本發(fā)明涉及一種酵母雙雜交篩選方法，具體地指一種用于酵母雙雜交的相關(guān)載體及其利用高通量測序技術(shù)大規(guī)模篩選互作蛋白的酵母雙雜交的方法。
背景技術(shù)：
：：酵母雙雜交技術(shù)作為目前研究大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用的主要方法和手段，已經(jīng)得到了很大發(fā)展和越來越廣泛的應(yīng)用。酵母雙雜交系統(tǒng)作為研究蛋白間相互作用的最常用的技術(shù)手段，最早是由Fields和Song在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立的A，其原理是：誘餌蛋白(bait)與BD(DNABindingDomain)，獵物蛋白(pery)與AD(DNAActivationDomain)分別形成融合蛋白，然后通過酵母雜交使兩種融合蛋白進(jìn)入同一酵母細(xì)胞，如果bait蛋白和pery蛋白存在互作，就能使BD和AD在空間上相互靠近，使轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)具有識別報(bào)告基因上的特異序列以及作用于轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分的功能，從而形成有活性的轉(zhuǎn)錄因子，激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，即表現(xiàn)出雜合的酵母細(xì)胞能在營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基上生長以及顯色，反過來通過雜合酵母細(xì)胞在營養(yǎng)缺陷的平板生長情況以及顯色反應(yīng)來判斷bait蛋白和pery蛋白是否存在互作。酵母雙雜交技術(shù)因具有高效、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，故被廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)的研究，但其也有假陽性高、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，尤其在大規(guī)?；プ骶W(wǎng)絡(luò)研究方面顯得規(guī)模小，通量低。雖然現(xiàn)有酵母雙雜交技術(shù)也在向大規(guī)模、自動化、高通量方向發(fā)展，建立了自動化工作站以及一系列雜交儀器，而且為了提高整個(gè)流程自動化程度，一些來源于高通量實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫也已經(jīng)涌現(xiàn)。然而，隨著近年來高通量測序技術(shù)的應(yīng)運(yùn)而生，多種物種基因組測序成功，大規(guī)模、高通量的研究方法在基因組和蛋白質(zhì)組研究中也顯得日趨重要，此時(shí)酵母雙雜交方法在大規(guī)模蛋白互作網(wǎng)絡(luò)研究方面就顯得規(guī)模小，通量低。因?yàn)榇思夹g(shù)只能應(yīng)用于單個(gè)Bait蛋白(X)對互作Prey蛋白(Y)篩選，篩選到的陽性克隆需要逐一進(jìn)行測序鑒定，將會有成百上千的克隆挑選、PCR和純化以及測序工作。操作復(fù)雜，工作量大且耗時(shí)。當(dāng)要進(jìn)行多個(gè)甚至上百個(gè)Bait蛋白的互作蛋白篩選時(shí)，只能對一個(gè)個(gè)誘餌Bait蛋白分別和獵物Prey蛋白文庫進(jìn)行單獨(dú)篩選，不能將所有誘餌Bait蛋白和獵物Prey蛋白文庫進(jìn)行同時(shí)篩選，所造成的人力資源等的浪費(fèi)，一般的實(shí)驗(yàn)室無法承受，從而無法快速建立信息豐富的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供了一種用于酵母雙雜交的相關(guān)重組載體及其利用高通量測序技術(shù)大規(guī)模篩選互作蛋白的酵母雙雜交的方法。該方法依賴于一種整合酶IntegrasephiC31(En)特有的整合功能。該整合酶能識別到特異核苷酸序列ATTP和ATTB，并將特異核苷酸序列及其緊鄰的核苷酸序列進(jìn)行特異性定向重排并連接成一段新的序列。將整合酶和特異識別的核苷酸序列ATTP和ATTB分別插入MatchmakerGAL4系統(tǒng)的載體pGADT7和pGBKT7(Clontech)中，并分別與獵物蛋白和誘餌蛋白序列融合，通過酵母雙雜交的方法導(dǎo)入同一個(gè)酵母細(xì)胞，篩選互作蛋白的同時(shí)，整合酶發(fā)生作用，將ATTP和ATTB及其相連的獵物和誘餌蛋白核苷酸序列被定向連接成一段新的序列，從而使得兩個(gè)重組載體融合成一個(gè)融合載體，此時(shí)獵物和誘餌蛋白序列被定向連接成融合載體上的一段新的序列(圖1)，繼而實(shí)現(xiàn)了成百上千的Bait蛋白同時(shí)對Prey蛋白文庫的篩選工作。而且我們在導(dǎo)入Prey蛋白和Bait蛋白的基因序列的同時(shí)，在prey和bait基因C端引入一個(gè)MmeI限制性酶切位點(diǎn)(MmeI是一種較為特殊的限制性內(nèi)切酶，其特點(diǎn)是酶切其上游19-21個(gè)核苷酸序列)，經(jīng)過MmeI對連接產(chǎn)物的限制性酶切后，得到大小相同但序列完全不同的互作蛋白對，然后酶切產(chǎn)物連接高通量測序的引物，利用高通量測序一次性獲得所有的互作蛋白，從而完成酵母雙雜交技術(shù)與高通量測序技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，經(jīng)濟(jì)高效構(gòu)建出全面的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖譜，為各學(xué)科領(lǐng)域研究蛋白的功能機(jī)制提供了強(qiáng)有力的技術(shù)保障。該方法克服了現(xiàn)有酵母雙雜交方法規(guī)模小，通量低，無法進(jìn)行文庫對文庫的篩選以及大規(guī)?；プ骶W(wǎng)絡(luò)研究的缺點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種用于酵母雙雜交的重組載體pGADT7-ATTP-phiC31，所述重組載體pGADT7-ATTP-phiC31是在載體pGADT7上插入solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列和PolIII::phic31-Cyc1表達(dá)盒，所述solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列替換NdeⅠ和XhoⅠ之間的序列及其XhoⅠ酶切位點(diǎn)，所述PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒插入在NheⅠ上，其中，solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒如SEQIDNO：2所示。本發(fā)明提供了上述用于酵母雙雜交的重組載體pGADT7-ATTP-phiC31的構(gòu)建方法，包括以下步驟：1)合成solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列，以solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列為模板設(shè)計(jì)帶有同源臂的全長引物對，其引物對如下：Sol-Fo：gacgtaccagattacgctcatatgagaatgatacggcgaccaccg，ATTP-Re：ctacgattcatctgcagctcgacagtgccccaactggggtaac；PCR擴(kuò)增，回收純化得到含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；2)將載體PGADT7用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切處理，酶切體系如下：37℃酶切6～8h，純化回收得到線性化的載體PGADT7；3)將線性化的載體PGADT7和上述含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列進(jìn)行同源重組，篩選陽性克隆，并命名為PGADT7-ATTP；4)以釀酒酵母YSR127gDNA模板設(shè)計(jì)引物對，引物對如下：NheI-PolIII-Fo：gggctagctgccaattgaacataacatg，PolIII-phiC31-Re：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac；PCR擴(kuò)增，回收純化得到PolIII啟動子；5)以phiC31ORF為模板設(shè)計(jì)全長引物對，其引物對如下：phiC31-PolIII-Fo：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac，phiC31-cyc1-Re：attggaagttggatatggggttatacgtcttccgtgccgtc；PCR擴(kuò)增，回收純化得到phiC31ORF；6)以釀酒酵母YSR127gDNA模板設(shè)計(jì)引物對，引物對如下：cyc1-phiC31-Fo：gacggcacggaagacgtataaccccatatccaacttccaat，NheI-cyc1-Re：gggctagcgactgtgtcaatgacttcac；PCR擴(kuò)增，回收純化得到PolIII終止子；7)以上述步驟4)、5)和6)得到的PolIII啟動子、phiC31ORF及Cyc1終止子為模板，以NheI-PolIII-Fo和NheI-cyc1-Re為引物overlapPCR擴(kuò)增表達(dá)盒PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒如SEQIDNO：2所示。PCR擴(kuò)增，回收純化得到PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒如SEQIDNO：2所示；8)將改造后載體PGADT7-ATTP和上述PCR產(chǎn)物PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒分別用NheI酶切處理，進(jìn)行連接，篩選陽性克隆，獲得最后重組載體PGADT7-ATTP-phiC31，簡稱pmGADT7。上述優(yōu)選方案中，所述步驟1)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s.所述步驟4)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s.所述步驟5)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃2m]×30→72℃5m→16℃1s.上述優(yōu)選方案中，所述步驟6)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s.所述步驟7)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃2m30s]×30→72℃5m→16℃1s.本發(fā)明還提供了一種用于酵母雙雜交的重組載體pGBKT7-ATTB-phiC31，所述重組載體pGBKT7-ATTB-phiC31是在載體pGBKT7上插入solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列和PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒，所述solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列替換NdeⅠ和XhoⅠ之間的序列及其XhoⅠ酶切位點(diǎn)，所述PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒插入在AvrⅡ上，其中，所述solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒如SEQIDNO：2所示。本發(fā)明提供了上述用于酵母雙雜交的重組載體pGBKT7-ATTB-phiC31的構(gòu)建方法，包括以下步驟：1)合成solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列，以solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列為模板設(shè)計(jì)帶有同源臂的全長引物對，其引物對如下：BD-Sol-Fo：gatctcagaggaggacctgcatatgacaagcagaagacggcatacg，BD-ATTB-Re：ctagttatgcggccgctgcagggagtacgcgcccggggagc；PCR擴(kuò)增，回收純化得到含有同源臂的solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列；2)將載體PGBKT7用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切處理，酶切體系如下：37℃酶切6～8h，純化回收得到線性化的載體PGBKT7；3)將線性化的載體PGBKT7和上述含有同源臂的solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列進(jìn)行同源重組，篩選陽性克隆，并命名為PGBKT7-ATTB；4)以釀酒酵母YSR127gDNA模板設(shè)計(jì)引物對，引物對如下：AvrⅡ-PolIII-Fo：ggcctaggtgccaattgaacataacatg，PolIII-phiC31-Re：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac；PCR擴(kuò)增，回收純化得到PolIII啟動子；5)以phiC31ORF為模板設(shè)計(jì)全長引物對，其引物對如下：phiC31-PolIII-Fo：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac，phiC31-cyc1-Re：attggaagttggatatggggttatacgtcttccgtgccgtc；PCR擴(kuò)增，回收純化得到phiC31ORF；6)以釀酒酵母YSR127gDNA模板設(shè)計(jì)引物對，引物對如下：cyc1-phiC31-Fo：gacggcacggaagacgtataaccccatatccaacttccaat，AvrⅡ-cyc1-Re：ggcctagggactgtgtcaatgacttcac；PCR擴(kuò)增，回收純化得到PolIII終止子；7)以上述步驟4)～6)中得到的PolIII啟動子、phiC31ORF及PolIII終止子為模板，以AvrⅡ-PolIII-Fo和AvrⅡ-cyc1-Re為引物overlapPCR擴(kuò)增，回收純化得到PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒；8)將改造后載體PGBKT7-ATTB和上述PCR產(chǎn)物PolIII:phiC31-Cyc1表達(dá)盒分別用AvrⅡ酶切處理，進(jìn)行連接，篩選陽性克隆，獲得最后重組載體PGBKT7-ATTB-phiC31，簡稱pmGBKT7。在上述技術(shù)方案中，所述步驟1)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s.所述步驟4)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s.所述步驟5)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃2m]×30→72℃5m→16℃1s.所述步驟6)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s.所述步驟7)中，PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃2m30s]×30→72℃5m→16℃1s.本發(fā)明還提供了一種利用高通量測序技術(shù)大規(guī)模篩選互作蛋白的酵母雙雜交的方法，包括以下步驟：1)用于酵母雙雜交的重組載體pGADT7-ATTP-phiC31的構(gòu)建，2)用于酵母雙雜交的重組載體pGBKT7-ATTB-phiC31的構(gòu)建，3)構(gòu)建研究相關(guān)蛋白的“誘餌”Bait文庫；a.設(shè)計(jì)含有同源臂及MmeⅠ酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增得到含有同源臂的Bait蛋白核苷酸序列；其中，引物同源臂序列如下：上游同源臂序列：gaagctgatctcagaggaggacctg，下游同源臂序列：ggcacgccctggcacccgcacgctatccaac；MmeⅠb.用BamHI和NdeI酶切線性化重組載體pmGBKT7，將線性化的重組載體pmGBKT7和含有同源臂的Bait蛋白核苷酸序列共轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞Y2Hgold中；4)構(gòu)建與上述研究相關(guān)蛋白互作的“獵物”pery蛋白文庫a.設(shè)計(jì)含有同源臂及MmeⅠ酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增含有pery蛋白的核苷酸序列，其中，引物同源臂序列如下：上游同源臂序列：cccatacgacgtaccagattacgct；下游同源臂序列：gagttctctcagttgggggcgttgactccaac；MmeⅠb.然后分別和線性化(BamHI和NdeI)改造后重組載體pmGADT7共轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞Y187gold；5)文庫雜交將步驟3)和4)得到的“誘餌”蛋白文庫和“獵物”蛋白的文庫進(jìn)行雜交，得到互作蛋白克??；6)高通量測序文庫的構(gòu)建：a.酵母質(zhì)粒提取及獲取整合酶作用后定向連接的序列對雜交以后互作蛋白克隆進(jìn)行收集，提取酵母質(zhì)粒，以酵母質(zhì)粒中連接后新的融合質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物對，低循環(huán)擴(kuò)增，回收純化得到連接的互作蛋白核苷酸序列即含有pery-MmeⅠ-ATTL-MmeⅠ-bait片段的核苷酸序列，其中，pery-MmeⅠ-ATTL-MmeⅠ-bait片段中，MmeⅠ-ATTL-MmeⅠ核苷酸序列，如SEQIDNO：4所示；b.連接的互作蛋白核苷酸序列進(jìn)行MmeⅠ酶切處理，然后選用3％高濃度低熔點(diǎn)膠回收；得到MmeI酶切后回收產(chǎn)物；c.酶切產(chǎn)物與高通量測序引物進(jìn)行連接測序；7)高通量測序及數(shù)據(jù)分析對高通量測序文庫經(jīng)行高通量測序，將結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖譜。本發(fā)明的原理本發(fā)明基于phiC31/att整合酶系統(tǒng)和高通量測序技術(shù)，該整合酶能識別到特異核苷酸序列ATTP和ATTB，并將特異核苷酸序列及其緊鄰的核苷酸序列進(jìn)行特異性定向重排并連接成一段新的序列。將整合酶和特異識別的核苷酸序列ATTP和ATTB分別插入MatchmakerGAL4系統(tǒng)的載體pGADT7和pGBKT7(Clontech)中，并分別與獵物蛋白和誘餌蛋白序列融合，通過酵母雙雜交的方法導(dǎo)入同一個(gè)酵母細(xì)胞，篩選互作蛋白的同時(shí)，整合酶發(fā)生作用，將ATTP和ATTB及其相連的獵物和誘餌蛋白序列被定向連接成一段新的序列，從而使得兩個(gè)重組載體融合成一個(gè)融合載體，此時(shí)獵物和誘餌蛋白序列被定向連接成融合載體上的一段新的序列，繼而實(shí)現(xiàn)了成百上千的Bait蛋白同時(shí)對Prey蛋白文庫的篩選工作。。而且我們在導(dǎo)入Prey蛋白和Bait蛋白的基因序列的同時(shí)，在prey和bait基因C端引入一個(gè)MmeI限制性酶切位點(diǎn)(MmeI是一種較為特殊的限制性內(nèi)切酶，其特點(diǎn)是酶切其上游19-21個(gè)核苷酸序列)，經(jīng)過MmeI對連接產(chǎn)物的限制性酶切后，得到大小相同但序列完全不同的互作蛋白對，然后酶切產(chǎn)物連接高通量測序的引物，通過高通量測序一次性獲得所有的互作蛋白，經(jīng)濟(jì)高效構(gòu)建出全面的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的高通量酵母雙雜交技術(shù)相對于酵母雙雜交自動工作站大大節(jié)約了人力資源和生產(chǎn)成本，本發(fā)明將利用高通量測序的優(yōu)勢突破酵母雙雜技術(shù)規(guī)模小、通量低、成本高、以及無法實(shí)現(xiàn)成百上千的Bait蛋白同時(shí)篩選cDNA文庫的弱點(diǎn)，使酵母雙雜交技術(shù)發(fā)揮空前的優(yōu)勢，與高通量測序技術(shù)有力結(jié)合，為各領(lǐng)域的研究者們提供強(qiáng)有力的技術(shù)手段，經(jīng)濟(jì)而快速地繪制特定時(shí)期和特定條件下的大規(guī)模蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖譜，翻開生命科學(xué)領(lǐng)域的新的篇章。附圖說明圖1為本發(fā)明的高通量酵母雙雜交技術(shù)原理示意圖；圖2為重組載體pmGADT7圖譜示意圖；圖3為重組載體pmGBKT7圖譜示意圖；圖4為陽性互作對和本發(fā)明陽性互作對雜交結(jié)果圖；圖5為PCR檢測整合酶連接效率圖；圖6為整合酶連接后融合載體測序圖；圖7為陽性互作對驗(yàn)證新型酵母雙雜交系統(tǒng)的可行性結(jié)果圖；圖中，圖7A為PCR擴(kuò)增連接片段，圖7B為MmeⅠ酶切連接后片段圖；圖8為所有分泌性蛋白、外膜蛋白和脂蛋白名稱圖；圖9為結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)分泌性蛋白、外膜蛋白和脂蛋白的Bait酵母文庫自激活檢測圖；圖10為天然免疫相關(guān)通路獵物蛋白名稱圖；圖11為天然免疫通路相關(guān)的prey酵母文庫自激活檢測圖；圖12為文庫對文庫雜交結(jié)果圖(SD/-AHLT)；圖13為本發(fā)明高通量測序文庫構(gòu)建原理示意圖；圖14為本發(fā)明高通量測序文庫構(gòu)建圖；圖中，圖14A為PCR擴(kuò)增互作蛋白連接后片段pery-MmeⅠ-ATTL-MmeⅠ-bait；圖14B為MmeI酶切處理互作蛋白連接后的片段；圖14C為擴(kuò)增高通量測序文庫圖；圖15為高通量數(shù)據(jù)分析流程圖；圖16為結(jié)核分枝桿菌和宿主天然免疫相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖譜；圖17為結(jié)核分枝桿菌和宿主天然免疫相關(guān)蛋白互作結(jié)果驗(yàn)證圖。具體實(shí)施方式為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。一、用于酵母雙雜交的重組載體pGADT7-ATTP-phiC31的構(gòu)建1)合成solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列，見SEQIDNO：1，以solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列為模板設(shè)計(jì)帶有同源臂的全長引物對，其引物對如下：Sol-Fo：gacgtaccagattacgctcatatgagaatgatacggcgaccaccg，ATTP-Re：ctacgattcatctgcagctcgacagtgccccaactggggtaacPCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s；PCR擴(kuò)增，OMEGA公司E.Z.N.A.TMCycle-PureKit進(jìn)行回收純化得到含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；2)將載體PGADT7用takara公司的NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切處理，酶切體系如下：37℃酶切6～8h，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到線性化的載體PGADT7；3)將線性化的載體PGADT7和上述含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列用維諾贊公司ClonExpressEntryOneStepCloningKit(C114-01/02)進(jìn)行同源重組，篩選陽性克隆，并命名為PGADT7-ATTP；4)以市場購得釀酒酵母YSR127gDNA模板設(shè)計(jì)引物對，引物對如下：NheI-PolIII-Fo：gggctagctgccaattgaacataacatg，PolIII-phiC31-Re：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac；PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s；PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到PolIII啟動子；序列表35)從華南植物園區(qū)永祥(DavidW.Ow)教授實(shí)驗(yàn)室饋贈的phiC31ORF，以phiC31ORF為模板設(shè)計(jì)全長引物對，其引物對如下：phiC31-PolIII-Fo：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac，phiC31-cyc1-Re：attggaagttggatatggggttatacgtcttccgtgccgtc；PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃2m]×30→72℃5m→16℃1s；PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到phiC31ORF；6)以釀酒酵母YSR127gDNA模板設(shè)計(jì)引物對，引物對如下：cyc1-phiC31-Fo：gacggcacggaagacgtataaccccatatccaacttccaat，NheI-cyc1-Re：gggctagcgactgtgtcaatgacttcac；PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s；PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到PolIII終止子；7)以上述步驟4)、5)和6)得到的PolIII啟動子、phiC31ORF及Cyc1終止子為模板，以NheI-PolIII-Fo和NheI-cyc1-Re為引物overlapPCR擴(kuò)增表達(dá)盒PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒如SEQIDNO：2所示。PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃2m30s]×32→72℃5m→16℃1s.PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒如SEQIDNO：2所示；8)將改造后載體PGADT7-ATTP和上述PCR產(chǎn)物PolIII:phiC31-Cyc1表達(dá)盒分別用takara公司NheI酶切處理，37℃酶切3-4h，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到線性化的載體PGADT7-ATTP以及帶有NheⅠ酶切位點(diǎn)粘性末端的表達(dá)盒PolIII:phiC31-Cyc1；9)上步驟獲得的片段用takaraT4連接酶進(jìn)行連接連接體系：16℃連接6-10h，轉(zhuǎn)化入stable3感受態(tài)，篩選陽性克隆，獲得最后重組載體PGADT7-ATTP-phiC31，簡稱pmGADT7。二、用于酵母雙雜交的重組載體pGBKT7-ATTB-phiC31的構(gòu)建1)合成solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列，見SEQIDNO：2，以solexaPE2-MCS-ATTB核苷酸序列為模板設(shè)計(jì)帶有同源臂的全長引物對，其引物對如下：BD-Sol-Fo：gatctcagaggaggacctgcatatgacaagcagaagacggcatacg，BD-ATTB-Re：ctagttatgcggccgctgcagggagtacgcgcccggggagcPCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s；PCR擴(kuò)增，OMEGA公司E.Z.N.A.TMCycle-PureKit進(jìn)行回收純化得到含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；2)將載體PGBKT7用takara公司的NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切處理，酶切體系如下：37℃酶切6～8h，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到線性化的載體PGADT7；3)將線性化的載體PGBKT7和上述含有同源臂的solexaPE1-MCS-ATTP核苷酸序列用維諾贊公司ClonExpressEntryOneStepCloningKit(C114-01/02)進(jìn)行同源重組，篩選陽性克隆，并命名為PGBKT7-ATTB；4)以市場購得釀酒酵母YSR127gDNA模板設(shè)計(jì)引物對，引物對如下：AvrⅡ-PolIII-Fo:ggcctaggtgccaattgaacataacatgPolIII-phiC31-Re：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac；PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s；PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到PolIII啟動子；5)從華南植物園區(qū)永祥(DavidW.Ow)教授實(shí)驗(yàn)室饋贈的phiC31ORF，以phiC31ORF為模板設(shè)計(jì)全長引物對，其引物對如下：phiC31-PolIII-Fo：ctgggagctgcgattggcaatgacacaaggggttgtgac，phiC31-cyc1-Re：attggaagttggatatggggttatacgtcttccgtgccgtc；PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃2m]×30→72℃5m→16℃1s；PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到phiC31ORF；6)以釀酒酵母YSR127gDNA模板設(shè)計(jì)引物對，引物對如下：cyc1-phiC31-Fo：gacggcacggaagacgtataaccccatatccaacttccaat，AvrⅡ-cyc1-Re:ggcctagggactgtgtcaatgacttcac；PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃30s]×30→72℃5m→16℃1s；PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到PolIII終止子；7)以上述步驟4)、5)和6)得到的PolIII啟動子、phiC31ORF及Cyc1終止子為模板，以AvrⅡ-PolIII-Fo和AvrⅡ-cyc1-Re為引物overlapPCR擴(kuò)增表達(dá)盒PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒如SEQIDNO：2所示。PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃2m30s]×32→72℃5m→16℃1s.PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到PolIII::phiC31-Cyc1表達(dá)盒如SEQIDNO：2所示；8)將改造后載體PGBKT7-ATTB和上述PCR產(chǎn)物PolIII:phic31-Cyc1表達(dá)盒分別用takara公司NheI酶切處理，37℃酶切3-4h，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到線性化的載體PGBKT7-ATTB以及帶有AvrⅡ酶切位點(diǎn)粘性末端的表達(dá)盒PolIII:phiC31-Cyc1；9)上步驟獲得的片段用takaraT4連接酶進(jìn)行連接連接體系：16℃連接6-10h，轉(zhuǎn)化入stable3感受態(tài)，篩選陽性克隆，獲得最后重組載體PGBKT7-ATTB-phiC31(簡稱pmGBKT7)。三.陽性互作對照組PGADT7-ATTP-phiC31-T和PGBKT7-ATTB-phiC31-P53的構(gòu)建以及驗(yàn)證本系統(tǒng)的可行性1.PmGADT7-T的構(gòu)建1)將載體pmGADT7用takara公司的BamHI和NdeI進(jìn)行酶切處理，線性化同時(shí)切掉了載體pmGADT7上面的solexaPE12序列，酶切體系如下：37℃酶切6～8h，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到線性化的載體PmGADT7；2)從Clontect公司的MatchmakerGAL4系統(tǒng)中的陽性互做蛋白對照SV40largeT載體PGADT7-T，以PGADT7-T為模板設(shè)計(jì)含有同源臂的一對引物，其中下游同源臂序列上含有一個(gè)酶切點(diǎn)MmeⅠ，引物序列如下：mAD-MmeⅠ-T-Fo：cccatacgacgtaccagattacgctggaactgatgaatgggagcag，mAD-MmeⅠ-T-Re：agttctctcagttgggggcgttgactccaactgtttcaggttcagggggag；PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃1m30s]×30→72℃5m→16℃1s，PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到帶有同源臂及MmeⅠ酶切位點(diǎn)的TORF3)線性化的載體PmGADT7和上步驟擴(kuò)增的TORF共同轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞Y187gold，使其在酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組。挑選pmGADT7-T陽性克隆。2.pmGBKT7-P53的構(gòu)建1)將載體pmGBKT7用takara公司的BamHI和NdeI進(jìn)行酶切處理，線性化同時(shí)切掉了載體pmGBKT7上面的solexaPE2序列，酶切體系如下：37℃酶切6～8h，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到線性化的載體pmGBKT7；2)從Clontect公司的MatchmakerGAL4系統(tǒng)中的陽性互做蛋白對照P53載體PGBKT7-p53，以PGBKT7-p53為模板設(shè)計(jì)含有同源臂的一對引物，其中下游同源臂序列上含有一個(gè)酶切點(diǎn)MmeⅠ，引物序列如下：mBD-Mme1-P53-Fo：gaagctgatctcagaggaggacctgcctgtcaccgagacccctgg；mBD-Mme1-P53-Re：gcacgccctggcacccgcacgctatccaacgggatgcagaggcagtcag；PCR擴(kuò)增體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃20s→56℃25s→72℃1m]×32→72℃5m→16℃1s，PCR擴(kuò)增，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到帶有同源臂及MmeI酶切位點(diǎn)的p53ORF3)線性化的載體PmGBKT7和上步驟擴(kuò)增的p53ORF共同轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞Y2Hgold，使其在酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組。挑選PmGBKT7-P53陽性克隆。3.利用陽性互作對驗(yàn)證新型酵母雙雜交系統(tǒng)的可行性1)實(shí)驗(yàn)組PmGADT7-T、PmGBKT7-P53和陽性對照組PGADT7-T，PGBKT7-P53一起做雜交(30℃50rpm/min24h)，涂布在SD/-LT、SD/-AHLT上，實(shí)驗(yàn)組和對照組生長狀況相同，并且互作情況相同(圖4)。新型系統(tǒng)中的插入元件不影響蛋白表達(dá)和互作2)在SD/-AHLT上隨機(jī)挑選8個(gè)互作蛋白克隆，提取酵母質(zhì)粒，以其為模板設(shè)計(jì)引物對，PCR擴(kuò)增T-ORF、P53-ORF以及由phiC31整合作用從而連接起來的TORF-ATTL-P53ORF，引物對序列：AD/BD-Fo：taatacgactcactatagggc，AD-Re：cctctggcgaagaagtcc，BD-Re：tcaagacccgtttagaggc；AD-For1：catacgacgtaccagattacg，BD-For1：catcatggaggagcagaagct；結(jié)果顯示連接效率可達(dá)到百分之百(圖5)，將連接PCR產(chǎn)物送測序，顯示TORF-ATTL-P53ORF正常無突變(圖6)，說明整合酶phiC31在此系統(tǒng)能正常表達(dá)，并發(fā)揮整合作用。3)收集陽性互作的酵母細(xì)胞，提取酵母質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增連接產(chǎn)物TORF-ATTL-P53ORF，然后進(jìn)行MmeI酶切，發(fā)現(xiàn)MmeI酶切效果較好(圖7)，可用于連接高通量測序引物，得到了預(yù)期的結(jié)果，證明該系統(tǒng)在陽性互作對可用。四.構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)分泌蛋白、外膜蛋白和脂蛋白“誘餌”文庫的構(gòu)建1)以農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室肖少波課題組饋贈的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的真核表達(dá)質(zhì)粒(334蛋白ORF)為模板設(shè)計(jì)帶有同源臂的引物對，其中下游同源臂序列上含有一個(gè)酶切點(diǎn)MmeⅠ，核苷酸序列小于1200bp，擴(kuò)增上述蛋白ORF的核苷酸序列，核苷酸序列大于1200bp，進(jìn)行蛋白截短，使最終擴(kuò)增的核苷酸序列小于1000bp。同源臂序列如下：上游同源臂：gaagctgatctcagaggaggacctg；下游同源臂：ggcacgccctggcacccgcacgctatccaac；所有分泌性蛋白、外膜蛋白和脂蛋白名稱如圖8所示；2)將載體pmGBKT7用takara公司的BamHI和NdeI進(jìn)行酶切處理，線性化同時(shí)切掉了載體pmGBKT7上面的solexaPE2序列，37℃酶切6～8h，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到線性化的載體pmGBKT7；3)然后將步驟1)中PCR產(chǎn)物分別和線性化載體pmGBKT7共轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞Y2Hgold，進(jìn)行酵母內(nèi)同源重組。隨機(jī)挑選克隆驗(yàn)證，同源重組陽性率可達(dá)到100％。4)上述結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)分泌性蛋白、外膜蛋白和脂蛋白的Bait酵母文庫逐一與陽性對照蛋白pmGADT7-T進(jìn)行雜交，2*YPAD培養(yǎng)基中雜交24h(30℃，50rpm/min)，然后分別涂于SD/-Trp/Leu、SD/-Trp/His/Ade/leu平皿，30℃倒置培養(yǎng)5d-7d，觀察菌落的生長情況如圖9所示。生長代表具有自激活活性，將具有自活性的蛋白在以下篩選過程中剔除(圖8中打勾的為自激活活性或者粘性蛋白活性)。五.天然免疫通路相關(guān)的“獵物”酵母文庫的構(gòu)建1)將載體pmGADT7用takara公司的BamHI和NdeI進(jìn)行酶切處理，線性化同時(shí)切掉了載體pmGADT7上面的solexaPE1序列，37℃酶切6～8h，BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收純化得到線性化的載體pmGADT7；2)以鼠cDNA為模板，設(shè)計(jì)帶有同源臂及MmeI的引物對，PCR擴(kuò)增387個(gè)天然免疫信號通路蛋白的基因片段，上游同源臂：cccatacgacgtaccagattacgct；下游同源臂：gagttctctcagttgggggcgttgactccaac；這些基因片段包括自噬相關(guān)基因，SNARE家族基因，結(jié)核敏感基因，TLR家族基因，NF-kB信號通路基因，Jak/Stat信號通路基因:IL家族基因，B、T細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)通路基因(316個(gè)ORF)。如圖10，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用BioFlu試劑盒進(jìn)行膠回收；3)然后將步驟2)中PCR產(chǎn)物分別和線性化載體pmGADT7共轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞Y187gold，進(jìn)行酵母內(nèi)同源重組。隨機(jī)挑選克隆驗(yàn)證，同源重組陽性率可達(dá)到100％。構(gòu)建天然免疫通路相關(guān)的prey酵母文庫。4)對上述天然免疫通路相關(guān)的prey酵母文庫逐一與陽性對照蛋白pmGBKT7-P53進(jìn)行雜交，2*YPAD培養(yǎng)基中雜交24h(30℃，50rpm/min)，然后分別涂于SD/-Trp/Leu、SD/-Trp/His/Ade/leu平皿，30℃倒置培養(yǎng)5d-7d，觀察菌落的生長情況。生長代表具有自激活活性，并未發(fā)現(xiàn)具有自激活活性的蛋白(如圖11)；六.結(jié)核分枝桿菌bait酵母文庫與天然免疫通路相關(guān)的prey酵母文庫進(jìn)行文庫對文庫雜交將步驟4)和5)得到的“誘餌”蛋白文庫和“獵物”蛋白的文庫混合起來進(jìn)行雜交，2*YPAD培養(yǎng)基中雜交24h(30℃，50rpm/min)，涂布在SD/-Ade/His/Leu/Trp平板上，生長出來的為陽性互作蛋白克隆。總共約2000個(gè)左右克隆，雜交效率達(dá)到17％(如圖12所示)。七.高通量測序文庫的構(gòu)建上述文庫構(gòu)建過程中，選用BamHⅠ和NdeⅠ限制性酶切位點(diǎn)，同時(shí)下游同源臂引入MmeⅠ限制性酶切位點(diǎn)，MmeⅠ酶切其識別位點(diǎn)上游21bp的堿基，通過phiC31的特異性整合功能，收集雜交以后的互作克隆，通過PCR擴(kuò)增將獲得位點(diǎn)特異性重組后定向排列的互蛋白核苷酸連接的新序列，即含有pery-MmeⅠ-ATTL-MmeⅠ-bait片段的核苷酸序列，其中，pery-MmeⅠ-ATTL-MmeⅠ-bait片段中，MmeⅠ-ATTL-MmeⅠ核苷酸序列，如SEQIDNO：4所示。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行MmeI酶切，獲得大小相同但序列完全不同的互作蛋白核苷酸連接后新片段，回收酶切產(chǎn)物并連接高通量測序用adapter引物，進(jìn)行高通量測序,圖13。1.酵母質(zhì)粒提取及獲取整合酶作用后定向連接的新序列對雜交以后約2000個(gè)克隆，進(jìn)行收集在一起，利用OMEGA公司E.Z.N.A.TMYeastDNAKit提取酵母質(zhì)粒，并以其為模板設(shè)計(jì)引物對進(jìn)行低循環(huán)擴(kuò)增連接后的產(chǎn)物即pery-MmeⅠ-ATTL-MmeⅠ-bait(圖14A)，引物對：AD-For1：catacgacgtaccagattacg，BD-For1:catcatggaggagcagaagct，PCR體系：PCR儀程序：95℃3m→[95℃15s→57℃25s→72℃2m]×20→72℃5m→16℃1s.PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物用OMEGA公司E.Z.N.A.TMCycle-PureKit進(jìn)行回收2.對回收產(chǎn)物pery-MmeⅠ-ATTL-MmeⅠ-bait進(jìn)行MmeⅠ酶切處理，然后選用3％的高濃度低熔點(diǎn)膠回收(圖14B)；3.酶切產(chǎn)物與高通量測序引物進(jìn)行連接1)高通量測序引物信息及獲得：合成兩條雙鏈核苷酸序列分別為P5-adapter和P7-adapter，設(shè)計(jì)兩對單鏈核苷酸，序列分別為：P5-F鏈：acactctttccctacacgacgctcttccgatctnnP5-R鏈：tgtgagaaagggatgtgctgcgagaaggctaga；P7-F鏈：gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacP7-R鏈：nnctagccttctcgtgtgcagacttgaggtcagtgPCR體系：PCR儀程序：95℃5m→95℃→16℃從95℃到16℃的下降過程總共1.5h，下降速率1.5％.，產(chǎn)物即為雙鏈核苷酸序列P5-adapter和P7-adapter；2)酶切產(chǎn)物與高通量測序引物用NEB公司T4連接酶進(jìn)行連接連接體系：16℃連接2h-4h，得到的連接產(chǎn)物；3)連接產(chǎn)物AgencourtAMPureXPBeadClean-up(E2612)進(jìn)行純化回收a.加入1.2倍體積的AMPureXPBead到連接產(chǎn)物中混合均勻，室溫孵育5minb.磁力柱吸附最少5min，直到混合液澄清，AMPureXPBead全部吸附到磁力柱為止。c.吸棄上清，且整個(gè)過程離心管一直在磁力吸附柱上。d.繼續(xù)添加80％酒精500-600μL，室溫作用30s，立即移回磁力吸附柱上，混合液澄清后，立即吸棄上清，重復(fù)2次，e.仔細(xì)移走離心管中的酒精，室溫干燥5min，此過程一直保持在磁力吸附柱上；f.加入15μLEB，與AMPureXPBead室溫充分作用3min，在放到磁力吸附柱上充分作用，直到溶液澄清，小心取走溶液，即為連接高通量測序用引物后的產(chǎn)物。4.連接產(chǎn)物3′端OH-OH縫隙的修復(fù)處理37℃15min然后放在4℃冰箱修復(fù)過夜。5.以修復(fù)后連接產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)引物對，采用touchdownPCR技術(shù)擴(kuò)增，引物對序列：PEPCRPrimer1：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctPEPCRPrimer2：caagcagaagacggcatacgagatcgtgatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc體系如下：反應(yīng)程序：95℃1m→95℃10s→74℃10s→95℃10s→73℃每個(gè)循環(huán)下降1℃………95℃10s→63℃10s→[95℃10s→63℃10s]×6→72℃10m→16℃1s.得到PCR產(chǎn)物(圖14C)，OMEGA公司E.Z.N.A.TMCycle-PureKit進(jìn)行回收送高通量測序。7)文庫的高通量測序及數(shù)據(jù)分析對高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理(分析程序見圖15)，最后得到212個(gè)互作對的互作網(wǎng)絡(luò)圖譜(圖16)；8)互作的驗(yàn)證：通過對高通量分析得到的212個(gè)蛋白互作對，通過點(diǎn)對點(diǎn)的酵母雙雜交方法進(jìn)一步做酵母雙雜交驗(yàn)證，其中有186個(gè)互作對能夠再次被驗(yàn)證(如圖17)，充分證明了方法的可行性和可靠性。其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3