本發(fā)明屬于中藥制備技術領域，具體涉及一種燈盞花乙素苷元衍生物及其制備方法、制劑與應用。
背景技術：
心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類，特別是中老年人健康的常見病，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達1500萬人，居各種死因首位。目前，我國心腦血管疾病患者已經(jīng)超過2.7億人，我國每年死于心腦血管疾病近300萬人，占我國每年總死亡病因的51%。心腦血管疾病已成為人類死亡病因最高的頭號殺手，也是人們健康的“無聲兇煞”。心腦血管疾病具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復發(fā)率高，并發(fā)癥多” ，即“四高一多”的特點。即使應用目前最先進、完善的治療手段，仍可有50%以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理，而幸存下來的患者75%不同程度喪失勞動力，40%重殘，由此導致的家庭、醫(yī)療和經(jīng)濟負擔已成為不可小覷的社會問題。因此研制更多療效顯著、安全的心腦血管疾病治療藥物是極為迫切的事情。
在中國血栓性疾病已經(jīng)成為了各種疾病中最主要至殘和致死的的病因之一。這些疾病包括：急性冠脈綜合征：包括不穩(wěn)定心絞痛和心肌梗死，心臟猝死，外周動脈阻塞，缺血性中風，深靜脈血栓(DVT)，肺動脈栓塞等。盡管目前對以上血栓性疾病的治療手段和藥物上有了長足的進步，但由于這些藥物均存在不同程度的缺陷，如抗血栓作用不強或因完全阻斷了機體的抗凝機制而觸發(fā)內(nèi)出血現(xiàn)象。因此臨床上可以選擇的治療手段和藥物仍然十分有限，急需更有效而且安全性更高的抗血栓新藥來替代現(xiàn)有的治療方法，以滿足目前日益增長的臨床需求。
分子病理學研究顯示體內(nèi)血栓的形成過程主要有血小板聚集激活和血液凝固反應激活兩大機制參與。兩個機制各有不同的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)。阿司匹林和雷比格雷是強烈的血小板聚集抑制劑，在臨床上常用于血栓防治。而肝素鈉，磺達肝素和法華林則屬于抗凝劑，作用于血液凝集通路，在臨床上也廣泛使用于各種血栓性疾病的預防與治療。但上述兩大常規(guī)抗血栓藥物的一個主要副作用就是部分患者使用之后引發(fā)內(nèi)出血。
血液凝固即液體狀態(tài)血液變成固體凝膠或凝塊的過程。其主要機制為凝血酶將可溶性纖維蛋白原轉化為不溶性鉸鏈狀纖維蛋白絲，這是復雜的凝血級聯(lián)反應中的最后一步。凝血酶主要通過兩條激活通路形成：1、內(nèi)源性通路：引發(fā)于因子十二(XIIa)的活化；2、外源性通路：引發(fā)于分布在血管內(nèi)壁細胞表面的組織因子與因子七的結合。凝血因子Xa是一種絲氨酸蛋白酶, 位于血液凝集級聯(lián)的上游, 處在連接內(nèi)源性和外源性激活途徑共同通路的中心位置, 它既能阻斷內(nèi)源性凝血亦能抑制外源性凝血的發(fā)生，是當今抗血栓藥物研究的的最新靶點。研究表明在凝集通路中一個分子的Xa可以激活并產(chǎn)生出數(shù)百個分子的凝血酶，因此抗Xa活性是一種比抑制凝血酶更有效的阻止纖維蛋白形成的手段。已有大量的體內(nèi)、體外實驗證據(jù)表明Xa抑制對阻止纖維蛋白的形成比抑制凝血酶的作用要強，而且持續(xù)時間要長得多。此外Xa特異性抑制劑對凝血酶無抑制作用，因而不會影響到已經(jīng)形成的凝血酶的活性，從而減少了患者使用后潛在的內(nèi)出血風險。因此針對Xa抑制劑的研究已經(jīng)成為當代抗血栓新藥研究公認的潮流。例如2008年上市的利伐沙班、2011年上市的依杜沙斑以及2012年上市的阿哌沙班。其他新的Xa因子抑制劑如 letaxaban， darexaban，eribaxaban LY517717等相繼進入了不同階段的試驗。
燈盞花乙素苷元，又叫野黃芩苷元，金黃紫堿（Scutellarein,CAS:529-53-3,分子式C15H10O6,分子量：286.24），其結構式如下：
燈盞花乙素苷元具有較強的生物活性。由于燈盞花乙素苷元水溶性和脂溶性都十分差，難透過生物膜，故吸收較差，生物利用度極低，另外，燈盞花乙素苷元分子中含有4個酚羥基，易氧化變性。因此，藥物設計家紛紛合成大量的新化合物，以期在藥理作用不變的情況下，增強新化合物的水溶性或脂溶性，降低氧化性從而提高藥物穩(wěn)定性，最終發(fā)現(xiàn)藥理活性更強、更穩(wěn)定的藥物。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的在于提供一種燈盞花乙素苷元衍生物；第二目的在于提供所述燈盞花乙素苷元衍生的制備方法；第三目的在于提供所述燈盞花乙素苷元衍生物的制劑；第四目的在于提供所述燈盞花乙素苷元衍生物的應用。
本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的燈盞花乙素苷元衍生物具有下述結構：
其中，R為具有生物活性的化合物殘基。
本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，是以原料4-氟苯硼酸、3-氟苯硼酸、4-苯基苯硼酸、4-三氟基苯硼酸或4-硼酸吡啶與原料氯代三甲氧基色原酮發(fā)生偶聯(lián)反應得到目標物燈盞花乙素苷元衍生物。
該反應的反應式為：
。
本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，所述的燈盞花乙素苷元衍生物中加入藥學上接受的輔料制備成片劑、膠囊劑、注射液或凍干粉針劑。
本發(fā)明的第四目的是這樣實現(xiàn)的，所述的燈盞花乙素苷元衍生物在制備深靜脈血栓、肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風和血液凝集疾病藥物中的應用。
本發(fā)明所述燈盞花乙素苷元衍生物具有明顯的抗凝血作用，可用于作為潛在的先導化合物，在制備治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風和其他與血液凝集相關的疾病的藥物中運用。本發(fā)明所述的燈盞花苷元衍生物的制備方法簡單易行，重現(xiàn)性好，環(huán)境污染小，可用于所述的燈盞花苷元衍生物的大量制備。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物具有下述結構：
其中，R為具有生物活性的化合物殘基。
R為、、、或。
本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物的制備方法，是以原料4-氟苯硼酸、3-氟苯硼酸、4-苯基苯硼酸、4-三氟基苯硼酸或4-硼酸吡啶與原料氯代三甲氧基色原酮發(fā)生偶聯(lián)反應得到目標物燈盞花乙素苷元衍生物。
所述的制備方法是以原料4-氟苯硼酸、3-氟苯硼酸、4-苯基苯硼酸、4-三氟基苯硼酸或4-硼酸吡啶在鈀催化劑和有機溶劑存在下，與氯代三甲氧基色原酮發(fā)生偶聯(lián)反應得到目標物燈盞花乙素苷元衍生物。
該反應的反應式為：
催化劑是指能提高化學反應速率，而本身結構不發(fā)生永久性改變的物質(zhì)。
所述的鈀催化劑為三苯基磷鈀。
有機溶劑是指溶劑中包含碳原子的能溶解不溶于水的物質(zhì)的一類有機化合物，包括鏈烷烴、烯烴、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烴、氫化烴、萜烯烴、鹵代烴、雜環(huán)化物、含氮化合物及含硫化合物等多類物質(zhì)，在常溫常壓下呈液態(tài)，具有較大的揮發(fā)性，在溶解過程中，溶質(zhì)與溶劑的性質(zhì)均無改變。
所述的有機溶劑為鏈烷烴、烯烴、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烴、氫化烴、萜烯烴、鹵代烴、雜環(huán)化合物、含氮化合物或含硫化合物。
所述的有機溶劑為二氧六環(huán)、叔丁基甲基醚或四氫呋喃。
本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物的制劑為所述的燈盞花乙素苷元衍生物中加入藥學上接受的輔料制備成片劑、膠囊劑、注射液或凍干粉針劑。
本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物的應用為所述的燈盞花乙素苷元衍生物在制備深靜脈血栓、肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風和血液凝集疾病藥物中的應用。
纖維蛋白原在凝血酶的作用下可以轉變?yōu)槔w維蛋白，凝血酶時間（thrombin time，TT）是反映凝血酶使纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白的時間，常用于檢測藥物對于外源性凝血系統(tǒng)的影響。在一個具體實施方案中，本發(fā)明參照Markwardt的凝血酶滴定方法考察本發(fā)明所述化合物對凝血酶時間的影響。結果顯示不加藥物時，纖維蛋白原與凝血酶作用，約25s發(fā)生凝固，加入肝素（Heparin，0.725mg/mL)后，纖維蛋白原與凝血酶作用約40.5s發(fā)生凝固。而本發(fā)明所述燈盞花乙素苷元衍生物在各濃度（0.725 mg/mL，1.25 mg/mL和2.5mg/mL）均可顯著延長纖維蛋白原的凝結時間（p<0.05）。表明本發(fā)明所述燈盞花乙素苷元衍生物對于外源性凝血系統(tǒng)的影響顯著，具有明顯的抗凝血作用。
在本發(fā)明的另一具體實施例中，建立凝血因子十（FXa）抑制劑活性檢測的反應體系，根據(jù)凝血因子十（FXa）水解底物的熒光基團產(chǎn)生熒光，來檢測化合物對凝血因子十（FXa）的抑制活性。結果顯示KPC-4000001號化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.14uM，KPC-4000002號化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.21uM，KPC-4000003號化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.15uM，KPC-4000004號化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.19uM，KPC-4000005號化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.36uM，利伐沙班的IC50值為0.23nM。表明本發(fā)明所述化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）對凝血因子十（FXa）具有明顯的抑制作用。
綜上所述，本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物具有明顯的抗凝血的作用，可用于作為潛在的先導化合物，在制備治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風和其他與血液凝集相關的疾病的藥物中運用。
本發(fā)明所述的化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）可以和常規(guī)的輔料組合制成治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風和其他與血液凝集相關的疾病的藥物，包括口服液、顆粒劑、片劑、丸劑、散劑、膠囊劑和滴丸劑等。
本發(fā)明還提供了一種藥物制劑，包括治療有效量的本發(fā)明所述化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）和藥學上可接受的輔料。本領域技術人員可將所述化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）直接或間接加入制備不同劑型時所需的藥學上可接受的各種常用輔料，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、粘合劑等，以常規(guī)藥物制劑方法，制成常用制劑如片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。其中，填充劑如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解劑如瓊脂，碳酸鈣，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸鹽和碳酸鈉，低取代羥丙基纖維素；潤滑劑如滑石粉，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，月桂硫酸鈉；粘合劑如羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯膠。
本發(fā)明所述的化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）是全新結構的化合物，具有明顯的抗凝血作用，可用于作為潛在的先導化合物，在制備治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風和其他與血液凝集相關的疾病的藥物中運用。本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物的制備方法簡單易行，重現(xiàn)性好，環(huán)境污染小，可用于燈盞花乙素苷元衍生物的大量制備。
下面以具體實施案例對本發(fā)明作進一步說明：
實施例1 KPC-4000001的制備
在一反應瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物8(186.0 mg, 1.33 mmol),碳酸鈉(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)鈀(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮氣。反應在100 ℃下進行5小時，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應完全，將反應液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體200 mg，收率：55%。1H NMR : 7.87 (dd, J = 5.3, 8.8 Hz, 2 H), 7.19 (t, J = 8.6 Hz, 2 H), (400MHz , CDCl3) 6.80 (s, 1 H), 6.62 (s, 1 H), 3.98 (s, 3 H), 3.97 (s, 3 H), 3.91 (s, 3 H)
實施例2 KPC-4000002的制備
在一反應瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物9(186.0 mg, 1.33 mmol),碳酸鈉(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)鈀(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮氣。反應在100 ℃下進行5小時，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應完全，將反應液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體280 mg，收率：76%。1H NMR : 7.65 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.62 - 7.57 (m, 1 H), 7.48 (dt, (400MHz , CDCl3) J =5.9, 8.0 Hz, 1 H), 7.22 (dt, J = 2.4, 8.2 Hz, 1 H), 6.82 (s, 1 H), 6.67 (s, 1 H), 3.99 (s, 6 H), 3.92 (s, 3 H).
實施例3 KPC-4000003的制備
在一反應瓶中加入化合物7(250.0 mg, 0.93 mmol), 化合物10(210.5 mg, 1.11 mmol),碳酸鈉(195.8 mg, 1.85 mmol),四(三苯基膦)鈀(53.4 mg, 0.046mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮氣。反應在100 ℃下進行5小時，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應完全，將反應液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體210 mg，收率：60%。1H NMR (400MHz , CDCl3)：7.99 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 7.76 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 6.83 (s, 1 H), 6.71 (s, 1 H), 3.99 (s, 3 H), 3.99 (s, 3 H), 3.92(s, 3 H)
實施例4 KPC-4000004的制備
在一反應瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物11(198.3 mg, 1.33 mmol),碳酸鈉(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)鈀(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮氣。反應在100 ℃下進行5小時，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應完全，將反應液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體266 mg，收率：62%。1H NMR : 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 7.74 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.65 (400MHz , CDCl3) (d, J = 7.7 Hz, 2 H), 7.53 - 7.46 (m, 2 H), 7.44 - 7.36 (m,1 H), 6.85 (s, 1 H), 6.73 (s, 1 H), 4.01 (s, 3 H), 4.00 (s, 3 H), 3.93 (s, 3 H)
實施例5 KPC-4000005的制備
在一反應瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物12(163.5 mg, 1.33 mmol),碳酸鈉(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)鈀(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮氣。反應在100 ℃下進行5小時，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應完全，將反應液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體52 mg，收率：15%。1H NMR :8.84 - 8.75 (m, 2 H), 7.77 - 7.70 (m, 2 H), 6.83 (s, 1 H), (400MHz , CDCl3) 6.77 (s, 1 H), 4.00 (s, 3 H), 3.99 (s, 3 H), 3.93 (s, 3 H)
上述實施例1～5制得的化合物見表1：
表1 實施例1-5制得的化合物
實施例6 本發(fā)明所述化合物對凝血酶時間的影響
凝血酶時間是反映凝血酶使纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白的實驗，本發(fā)明所述化合物對凝血酶時間影響的測定參照Markwardt的凝血酶滴定方法進行。具體方法為于酶標板小孔中加入200μL，0.5%人纖維蛋白原，再加入1μL樣品液，充分混勻。用微量進樣器吸取5μL凝血酶溶液（100U/mL）迅速混勻并計時，記錄纖維蛋白原發(fā)生凝固的時間，結果見表2：
表2 對凝血酶時間（TT）的影響
注：所有結果均為3次試驗結果的平均值
由表2結果可見，不加藥物時，纖維蛋白原與凝血酶作用，約25s發(fā)生凝固，加入肝素（Heparin，0.725mg/mL)后，纖維蛋白原與凝血酶作用約40.5s發(fā)生凝固。而本發(fā)明所述化合物在各濃度（0.725 mg/mL，1.25 mg/mL和2.5mg/mL）均可顯著延長纖維蛋白原的凝結時間（p<0.05）。
實施例7 本發(fā)明所述化合物對凝血因子十（FXa）的影響
實驗試劑：成套pH校準緩沖劑，上海市愛建試劑廠出品，批號920515；Tris-base，Purity≥99.9%，Amresco產(chǎn)品，Exp2012/12；濃HCl，云南汕滇藥業(yè)有限公司，批號20090420；NaOH，云南汕滇藥業(yè)有限公司，批號20091001；二甲基亞砜（DMSO）：天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20110816；KH2PO4 ，汕頭市達豪精細化學品有限公司，批號20090304；K2PO4.3H2O，天津市風帆化學試劑科技有限公司，批號0100722；KOH，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)股份有限公司，批號20110223； Xa因子Factor X Activated，Sigma，F(xiàn)9302－50UG；FXa熒光底物，hyphen biomed公司合成；利伐沙班原料；純化水，現(xiàn)取現(xiàn)用，存放不超過3d。
實驗設備：HS-25型pH計，上海雷磁科學儀器廠；超聲波清洗器，SK8200H，上?？茖С晝x器有限公司；SYNERGY HT酶標儀，BioTek；0.5～10單道微量移液器，F(xiàn)innpipette；0.5～10ul單道微量電子移液器， 10～100ul單道微量移液器，10～300單道微量電子移液器，50～1000單道微量電子移液Eppendorf。
供試品按以下方法配制：
KPC-4000001號化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對應的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000002號化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對應的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000003號化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對應的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000004號化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對應的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000005號化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對應的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
利伐沙班用DMSO配制成1uM，之后3倍稀釋，對應的體系終濃度為10nM、3.33nM、1.11nM、0.37nM、0.12nM、0.041nM、0.0137nM、0.0045nM。
取上述配制好的供試品1ul加入至100ul反應體系中（PH7.8，去離子水、0.2mM的熒光底物、1M的Tris-HCl加1.6M的NaCl緩沖液），室溫孵育10min，再加入0.25mg/L的FXa，調(diào)節(jié)酶標儀激發(fā)光為342nM，發(fā)射光440nM，反應5min（時間間隔為60s），測定熒光強度，以利伐沙班作為陽性對照，不加FXa的作為陰性對照，計算抑制率。用抑制率對供試品濃度的對數(shù)做圖，得到KPC-4000001號化合物的IC50值為0.14uM，KPC-4000002號化合物的IC50值為0.21uM，KPC-4000003號化合物的IC50值為0.15uM，KPC-4000004號化合物的IC50值為0.19uM，KPC-4000005號化合物的IC50值為0.36uM，利伐沙班的IC50值為0.23nM。
以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。