿德福韋單N-叔丁氧羰基硫代L-丙氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯轉(zhuǎn)化充分后(TLC展開劑：二氯甲烷/甲醇＝15:1V/V)，減壓蒸除溶劑，殘余物中加入50mL乙酸乙酯，-10℃靜置沉降12h，濾出不溶物，濾液減壓蒸出溶劑，殘余物硅膠柱層析分離純化(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇＝25:1V/V)得阿德福韋單N-叔丁氧羰基硫代L-丙氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯中間體。將9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單N-叔丁氧羰基硫代L-丙氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯(0.45mmol)置于25mL的圓底燒瓶中，加入氯仿1.0mL，攪拌下溶解完全，后加入60％的磷酸溶液(1.5mL，15.35mmol)，室溫反應(yīng)4.5h，反應(yīng)體系采用TLC檢測(展開劑：氯仿/甲醇/甲酸＝15:1:1v/v)。反應(yīng)結(jié)束后，體系中加入5.0mL的蒸餾水并用NaHCO3中和至近中性后，用氯仿萃取三次(3×15mL)，有機(jī)層分出并干燥，減壓蒸出溶劑后殘余物采用硅膠柱層析分離純化(洗脫劑：氯仿/甲醇＝15:1V/V)得阿德福韋單硫代L-丙氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯目標(biāo)化合物，收率16.5％。1H-NMR(400MH,CDCl3)：δ8.32(s,1H,2-H),8.00(s,1H,8-H),6.46(brs,2H,NH2),4.42-4.40(m,2H,NCH2),4.20-4.12(m,7H,2×P(O)OCH2,CH2OCO,CHNH2),3.93(t,J＝4.8Hz,2H,NCH2CH2),3.81(d,J＝8.4Hz,2H,OCH2P),3.61-3.55(m,2H,2×CHOH),2.89-2.86(m,2H,CH2SCO),2.39-2.33(m,1H),2.25-2.17(m,1H),1.98-1.93(m,4H,OCH2CH2,SCH2CH2),1.85-1.01(m,33H),0.93-0.88(m,6H,2×CH3),0.82(s,3H,CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ174.19(2×CO),155.48,152.75,149.55,141.93,118.89,71.16,71.04,65.55,63.89,63.43,63.36,63.06,63.00,60.09,57.52,55.72,54.65,50.52,43.61,43.56,43.35,43.35,42.38,40.05,39.15,37.20,36.98,35.15,34.88,33.98,33.14,33.09,31.00,30.93,30.21,29.68,28.60,26.80,23.35,21.09,18.32.ESI-MS(m/z)[M+H]+:851.4；HRESIMSm/z(pos):851.4513C41H68N6O9PS(calcd.851.4501)。實(shí)施例29-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-纈氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯的制備(化合物2)以阿德福韋、N-叔丁氧羰基硫代L-纈氨酸-3-溴-1-丙基酯以及熊去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯為反應(yīng)底物，按照類似于實(shí)施例1的方法制備，獲得目標(biāo)化合物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-纈氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯，收率19.5％。1H-NMR(400MH,CDCl3)：δ8.31(s,1H,2-H),7.99(s,1H,8-H),6.60(brs,2H,NH2),4.43(t,J＝4.4Hz,2H,NCH2),4.20-4.08(m,6H,CH2OCO,2×P(O)OCH2),4.04-4.00(m,1H,CHNH2),3.95-3.92(m,2H,NCH2CH2),3.82(d,J＝8.0Hz,2H,OCH2P),3.66-3.59(m,2H,2×CHOH),2.87-2.85(m,2H,CH2SCO),2.36-2.32(m,1H),2.28-2.24(m,1H),2.01-1.93(m,4H,OCH2CH2,SCH2CH2),1.85-1.04(m,28H),1.03-0.96(m,9H,3×CH3),0.92-0.89(m,6H,2×CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ175.29,174.25,155.64,152.84,149.59,141.24,118.98,72.93,72.87,71.38,65.60,64.00,63.04,62.80,60.53,60.03,59.78,50.40,48.18,46.75,46.44,43.35,41.93,36.22,35.86,35.21,33.99,33.51,31.99,30.86,30.74,30.32,29.66,29.61,28.47,27.47,26.99,26.07,23.59,23.02,19.19,17.20,12.60.ESI-MS(m/z)[M+H]+:879.4；HRESIMSm/z(pos):879.4821C43H72N6O9PS(calcd.879.4814)。實(shí)施例39-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤單硫代L-異亮氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯的制備(化合物3)以阿德福韋、N-叔丁氧羰基硫代L-異亮氨酸-3-溴-1-丙基酯以及熊去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯為反應(yīng)底物，按照類似于實(shí)施例1的方法制備，獲得目標(biāo)化合物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-異亮氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸基丙酯，收率14.7％。1H-NMR(400MH,CD3OD)：δ8.29(s,1H,2-H),7.92(s,1H,8-H),6.08(brs,2H,NH2),4.40(t,J＝5.6Hz,2H,NCH2),4.18-4.05(m,7H,2×P(O)OCH2,CH2OCO,CHNH2),3.91(t,J＝4.0Hz,2H,NCH2CH2),3.78(d,J＝8.0Hz,2H,OCH2P),3.55-3.45(m,2H,2×CHOH),2.87-2.84(m,2H,CH2SCO),2.39-2.30(m,1H),2.23-2.16(m,1H),2.07-1.97(m,4H,OCH2CH2,SCH2CH2),1.97-0.96(m,32H),0.93-0.86(m,12H,4×CH3)；13CNMR(100MHz,CD3OD):δ175.01,174.16,155.47,152.92,149.76,141.34,119.12,71.33,71.16,65.77,64.10,64.06,63.11,63.04,62.86,60.59,60.11,58.91,55.73,54.69,50.73,43.68,43.55,42.41,40.08,39.15,37.25,36.89,35.17,34.90,34.02,31.01,30.29,29.75,29.67,29.34,28.63,26.82,24.77,23.55,21.12,18.35,15.65,12.09,11.63.ESI-MS(m/z)[M+H]+:893.5；HRESIMSm/z(pos):893.4981C44H74N6O9PS(calcd.893.4970)。實(shí)施例49-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤單硫代L-亮氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯的制備(化合物4)以阿德福韋、N-叔丁氧羰基硫代L-亮氨酸-3-溴-1-丙基酯以及熊去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯為反應(yīng)底物，按照類似于實(shí)施例1的方法制備，獲得目標(biāo)化合物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-亮氨酸丙基酯，單熊去氧膽酸丙基酯，收率17.7％。1H-NMR(400MH,CD3OD)：δ8.28(s,1H,2-H),7.94(s,1H,8-H),6.34(brs,2H,NH2),4.41(t,J＝5.6Hz,2H,NCH2),4.23-4.04(m,6H,2×P(O)OCH2,CH2OCO),3.92(t,J＝8.0Hz,2H,NCH2CH2),3.79(d,J＝8.0Hz,2H,OCH2P),3.60-3.52(m,2H,2×CHOH),2.86-2.83(m,2H,CH2SCO),2.37-2.29(m,1H),2.23-2.15(m,1H),1.97-1.91(m,4H,OCH2CH2,SCH2CH2),1.89-0.95(m,30H),0.92-0.89(m,12H,4×CH3)；13CNMR(100MHz,CD3OD):δ175.51,174.17,155.42,149.66,141.43,118.95,71.33,71.27,71.16,65.68,64.05,63.13,63.06,62.80,60.82,60.10,58.36,55.72,54.68,53.42,52.50,50.72,43.66,43.39,43.30,42.40,40.08,39.15,37.23,36.89,35.16,34.90,34.01,31.00,30.96,30.27,29.74,29.67,28.62,24.68,23.34,22.81,21.84,21.12,18.34.ESI-MS(m/z)[M+H]+:893.4；HRESIMSm/z(pos):893.4958C44H74N6O9PS(calcd.893.4970)。實(shí)施例59-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-丙氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯的制備(化合物5)以阿德福韋、N-叔丁氧羰基硫代L-丙氨酸-3-溴-1-丙基酯以及去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯為反應(yīng)底物，按照類似于實(shí)施例1的方法制備，獲得目標(biāo)化合物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-丙氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯，收率14.5％。1H-NMR(400MH,CDCl3)：δ8.32(s,1H,2-H),8.00(s,1H,8-H),6.46(brs,2H,NH2),4.42-4.40(m,2H,NCH2),4.20-4.12(m,7H,2×P(O)OCH2,CH2OCO,CHNH2),3.93(t,J＝4.8Hz,2H,NCH2CH2),3.81(d,J＝8.4Hz,2H,OCH2P),3.61-3.55(m,2H,2×CHOH),2.87-2.82(m,2H,CH2SCO),2.39-2.33(m,1H),2.25-2.17(m,1H),1.98-1.93(m,4H,OCH2CH2,SCH2CH2),1.85-1.01(m,33H),0.93-0.88(m,6H,2×CH3),0.82(s,3H,CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ174.19,171.83,155.48,152.75,149.55,141.93,118.89,71.16,71.04,65.55,63.89,63.43,63.36,63.06,63.00,60.09,57.52,55.72,54.65,50.52,43.61,43.56,43.35,43.35,42.38,40.05,39.15,37.20,36.98,35.15,34.88,33.98,33.14,33.09,31.00,30.93,30.21,29.68,28.60,26.80,23.35,21.09,18.32.ESI-MS(m/z)[M+H]+:851.4；HRESIMSm/z(pos):851.4520C41H68N6O9PS(calcd.851.4501)。實(shí)施例69-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤單硫代L-纈氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯的制備(化合物6)以阿德福韋、N-叔丁氧羰基硫代L-纈氨酸-3-溴-1-丙基酯以及去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯為反應(yīng)底物，按照類似于實(shí)施例1的方法制備，獲得目標(biāo)化合物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-纈氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯，收率17.3％。1H-NMR(400MH,CDCl3)：δ8.32(s,1H,2-H),8.26(s,1H,8-H),4.59(t,J＝4.8Hz,2H,NCH2),4.23(t,J＝6.4Hz,2H,NCH2CH2),4.14-4.04(m,6H,CH2OCO,2×P(O)OCH2),3.99-3.94(m,3H,OCH2P,CHNH2),3.52-3.43(m,2H,2×CHOH),2.87-2.82(m,2H,CH2SCO),2.36-2.33(m,1H),2.27-2.23(m,1H),1.98-1.93(m,4H,OCH2CH2,SCH2CH2),1.86-1.23(m,26H),1.06-1.02(m,6H,2×CH3),0.94-0.92(m,9H,3×CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3):δ174.47,168.84,152.20,149.18,146.88,143.79,119.86,70.77,70.68,70.60,64.44,63.50,63.08,62.79,62.00,60.16,58.05,57.00,56.14,55.13,43.52,43.42,43.14,42.67,40.20,39.35,37.26,36.63,35.34,34.74,33.83,30.93,30.68,29.66,29.46,29.21,28.36,26.61,22.60,21.03,17.59,17.36,16.92,11.32.ESI-MS(m/z)[M+H]+:879.4；HRESIMSm/z(pos):879.4827C43H72N6O9PS(calcd.879.4814)。實(shí)施例79-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-異亮氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯的制備(化合物7)以阿德福韋、N-叔丁氧羰基硫代L-異亮氨酸-3-溴-1-丙基酯以及去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯為反應(yīng)底物，按照類似于實(shí)施例1的方法制備，獲得目標(biāo)化合物9-[2-(膦?；籽趸?乙基]腺嘌呤單硫代L-異亮氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯，收率16.5％。1H-NMR(400MH,CD3OD)：δ8.29(s,1H,2-H),7.92(s,1H,8-H),6.08(brs,2H,NH2),4.40(t,J＝5.6Hz,2H,NCH2),4.18-4.05(m,7H,2×P(O)OCH2,CH2OCO,CHNH2),3.91(t,J＝4.0Hz,2H,NCH2CH2),3.78(d,J＝8.0Hz,2H,OCH2P),3.55-3.45(m,2H,2×CHOH),2.87-2.82(m,2H,CH2SCO),2.39-2.30(m,1H),2.23-2.16(m,1H),2.01-1.95(m,4H,OCH2CH2,SCH2CH2),1.87-0.96(m,32H),0.93-0.86(m,12H,4×CH3)；13CNMR(100MHz,CD3OD):δ175.01,174.16,155.47,152.92,149.76,141.34,119.12,71.33,71.16,65.77,64.10,64.06,63.11,63.04,62.86,60.59,60.11,58.91,55.73,54.69,50.73,43.68,43.55,42.41,40.08,39.15,37.25,36.89,35.17,34.90,34.02,31.01,30.29,29.75,29.67,29.34,28.63,26.82,24.77,23.55,21.12,18.35,15.65,12.09,11.63.ESI-MS(m/z)[M+H]+:893.5；HRESIMSm/z(pos):893.4963C44H74N6O9PS(calcd.893.4970)。實(shí)施例89-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤單硫代L-亮氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯(化合物8)以阿德福韋、N-叔丁氧羰基硫代L-亮氨酸-3-溴-1-丙基酯以及去氧膽酸-3-溴-1-丙基酯為反應(yīng)底物，按照類似于實(shí)施例1的方法制備，獲得目標(biāo)化合物9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤單硫代L-亮氨酸丙基酯，單去氧膽酸丙基酯，收率19.8％。1H-NMR(400MH,CD3OD)：δ8.23(s,1H,2-H),7.91(s,1H,8-H),4.48(t,J＝5.2Hz,2H,NCH2),4.33-4.25(m,2H,NCH2CH2),4.12-4.03(m,6H,CH2OCO,2×P(O)OCH2),3.98-3.86(m,3H,OCH2P,CHNH2),3.54-3.49(m,2H,2×CHOH),2.89-2.82(m,2H,CH2SCO),2.39-2.33(m,1H),2.28-2.20(m,1H),1.99-1.93(m,4H,OCH2CH2,SCH2CH2),1.92-1.23(m,25H),1.18-1.12(m,4H),1.02-0.96(m,9H,3×CH3),0.91(s,6H,2×CH3),0.87-0.82(m,2H)；13CNMR(100MHz,CD3OD):δ175.85,169.85,156.52,152.64,150.67,143.72,119.81,79.51,73.95,72.49,72.20,65.83,64.81,64.26,63.37,61.46,58.27,48.35,48.00,44.56,43.58,37.73,37.40,37.15,36.68,36.40,35.27,34.78,32.17,31.96,31.04,30.77,30.72,30.46,29.88,28.66,28.37,27.45,26.73,24.83,23.69,17.56,14.99,13.18,12.04.ESI-MS(m/z)[M+H]+:893.4；HRESIMSm/z(pos):893.4983C44H74N6O9PS(calcd.893.4970)。實(shí)施例9體外抗病毒實(shí)驗(yàn)9.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器(1)HepG2.2.15細(xì)胞株：HepG2.2.15細(xì)胞株由美國西奈山醫(yī)學(xué)院生化科Acs博士提供，凍存于液氮，每年傳代一次。該細(xì)胞能夠持續(xù)穩(wěn)定分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane顆粒。細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM中。(2)主要試劑及試劑盒：CellCountingKit-8(Dojindo日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)：CP736)，HBVPCR熒光定量檢測試劑盒(深圳市匹基生物工程股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：S20020033，批號(hào)20110120)。阿德福韋酯(國藥準(zhǔn)字H20050803，天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司)，目標(biāo)化合物1-8由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。(3)主要儀器：酶標(biāo)比色儀(Bio-Rad)；iCycler熒光定量PCR儀(Bio－Rad)。9.2試驗(yàn)方法(1)目標(biāo)化合物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用CellCountingKit-8(CCK-8)試劑盒，該試劑可簡便而準(zhǔn)確地分析細(xì)胞增殖情況和藥物毒性作用。取HepG2.2.15細(xì)胞一瓶，用0.25％胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104cell/mL，100μL/孔加入96孔培養(yǎng)板中，置37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天吸棄上清，加入含有不同藥物濃度(1000，100，10和0μM)的DMEM培養(yǎng)基，每組三復(fù)孔。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48h后棄上清，各孔加入100μL(含10μl的CCK-8試劑)的培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)2h，用酶標(biāo)儀檢測450nm處各孔的OD值。計(jì)算化合物對細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度CC50。(2)目標(biāo)化合物抗HBV活性檢測取HepG2.2.15細(xì)胞一瓶，用0.25％胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104cell/ml，1ml/孔加入24孔培養(yǎng)板中，置37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天吸棄上清，加入含有不同藥物濃度(10，1，0.1和0μM)的DMEM培養(yǎng)基，每組三復(fù)孔。每次作用2天后換同樣藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，并于第10天，收集各孔上清至1.5ml離心管中，-20℃凍存?zhèn)溆?。按照以下操作流程檢測HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBVDNA的豐度。操作流程：取待測細(xì)胞上清以及試劑盒中的對照品各100μL，分別加入1.5mL離心管中；加入100μL的DNA提取液，振蕩混勻，13000rpm離心10min；吸棄上清；加入25μl的DNA提取液，室溫放置10min，振蕩混勻，2000rpm離心10sec，沸水浴10min；13000rpm離心10min，保留上清備用。以每孔37.6μL的PCR反應(yīng)液、0.4μl的Taq酶和0.06μL的UNG計(jì)算用量(n＝樣本數(shù)+2管陰性對照+1管強(qiáng)陽性對照+1管臨界陽性對照+4管陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品)，充分混勻后，2000rpm離心10sec，加入38μL/管后加入2μL的DNA液或者對照。BIO-RADiCycler熒光PCR檢測儀的循環(huán)程序設(shè)置如下：37℃5min；94℃1min；95℃5sec，60℃34sec，40個(gè)循環(huán)。計(jì)算化合物對HBV-DNA的半數(shù)抑制濃度(EC50)。CC50(50％CytotoxicConcentration，即對50％宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用時(shí)的藥物濃度)，EC50(50％EffectiveConcentration，即抑制HBV復(fù)制活性50％時(shí)的藥物濃度)，SI(SelectIndex，選擇指數(shù))＝CC50/EC50。9.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)不同稀釋倍數(shù)的藥物加于單層HepG2.2.15細(xì)胞上，每日觀察細(xì)胞生長形態(tài)，并于藥物作用48h后，用CCK-8試劑測定細(xì)胞的活力，計(jì)算各個(gè)藥物的相比生長半數(shù)毒性濃度(CC50)，具體的CC50結(jié)果見表2。(2)細(xì)胞上清HBVDNA的抑制實(shí)驗(yàn)HepG2.2.15細(xì)胞在24孔板培養(yǎng)過夜后，加入不同稀釋濃度的藥物，同時(shí)設(shè)定細(xì)胞對照組和陽性對照組。培養(yǎng)10d后收集細(xì)胞上清，抽提HBVDNA，熒光定量PCR法進(jìn)行定量，計(jì)算目標(biāo)化合物半數(shù)有效濃度(EC50)。具體的EC50結(jié)果見表2。表2不同化合物抗HBV評價(jià)化合物EC50a(μmol/L)CC50b(μmol/L)SIc12.54406.68160.1124.27511.37119.7536.14577.9694.13410.68686.7064.29516.751292.5577.16621.77895.5441.13735.131567.9844.63844.691846.6841.32阿德福韋酯3.86478.33126.51a化合物抑制HBV-DNA復(fù)制達(dá)到50％時(shí)的藥物濃度；b對50％HepG2.2.15宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用時(shí)的藥物濃度；c選擇指數(shù)CC50/EC50。9.4實(shí)驗(yàn)結(jié)論阿德福韋單硫代L-氨基酸丙基酯，單去氧膽酸/熊去氧膽酸丙基酯衍生物(化合物1-8)抗HBV活性測試結(jié)果表明：目標(biāo)化合物均具有不同程度抗HBV活性(EC50＝2.54-44.69μmol/L)，其中化合物1-4具有較強(qiáng)的抗HBV活性(EC50＝2.54-10.68μmol/L)，而在它們中間化合物1抗病毒活性最強(qiáng)，作用選擇性指數(shù)最高(EC50＝2.54μmol/L，SI＝160.11)，化合物1抗HBV活性與作用選擇性指數(shù)高于陽性對照和阿德福韋酯。構(gòu)效關(guān)系提示：化合物1-4的抗病毒活性與作用選擇性(EC50＝2.54-10.68μmol/L，SI＝64.29-160.11)明顯高于化合物5-8的抗病毒活性與選擇性指數(shù)(EC50＝16.75-44.69μmol/L，SI＝41.32-77.16)。表明目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)中含有熊去氧膽酸時(shí)可能更有利于其發(fā)揮抗病毒活性并產(chǎn)生較好作用選擇性。實(shí)施例10原代肝細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)實(shí)施例10.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：3～5日齡及兩周齡的SD乳鼠，雌雄均可，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK黔2012-0001。(2)主要試劑及試劑盒：熒光素鈉(Sigma)，購自Sigma公司；1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Biochrom)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自Sigma公司；BCA法蛋白定量試劑盒(上海捷瑞生物有限公司)；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；鼠尾膠原蛋白Ⅰ(生物制劑，100mL)(Solarbio公司)；兔Streptavidin-HRPKit(DBA)試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；青、鏈霉素(華北制藥股份有限公司)；0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液和Hank′s緩沖溶液(HBSS，Gibco公司)。阿德福韋酯(國藥準(zhǔn)字H20050803，天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司)；目標(biāo)化合物1-4由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。(3)主要儀器：相差顯微觀察系統(tǒng)和CCD照相系統(tǒng)NikonTS-100F(Nikon公司)；超低溫冰箱(ThermoFisher公司)；超高液相三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS)ACQUITYTQD(Low-resolutionmassspectrometer，Waters)。10.2試驗(yàn)方法(1)原代肝細(xì)胞提取與培養(yǎng)采用二部灌流法提取原代肝細(xì)胞。將SD乳鼠水合氯醛麻醉后用剃毛機(jī)剔除大鼠全身毛發(fā)，以75％酒精將大鼠全身消毒后固定于手術(shù)臺(tái)，用手術(shù)剪刀沿腹中線呈十字剪開，暴露并分離肝門靜脈，用止血夾夾住脾靜脈，沿肝門靜脈插入留置針。以預(yù)熱37℃通入氧氣的無鈣灌流液以10mL/min灌流，并同時(shí)剪斷下腔靜脈，沖洗約10min后，以預(yù)熱37℃通入氧氣含膠原酶(50μmol/mL)的含鈣灌流液以10mL/min灌流，消化時(shí)間10min，消化結(jié)束后，迅速分離肝臟并轉(zhuǎn)移至盛有無菌HBSS的培養(yǎng)皿中，迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，將肝臟放入200目篩網(wǎng)上，篩網(wǎng)至于培養(yǎng)皿中，用鑷子輕輕刺破肝，選擇呈現(xiàn)糜爛狀的肝區(qū)用清洗液沖洗刺破區(qū)，輕輕抖動(dòng)篩網(wǎng)即可收集肝細(xì)胞。將肝細(xì)胞濾液再以400目篩網(wǎng)過濾一次。細(xì)胞濾液先以1000rpm離心5min，棄上清液，用清洗液將沉淀物以400rpm離心5min，清洗2次。最后加入含有10％FBS、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。將提取出的原代大鼠肝細(xì)胞按密度為50×104個(gè)每毫升接種于6孔板提取出肝細(xì)胞后，用含有10％FBS的1640培養(yǎng)液置于含有5％CO2，37℃的培養(yǎng)箱中(相對濕度90％)培養(yǎng)。(2)原代大鼠肝細(xì)胞鑒定及安全濃度范圍測定①原代大鼠肝細(xì)胞鑒定在光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)。用以0.6％等張臺(tái)盼蘭溶液與肝細(xì)胞懸液以1:1比例混勻，立即在光學(xué)顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算能夠排出臺(tái)盼藍(lán)而不被染色的活細(xì)胞的百分率，即細(xì)胞活率，以此來檢查和判定細(xì)胞完整性和細(xì)胞活力。用CK18免疫組化試劑盒鑒定肝細(xì)胞特異性。利用臺(tái)盼藍(lán)染色法測得肝細(xì)胞純度及活率約90％，利用CK18免疫組化試劑盒對提取出的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行測定，肝細(xì)胞反應(yīng)呈陽性，提示所提取的原代肝細(xì)胞鑒定正確。②原代大鼠肝細(xì)胞安全濃度范圍測定將提取出的原代大鼠肝細(xì)胞按密度為10×104個(gè)每毫升接種于96孔板，將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80％～90％時(shí)，進(jìn)行藥物濃度測定。將實(shí)驗(yàn)分為空白對照組和樣品組?？瞻讓φ战M每孔加入100μL的1640培養(yǎng)液，給藥組：將受試藥加入質(zhì)量濃度分別為：25、50、100、200、400μmol/l，用5％的DMSO溶解后用1640培養(yǎng)液稀釋，每孔加入100μL，作用肝細(xì)胞24h后用MTT法檢測。每個(gè)濃度平行3孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受試化合物濃度在400μM以下對肝細(xì)胞沒有毒性作用，因此，研究藥物對肝細(xì)胞攝取時(shí)，作用時(shí)間選擇1h之內(nèi)、受試化合物濃度在400μM以下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(3)原代肝細(xì)胞攝取性質(zhì)評價(jià)①不同時(shí)間下肝細(xì)胞的攝取將50μmol/l阿德福韋酯溶液(含0.5％DMSO的1640培養(yǎng)液配制)、阿德福韋單衍生物溶液(含0.5％DMSO的1640培養(yǎng)液配制)以及去氧膽酸溶液(含0.5％DMSO的1640培養(yǎng)液配制)加入肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞接種的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育，分別于孵育5，15，30，60min后取出，用4℃的D-Hanks溶液洗滌3次，每孔加入200μl高效RIPA溶液裂解細(xì)胞，并將培養(yǎng)板放在冰盒上，5min后細(xì)胞裂解，將細(xì)胞裂解液12000×g離心20min，取20μl用BCA試劑盒測定蛋白含量，另取200μl細(xì)胞裂解液加入800μl甲醇，12000×g，離心20min，沉淀蛋白，重復(fù)兩次。最后取上清200μl進(jìn)樣LC-MS/MS分析各底物的肝細(xì)胞攝取量。并用質(zhì)譜對攝取量進(jìn)行測定，計(jì)算肝細(xì)胞中單位蛋白攝取藥物的量。②不同給藥濃度下肝細(xì)胞的攝取取肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞接種的24孔培養(yǎng)板并分組，分別加入質(zhì)量濃度為25，50，100，200，400μmol/l的阿德福韋酯，同等濃度的阿德福韋酯衍生物，及去氧膽酸。將24孔板放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育，孵育60min后取出，同①的方法處理。計(jì)算肝細(xì)胞中單位蛋白攝取藥物的量。③不同溫度下肝細(xì)胞的攝取將肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞接種的24孔培養(yǎng)板，分別加入濃度分別為25，50，100，200，400μmol/l的阿德福韋酯，同等濃度的阿德福韋酯衍生物，及去氧膽酸，將24孔板放入4℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育，孵育60min后取出，同①的方法處理。計(jì)算肝細(xì)胞中單位蛋白攝取藥物的量。④去氧膽酸對肝細(xì)胞攝取藥物的抑制作用取2個(gè)24孔肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞接種的培養(yǎng)板，分為2組向其中一組加入100μmol/l的去氧膽酸溶液，另一組加入空白溶液作為對照，5min后，將上清夜吸出并加入濃度分別為25，50，100，200，400μmol/l的阿德福韋酯，同等濃度的阿德福韋酯衍生物，及去氧膽酸。將24孔放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育，孵育60min后取出，同①的方法處理，計(jì)算肝細(xì)胞中單位蛋白攝取藥物的量。(4)受試化合物UPLC-MS分析方法①色譜條件質(zhì)譜柱WatersVanGuardBEHCl8柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱溫：45℃；流速：0.35mL/min；進(jìn)樣體積：1.5μL；流動(dòng)相：A：含0.1％甲酸的乙腈，B：含0.1％甲酸的水，梯度洗脫：5％A(0-1.5min)，5-100％A(1.5-4min)，5％A(4-6min)。②質(zhì)譜條件采用電噴霧電離源(EI)，毛細(xì)管電壓：3kV，離子源溫度：120℃；噴霧氣與反吹氣：氮?dú)?，去溶劑氣流速?50L·h-1，去溶劑氣溫度：350℃，反吹氣流速為50L·h-1；碰撞氣：氬氣，碰撞氣流速：0.16mL·min-1；掃描方式為選擇離子監(jiān)測(SIR)，正離子模式(ESI+)，用于定量的離子對為(m/z)：501.48(阿德福韋酯)、851.4(化合物1)、879.2(化合物2)、893.4(化合物3)、893.4(化合物4)、851.4(化合物5)、879.2(化合物6)、893.4(化合物7)、893.4(化合物8)；錐孔電壓分別為：30v、30v、50v、35v、45v、40v、35v、40v、50v。(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，采用sigmaplot12.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用one-wayANOVA，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。10.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)不同時(shí)間對受試化合物細(xì)胞攝取的影響(見表3和圖1)表3肝細(xì)胞在不同時(shí)間對受試化合物的攝取(2)不同濃度對受試化合物細(xì)胞攝取的影響(見表4和圖2)表4不同濃度受試化合物對肝細(xì)胞攝取的影響(3)不同溫度對受試化合物細(xì)胞攝取的影響(見表5和圖3-7)表54℃時(shí)不同濃度受試化合物對肝細(xì)胞攝取的影響(4)去氧膽酸對受試化合物原代肝細(xì)胞攝取的影響(見表6和圖8-12)表6去氧膽酸對不同濃度對受試化合物肝細(xì)胞攝取的影響10.4實(shí)驗(yàn)結(jié)論如圖1和2所示，化合物1-4在不同濃度、不同時(shí)間條件下，化合物的攝取量均較阿德福韋酯顯著增加。且化合物3、4在25-200μM與濃度成正比化合物，與200μM攝取增加量開始下降。阿德福韋酯及化合物1和2在25-400μM與濃度呈正比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿德福韋酯、化合物1-3在30min內(nèi)隨時(shí)間的增加攝取增加，30min后隨時(shí)間的增加攝取增加量逐漸降低。說明阿德福韋酯和化合物1-3在30min時(shí)攝取量達(dá)到飽和。為了進(jìn)一步研究攝取機(jī)制，我們研究了4℃和37℃(圖3-7)以及去氧膽酸存在條件下(圖8-12)的攝取。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：(1)受試化合物1-4在4℃比在37℃下攝取量顯著下降，且受試化合物在4℃時(shí)，攝取量趨于穩(wěn)定。肝細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的，是溫度依賴的。在4℃時(shí)經(jīng)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的肝細(xì)胞攝取量是很低的，而在37℃時(shí)，主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)有轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)，因此攝取量會(huì)明顯增高，因此在4℃和37℃下攝取結(jié)果的差異說明受試化合物均是轉(zhuǎn)運(yùn)體主動(dòng)攝取進(jìn)入肝細(xì)胞(如圖3-7所示)。(2)受試化合物在去氧膽酸存在下攝取量顯著下降，且攝取量趨于穩(wěn)定(如圖8-12所示)。說明去氧膽酸競爭肝細(xì)胞對受試化合物的攝取，從而提示受試化合物原代肝細(xì)胞的攝取行為可能是膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的攝取過程。本發(fā)明針對阿德福韋酯抗HBV治療中存在的不足，以前期研究發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)抗病毒活性與較低細(xì)胞毒性的阿德福韋雙硫代L-氨基酸酯為先導(dǎo)化合物，根據(jù)膽汁酸具有的腸肝循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑在提高藥物的肝細(xì)胞靶向性富集能力、減少副作用以及改善腸道對藥物吸收上取得的成功經(jīng)驗(yàn)，采用拼合設(shè)計(jì)原理將其膦酸基團(tuán)上的一個(gè)硫代L-氨基酸酯置換為膽酸酯結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)、合成新型肝靶向性非環(huán)核苷膦酸單硫代L-氨基酸酯，單膽酸酯前藥。本發(fā)明利用阿德福韋單硫代L-氨基酸酯，單膽酸酯前藥結(jié)構(gòu)中的L-氨基酸酯片段提高其抗HBV活性與作用選擇性，利用膽汁酸酯片段提高藥物肝細(xì)胞靶向性富集能力與口服吸收生物利用度，以發(fā)現(xiàn)具有較高肝細(xì)胞靶向性富集能力與抗病毒活性、口服生物利用度提高同時(shí)毒副作用明顯降低的抗HBV非環(huán)核苷膦酸酯前藥。本發(fā)明解決了阿德福韋酯臨床應(yīng)用中存在的肝靶向性富集能力差，非靶器官毒性較大的不足，從而為創(chuàng)制新型抗乙型肝炎病毒感染阿德福韋前藥奠定重要的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。本發(fā)明針對上市或進(jìn)入臨床研究的阿德福韋前藥存在的體內(nèi)過程中釋放細(xì)胞毒性的載體分子、非靶器官毒性較大的不足，設(shè)計(jì)含有內(nèi)源性載體，能實(shí)現(xiàn)藥物肝靶向性富集，同時(shí)毒副作用降低的阿德福韋單硫代L-氨基酸酯，單膽酸酯前藥，其實(shí)施對于研制、開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型抗HBV非環(huán)核苷膦酸酯類藥物具有重要價(jià)值。如在說明書及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可理解，不同地區(qū)可能會(huì)用不同名詞來稱呼同一個(gè)成分。本說明書及權(quán)利要求并不以名稱的差異來作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”為一開放式用語，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”?！按笾隆笔侵冈诳山邮盏恼`差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說明書后續(xù)描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說明本發(fā)明的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。還需要說明的是，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個(gè)……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還存在另外的相同要素。上述說明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3