一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種梨PuADH1基因及其在提高果實香氣中的應用，尤其是一種涉及從‘南果梨’中分離、克隆得到一個果實香氣相關(guān)的乙醇脫氫酶（ADH）家族成員PuADH1基因及其應用。

二、

背景技術(shù)：

香氣是重要的果實品質(zhì)指標之一。果實濃郁的香氣能引導人們的消費趨向，隨著人們生活水平的提高和對果品需求層次的提升，果實香氣品質(zhì)研究也越來越受到重視（Muna et al., 2013）。

梨是一種重要的世界性水果，世界梨栽培品種可分為東方梨（主要包括砂梨、白梨、秋子梨）和西洋梨兩大類。中國是東方梨的生產(chǎn)中心，在世界梨產(chǎn)業(yè)中占有十分重要的地位，而我國主栽的白梨、砂梨系統(tǒng)品種絕大多數(shù)香味較淡，在很大程度上影響了其品質(zhì)的全面提升，香氣淡已成為阻礙我國鮮梨進入國際市場的重要原因?！瞎妗麑嵪銡馐譂庥?，為梨果實香氣育種和研究提供了寶貴試材。

研究人員已從梨果實中檢測到醛類、醇類、酯類、萜類、烴類及含硫化合物等300余種揮發(fā)性物質(zhì)（Rapparini F et al., 2010）。目前，人們對果實揮發(fā)性香氣物質(zhì)的合成路徑已經(jīng)基本明確，即營養(yǎng)物質(zhì)（如脂肪酸、氨基酸、糖）在生物酶催化下衍生而成（Muna et al., 2013）。根據(jù)參與生物合成反應的前體物質(zhì)不同，合成途徑可分為脂肪酸途徑、氨基酸途徑和萜類途徑等（陳發(fā)興等，2010）。脂肪酸途徑是包括梨在內(nèi)的大多數(shù)植物香氣物質(zhì)形成的主要來源（Rodríguez et al., 2013；Qin et al., 2014）。脂肪酸途徑包括α-氧化、β-氧化、γ-氧化和脂氧合酶（LOX）途徑，可合成大多數(shù)的酯類、短鏈醛和醇類化合物。

果實香氣物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶包括：醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）、脂氧合酶（LOX）、乙醇脫氫酶（ADH）、丙酮酸脫羧酶（PDC）等。

乙醇脫氫酶（ADH）是果實醇類揮發(fā)性化合物形成的關(guān)鍵酶，催化相應醇和醛之間的可逆轉(zhuǎn)化。1982年研究人員（Gerlach et al., 1982）首次從玉米幼根中克隆到一個ADH基因，命名為ADH1基因，目前ADH基因己經(jīng)從多種果樹中克隆得到。王紹華（2010）從成熟香蕉果實中克隆到2個ADH基因MaADH1和MaADH2，MaADH2含有典型的ADH基因結(jié)構(gòu)域，可能在香蕉生長發(fā)育中起作用。ADH基因的表達受多種因素調(diào)控，ADH基因以動態(tài)調(diào)控的方式參與果實香氣合成，如番茄ADH2基因的過表達通過增加醇（尤其是3Z-己烯醇）的含量，提高果實香氣（Speirs et al., 1998）。Tesnière等（2000）從生長發(fā)育期葡萄果實中克隆到3個ADH基因VvADH1、VvADH2、VvADH3，Northern雜交表明VvADH2基因在葡萄漿果轉(zhuǎn)熟期時表達量開始顯著上升，且ADH活性隨之上升，1-MCP處理表明VvADH2的表達和ADH的活性可能受乙烯調(diào)控。

對于果實香氣合成代謝機理的研究，將有助于提高其香氣品質(zhì)，更關(guān)系到梨果實綜合品質(zhì)的提高，提升我國梨產(chǎn)業(yè)競爭力，具有重要的科學意義和應用價值。。

基于現(xiàn)有的技術(shù)問題、技術(shù)特征和技術(shù)效果，做出本發(fā)明的申請技術(shù)方案。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的客體是一種梨PuADH1基因：

本發(fā)明的客體是一種梨PuADH1基因的在提高果實香氣中的應用：本發(fā)明的客體是一種梨PuADH1基因分離克隆及表達分析的方法：

本發(fā)明的客體是一種梨PuADH1基因亞細胞定位方法。

為了克服上述技術(shù)缺點，本發(fā)明的目的是提供一種梨PuADH1基因及其在提高果實香氣中的應用，因此從香氣濃郁的‘南果梨’果實中獲得了與香氣合成相關(guān)的基因，證明其可能參與番茄果實香氣合成，從而擴展了果實香氣合成的分子調(diào)控途徑，另外，克隆梨中有關(guān)香氣合成的基因很大程度上提高果實香氣品質(zhì)，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也具有非常重要的理論和實踐意義。

為達到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：梨PuADH1基因，來自于果樹梨‘南果梨’，名稱為PuADH1，是如下基因：基因全長1683 bp，BLAST的結(jié)果分析證明從‘南果梨’中新得到的基因為一個ADH基因家族成員。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，屬于ADH家族成員， cDNA開放閱讀框（ORF）1683bp，編碼561個氨基酸；經(jīng)Blast分析，Aldehyde dehydrogenase family 3 member I1蛋白屬于ALDH-SFsuperfamily 家族，其與蘋果ADH氨基酸同源性較高；編碼氨基酸理論分子量為137.826kDa，理論等電點為4.99，原子組成為C₅₀₈₈H₈₄₉₅N₁₆₈₃O₂₁₂₉S₃₂₈，總原子數(shù)為17723；該蛋白由4種氨基酸組成，總平均疏水性為0.745，脂質(zhì)指數(shù)為 29.95，說明該蛋白是親水性蛋白；其不穩(wěn)定系數(shù)為40.74，說明該蛋白是一個不穩(wěn)定蛋白。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，含有所述PuADH1基因的宿主菌。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，克隆所述PuADH1基因cDNA序列的引物對，

F：5′- CCCCCGGGATGAAAGGCCTCTGCATTGA-3′；

R：5′-CGGGATCCTCATTTAGACCATCCAATCAG-3′。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，對所述PuADH1基因的進一步研究表明，該基因在促進番茄果實香氣合成中的應用。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，含有所述PuADH1基因的重組表達載體。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，重組表達載體優(yōu)選以pRI101為出發(fā)載體，用T4連接酶將目的基因定向連接到pRI101載體Xma I 和BamH I位點上，構(gòu)建重組表達載體PRI101-PuADH1。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述的重組表達載體在促進番茄果實香氣中的應用。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，一種梨PuADH1基因分離克隆及表達分析的方法，其步驟為：

從‘南果梨’果實中抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA用于擴增PuADH1基因全長，

RNA抽提使用Trizol試劑盒，抽提1μg總RNA樣品經(jīng)1U Dnase，第一鏈cDNA的合成用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒，擴增基因引物對為：

PuADH1-F: 5’-ATGTCTAATACTGCTGGTCAGG -3’；

PuADH1-R: 5’ -CATAATCCACATGGAGGAATGA -3’；

用RT-PCR方法擴增‘南果梨’PuADH1基因編碼的序列全長，25 μl反應體系包括：200 ng cDNA，1×緩沖液即ransStart FastPfu Buffer，l0 mM dNTP，l U Taq 聚合酶即TransStart FastPfu DNA Polymerase，1.0 μM上述引物，

反應程序：94 ℃，3 min；94 ℃變性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃，10 min。產(chǎn)生一條特異條帶產(chǎn)物，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒回收純化的DNA溶液與pMD-19T載體進行連接、轉(zhuǎn)化及鑒定，具體方法參照按照分子克隆實驗手冊進行。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，一種梨PuADH1基因亞細胞定位方法，其步驟：

用大腸桿菌菌株為E.coli March（Invitrogen），農(nóng)桿菌菌株為GV3101，用于轉(zhuǎn)化擬南芥，入門載體為pENTR/D/TOPO vector（Invitrogen），目標載體為GW-GFP，

2.1表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

(1)從-80 ℃取出 GV3101 感受態(tài)細胞（200 μL），冰上解凍，立即加1-5 μL 質(zhì)粒DNA，

(2)冰上放置5 min，

(3)液氮中冷凍 5 min，

(4)37℃水浴5 min，

(5)加入無抗生素的 YEP 液體培養(yǎng)基 1 mL，28 ℃搖床培養(yǎng) 2 h，

(6)4000 rpm，室溫下離心5 min，收集菌體，用100 μLYEP 溶液重新懸浮菌體，

(7)將菌液均勻涂布于YEP固體選擇培養(yǎng)基上，28 ℃靜置培養(yǎng) 2-3 d，

(8)長出菌落后，挑取單菌落劃線于含抗生素的YEP 固體平板上，48 h后進行菌落 PCR 鑒定，

2.2擬南芥葉肉原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化

按照擬南芥葉肉原生質(zhì)體的制備方法和PEG 介導的轉(zhuǎn)化過程的方法，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)16 h的原生質(zhì)體用激光共聚焦掃描隧道顯微鏡進行觀察，原生質(zhì)體的制備過程如下：

(1)取溫室環(huán)境中健康生長的、大小合適的擬南芥葉子，用膠帶撕掉葉子的下表皮，暴露葉肉細胞，將葉肉細胞朝向酶解液放于培養(yǎng)皿中，

酶解液的配方如下：

Cellulase R10 1 %

Macerozyme R10 0.25 %

甘露醇 0.4 M

CaCl₂ 100 mM

KCl 20 mM

BSA 0.1 %

MES 20 mM

用 1 M的KOH調(diào) PH至 5.7，酶解液需要現(xiàn)配現(xiàn)用，

(2)培養(yǎng)皿放于搖床上，光下40 rpm降解2 h左右，鏡檢可見大量的原生質(zhì)體即可，

(3)收集原生質(zhì)體，100 g 離心 3 分鐘，棄上層液體，

(4)冰預冷的 W5 solution 漂洗原生質(zhì)體2次，100 g 離心3 min，棄上清，

W5 solution 的配方如下：

NaCl 154 mM

CaCl₂ 125 mM

KCl 5 mM

葡萄糖 5 mM

MES 2 mM

用 1 M 的KOH調(diào) PH 至 5.7，4 ℃冰箱中，可以保存一周，

(5)將原生質(zhì)體懸浮于W5 solution 中，置于冰上冷卻 30 min，此時可進行原生質(zhì)體密度計數(shù)，

(6)100 g 離心 3 min，收集原生質(zhì)體，重懸于 Mmg solution 中，保證原生質(zhì)體的終濃度為 2-5×10⁵細胞/m L，

Mmg solution 的配方如下：

甘露醇 0.4 M

Mg Cl₂ 15 mM

MES 4 mM

用 1 M 的KOH調(diào) PH 至 5.7，保存于 4 ℃冰箱中備用，

原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化過程如下：

（1）室溫下，取 200 L Mmg solution，其中包含大約 10⁵個原生質(zhì)體，加入 30 g 需要轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，

（2）加等體積現(xiàn)配的 PEG solution，混合好的液體室溫放置 5 min，PEG solution 的配方如下：

PEG 4000 40 % (w/v)

Ca Cl₂ 0.1 M

甘露醇 0.2 M

（3）5 min后緩慢加入 1 mL W5 solution，輕緩混合，

（4）100 g 離心 1 min，用 W5 solution 洗 2 次，最后用 200 L 左右的 W5 solution重懸，鋪于用 1 %的 BSA 潤洗過的12 孔板中，

（5）在全光照條件下，培養(yǎng) 16 h，即可觀察，

2.3激光共聚焦掃描隧道顯微鏡觀察及圖像處理

熒光雙標記材料觀察所用的顯微鏡為LSM780（Zeiss），其余材料均使用 TCS SP5（Leica）顯微鏡進行觀察。熒光雙標記觀察的光路為雙通道，GFP 激發(fā)光波長為 505 nm，接受光波長范圍為 505-550 nm，RFP 激發(fā)光波長為 545 nm，接受光波長范圍為575-650 nm。得到的圖片進行 Pearson coefficients 分析，以確定熒光蛋白的共定位情況，

2.4亞細胞定位檢測

將帶有GFP標記融合蛋白轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，通過激光共聚焦掃描隧道顯微鏡觀察蛋白的定位情況。通過熒光定位的觀察分析，說明基因定位情況，

為了確定PuADH1基因編碼蛋白在細胞中發(fā)揮功能的具體位置，構(gòu)建了基因與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達載體，利用農(nóng)桿菌介導將帶有GFP標記的融合蛋白轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，通過激光共聚焦掃描隧道顯微鏡觀察蛋白的定位情況。

在本技術(shù)方案中，PuADH1基因為重要技術(shù)特征，在梨PuADH1基因及其在提高果實香氣中的應用的技術(shù)領(lǐng)域中，具有新穎性、創(chuàng)造性和實用性，在本技術(shù)方案中的術(shù)語都是可以用本技術(shù)領(lǐng)域中的專利文獻進行解釋和理解。

四、附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明的PuADH1基因的cDNA全長及編碼的氨基酸：

圖2為PuADH1基因在‘南果梨’果實成熟后熟過程中的表達：

圖3 為擬南芥原生質(zhì)體介導的PuADH1基因亞細胞定位：

BF:明場; GFP:綠色熒光蛋白

圖4 為PuADH1基因在番茄中的遺傳轉(zhuǎn)化體系：

圖5 為轉(zhuǎn)基因番茄植株DNA的提取和PCR檢測：

圖6為野生型番茄和轉(zhuǎn)基因番茄形態(tài)表型。

五、具體實施方式

根據(jù)審查指南，對本發(fā)明所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語應當理解為不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

在本發(fā)明的描述中，需要說明的是，術(shù)語“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“內(nèi)”、“外”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，術(shù)語“第一”、“第二”、“第三”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性。

在本發(fā)明的描述中，需要說明的是，除非另有明確的規(guī)定和限定，術(shù)語“安裝”、“相連”、“連接”應做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或一體地連接；可以是機械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內(nèi)部的連通。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以具體情況理解上述術(shù)語在本發(fā)明中的具體含義。

此外，下面所描述的本發(fā)明不同實施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互結(jié)合。

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步描述，以下實施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的進一步限定。其步驟是：

PuADH1基因分離克隆及表達分析

從‘南果梨’果實中抽提RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA用于擴增PuADH1基因全長。

RNA抽提使用Trizol試劑盒，抽提1μg總RNA樣品經(jīng)1U DNase。第一鏈cDNA的合成用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒，擴增基因引物對為：

PuADH1-F: 5’-ATGTCTAATACTGCTGGTCAGG -3’；

PuADH1-R: 5’ -CATAATCCACATGGAGGAATGA -3’；

用RT-PCR方法擴增‘南果梨’PuADH1基因編碼的序列全長。25 μl反應體系包括：200 ng cDNA，1×緩沖液（ransStart FastPfu Buffer），l0 mM dNTP，l U Taq 聚合酶（TransStart FastPfu DNA Polymerase）（前述緩沖液和Taq聚合酶購自TRANS公司），1.0 μM上述引物。反應程序：94 ℃，3 min；94 ℃變性30 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃，10 min。產(chǎn)生一條特異條帶產(chǎn)物，經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒回收純化的DNA溶液與pMD-19T載體（TaKaRa公司）進行連接、轉(zhuǎn)化及鑒定，具體方法參照按照分子克隆實驗手冊進行，

測序結(jié)果表明，克隆的PuADH1基因全長為1683 bp，其核苷酸序列如圖1所示，BLAST的結(jié)果分析證明從梨中新得到的基因為一個ADH基因家族成員，申請人將這個基因命名為PuADH1。

為分析PuADH1基因在果實香氣合成過程是否有所響應，采用實時定量PCR分析該基因在‘南果梨’果實成熟后熟過程的表達模式。結(jié)果表明，該基因在梨果實成熟后熟過程中高度表達如圖2。

在本實施例中，Trizol試劑盒購自TakaRa，1U DNase 購自Thermo公司。PuADH1基因亞細胞定位

本實驗用大腸桿菌菌株為E.coli March（Invitrogen），農(nóng)桿菌菌株為GV3101，用于轉(zhuǎn)化擬南芥。入門載體為pENTR/D/TOPO vector（Invitrogen）。目標載體為GW-GFP。

2.1表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

(1)從-80 ℃取出 GV3101 感受態(tài)細胞（200 μL），冰上解凍，立即加1-5 μL 質(zhì)粒DNA。

(2)冰上放置5 min。

(3)液氮中冷凍 5 min。

(4)37℃水浴5 min。

(5)加入無抗生素的 YEP 液體培養(yǎng)基 1 mL，28 ℃搖床培養(yǎng) 2 h。

(6)4000 rpm，室溫下離心5 min，收集菌體，用100 μLYEP 溶液重新懸浮菌體。

(7)將菌液均勻涂布于YEP固體選擇培養(yǎng)基上，28 ℃靜置培養(yǎng) 2-3 d。

(8)長出菌落后，挑取單菌落劃線于含抗生素的YEP 固體平板上，48 h后進行菌落 PCR 鑒定

2.2擬南芥葉肉原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化

擬南芥葉肉原生質(zhì)體的制備參照（Wu et al., 2009）的方法，PEG 介導的轉(zhuǎn)化過程參照（Yoo et al., 2007）的方法。轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)16 h的原生質(zhì)體用激光共聚焦掃描隧道顯微鏡進行觀察。原生質(zhì)體的制備過程如下：

(1)取溫室環(huán)境中健康生長的、大小合適的擬南芥葉子，用膠帶撕掉葉子的下表皮，暴露葉肉細胞，將葉肉細胞朝向酶解液放于培養(yǎng)皿中。

酶解液的配方如下：

Cellulase R10 1 %

Macerozyme R10 0.25 %

甘露醇 0.4 M

CaCl₂ 100 mM

KCl 20 mM

BSA 0.1 %

MES 20 mM

用 1 M的KOH調(diào) PH至 5.7，酶解液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

(2)培養(yǎng)皿放于搖床上，光下40 rpm降解2 h左右，鏡檢可見大量的原生質(zhì)體即可。

(3)收集原生質(zhì)體，100 g 離心 3 分鐘，棄上層液體。

(4)冰預冷的 W5 solution 漂洗原生質(zhì)體2次，100 g 離心3 min，棄上清。

W5 solution 的配方如下：

NaCl 154 mM

CaCl₂ 125 mM

KCl 5 mM

葡萄糖 5 mM

MES 2 mM

用 1 M 的KOH調(diào) PH 至 5.7，4 ℃冰箱中，可以保存一周。

(5)將原生質(zhì)體懸浮于W5 solution 中，置于冰上冷卻 30 min，此時可進行原生質(zhì)體密度計數(shù)。

(6)100 g 離心 3 min，收集原生質(zhì)體，重懸于 Mmg solution 中，保證原生質(zhì)體的終濃度為 2-5×10⁵細胞/m L。

Mmg solution 的配方如下：

甘露醇 0.4 M

Mg Cl₂ 15 mM

MES 4 mM

用 1 M 的KOH調(diào) PH 至 5.7，保存于 4 ℃冰箱中備用。

原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化過程如下：

（1）室溫下，取 200 L Mmg solution，其中包含大約 10⁵個原生質(zhì)體。加入 30 g 需要轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。

（2）加等體積現(xiàn)配的 PEG solution，混合好的液體室溫放置 5 min。PEG solution 的配方如下：

PEG 4000 40 % (w/v)

Ca Cl₂ 0.1 M

甘露醇 0.2 M

（3）5 min后緩慢加入 1 mL W5 solution，輕緩混合。

（4）100 g 離心 1 min，用 W5 solution 洗 2 次，最后用 200 L 左右的 W5 solution重懸，鋪于用 1 %的 BSA 潤洗過的12 孔板中。

（5）在全光照條件下，培養(yǎng) 16 h，即可觀察。

2.3激光共聚焦掃描隧道顯微鏡觀察及圖像處理

熒光雙標記材料觀察所用的顯微鏡為LSM780（Zeiss），其余材料均使用 TCS SP5（Leica）顯微鏡進行觀察。熒光雙標記觀察的光路為雙通道，GFP 激發(fā)光波長為 505 nm，接受光波長范圍為 505-550 nm，RFP 激發(fā)光波長為545 nm，接受光波長范圍為575-650 nm。得到的圖片進行 Pearson coefficients 分析，以確定熒光蛋白的共定位情況（French et al., 2008）。

2.4亞細胞定位檢測

將帶有GFP標記融合蛋白轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，通過激光共聚焦掃描隧道顯微鏡觀察蛋白的定位情況。通過熒光定位的觀察分析，說明基因定位情況。

為了確定PuADH1基因編碼蛋白在細胞中發(fā)揮功能的具體位置，構(gòu)建了基因與綠色熒光蛋白（GFP）的融合表達載體，利用農(nóng)桿菌介導將帶有GFP標記的融合蛋白轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，通過激光共聚焦掃描隧道顯微鏡觀察蛋白的定位情況。結(jié)果表明，PuADH1基因定位在細胞質(zhì)中如圖3。

在本實施例中，原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化的無機藥品均購自Sigma 公司，Cellulase R10 和Macreozyme R10 均購于Yakult Pharmaceutical 公司。

植物轉(zhuǎn)化超表達載體的構(gòu)建

以‘南果梨’總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，克隆PuADH1基因的ORF全長。雙酶切連接植物過表達載體pRI101。以煙草花葉病毒強啟動子35S啟動該基因的過量表達。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，保存?zhèn)溆谩?/p>

番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化植株分子鑒定

根癌農(nóng)桿菌介導的番茄遺傳轉(zhuǎn)化具體步驟：

4.1 番茄播種

取飽滿無病的番茄種子（micro-TOM），用75 %乙醇消毒2 min，用無菌水沖洗2遍。4 % 次氯酸鈉消毒15 min（置于搖床上震蕩，轉(zhuǎn)速為180rpm），無菌水沖洗3-4遍，用尖頭鑷子在組培瓶中的MS培養(yǎng)基上進行播種。在暗處生長4-5 d，待發(fā)芽后，轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)2-3天即可切子葉。將番茄子葉切成1 cm左右的小段，正面朝上平鋪在平板（直徑9 cm）MS培養(yǎng)基上，加玉米素和IAA（玉米素終濃度為5 mg/L，IAA 濃度為0.2 mg/L），轉(zhuǎn)移至暗處進行培養(yǎng)。

4.2活化農(nóng)桿菌

取5微升保存的農(nóng)桿菌菌液，轉(zhuǎn)移到20 ml LB液體培養(yǎng)基中，加卡那霉素50 mg/L、利福平50 mg/L。搖床上（28 ℃，200 rpm）培養(yǎng)2 d。取1 ml菌液加到20 ml 液體LB（含卡那霉素、利福平和乙酰丁香酮）中，搖菌約5-6 h（一般6 h左右菌液呈現(xiàn)金黃色即可）。

4.3轉(zhuǎn)化侵染

20 ml液體MS中加1 ml活化的農(nóng)桿菌菌液（若菌液比較清可加2 ml）。將切好的子葉加入侵染液，侵染不超過15 min。用滅菌濾紙吸干菌液，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)MS培養(yǎng)基上（玉米素終濃度為2 mg/L，IAA 濃度為0.5 mg/L）暗培養(yǎng)2 d。轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基（玉米素終濃度為5 mg/L，IAA濃度為 0.2 mg/L，CB濃度為100 mg/L，卡那濃度為50 mg/L）上，光暗交替下培養(yǎng)（25 ℃，光10 h，暗14 h）。

4.4轉(zhuǎn)基因植株的獲得

培養(yǎng)的番茄子葉上分化出莖尖生長點后，將生長點切下，轉(zhuǎn)移到組培瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。生長點生長至3 cm時，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中（MS，IAA 0.1 mg/L，CB 250 mg/L）促其生根。待其生根并長至瓶口高度時，轉(zhuǎn)移到育苗基質(zhì)中煉苗。煉苗完成后，取樣提取DNA，通過PCR驗證轉(zhuǎn)基因如圖4和圖5。

轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察及香氣測定

5.1轉(zhuǎn)基因植株表型觀察

比較了超表達‘南果梨’果實PuADH1基因的番茄植株、果實和野生型番茄植株、果實的形態(tài)表型差異，結(jié)果表明，過表達PuADH1基因番茄植株和果實形態(tài)表型較對照沒有明顯的改變，結(jié)果如圖6所示。

5.2 轉(zhuǎn)基因番茄葉片和果實香氣成分的測定

番茄果實和葉片香氣成分測定按照Tieman的方法。將番茄果實切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，稱取100 g左右裝入玻璃管。稱取50g左右番茄葉片，整片塞入玻璃管，并避免機械傷。用帶孔橡膠塞密封玻璃管，Super Q柱吸附1 h左右。吸附結(jié)束后往Super Q柱上添加5 μL的3-壬酮作為內(nèi)標，用150 μL二氯甲烷洗脫Super Q柱。樣品用于GC-MS檢測，GC-MS運行和檢測按照Schmelz的方法。

表1 轉(zhuǎn)基因番茄葉片和果實揮發(fā)性物質(zhì)變化（μg/g）

表1結(jié)果表明，超表達PuADH1基因使番茄葉片和果實揮發(fā)性香氣物質(zhì)發(fā)生了顯著變化。轉(zhuǎn)PuADH1基因番茄葉片香氣物質(zhì)總量較對照增加了53.27 %，其中醇類、酯類、烯烴類分別較對照提高了85.41%、60.44 %、55.18 %。轉(zhuǎn)PuADH1基因番茄果實香氣總量較對照提高了103.84 %，其中醇類增加最為顯著，增加了332.32 %，醛類增加了104.87 %，酯類增加了61.26 %，烯烴類增加了45.39 %。

梨PuADH1基因分離克隆及表達分析的方法和PuADH1基因亞細胞定位方法都是以南果梨’果實為基礎(chǔ)，在梨PuADH1基因應用上具有重要的作用。

上述實施例只是本發(fā)明所提供的梨PuADH1基因及其在提高果實香氣中的應用的一種實現(xiàn)形式，根據(jù)本發(fā)明所提供的方案的其他變形，增加或者減少其中的成份或步驟，或者將本發(fā)明用于其他的與本發(fā)明接近的技術(shù)領(lǐng)域，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

PuADH1基因的cDNA全長及編碼的氨基酸

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