本發(fā)明屬于生物
技術領域：
；更具體地，本發(fā)明涉及微桿菌LCT-H2及其生物學特性、全基因組學測序。
背景技術：
：在隨著航天技術的發(fā)展，人類的外太空探索活動越來越頻繁。在地面上微生物幾乎無處不在，大多數(shù)存在于人類皮膚、口腔、鼻咽部和胃腸道。盡管載人飛船及內部物品等經(jīng)過嚴格的真空消毒，載人航天器密閉環(huán)境條件下仍然容易滋生細菌和真菌等微生物，這些微生物能在密閉艙室內的金屬、高分子復合材料等表面形成生物膜，它們的生長繁殖和代謝會對材料產(chǎn)生腐蝕，嚴重威脅空間站的長期在軌運行安全，縮短空間站的服役時間。研究密閉航天器內的微生物種類對于航天器內微生物的安全防護具有重要的意義。早期人們對許多環(huán)境微生物的認識僅來自于對16SrRNA的研究，一些重要的遺傳信息很難獲得?，F(xiàn)在越來越多的新的培養(yǎng)和分子生物學方法，例如基因組學、蛋白質組學、宏基因組學等，被用來研究新獲得微生物的潛在特征和功能等。隨著人類基因組計劃的實施和進行，生物體基因組研究已經(jīng)成為生命科學研究的前沿領域，而與之相對應的微生物基因組研究正在廣泛開展。細菌是微生物的一種，其基因組小、操作簡單且實驗周期短，其研究的工作可為人類基因組研究提供有益的參考；同時隨著測序技術的更新?lián)Q代和高通量測序技術的出現(xiàn)，細菌基因組的測序成本和所需時間已大幅度降低。初步研究了該菌的表型及生理生化特征，對研究密閉飛行器內微生物種類分布、材料的微生物腐蝕等提供了幫助。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的微桿菌LCT-H2菌株（Microbacteriumsp.LCT-H2）自“神舟九號”飛船的返回艙內冷凝水分離得到。本發(fā)明提供的該菌株，其保藏號為CGMCCNo.12570。菌株LCT-H2可在MH固體平板上形成無色、表面光滑且邊緣整齊菌落。為革蘭氏陽性菌。菌體呈桿狀，分散排布，表面沒有鞭毛、菌毛等結構。LCT-H2菌株可利用多種碳源，包括單糖（葡萄糖、果糖、甘露糖等）、二糖（纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖等），多糖（果膠、糊精等）以及多種無機碳源等，對醋竹桃霉素（Troleandomycin）、硫酸四癸鈉（Niaproof4）、二甲胺四環(huán)素（Minocycline）等敏感（圖3）。所述的LCT-H2菌株，進行全基因組測序，并進行分析，其基因組大小為3.36Mbp，包括3235個編碼序列和53個RNA基因，COG數(shù)據(jù)庫比對共注釋到21組COG功能分類。表1Microbacteriumsp.LCT-H2菌株核苷酸含量和基因水平的基因組。AttributeValue%oftotalSize(bp)3356231G+Ccontent(bp)236614370.5Codingregion(bp)308437691.9Totalgenes3235100RNAgenes531.64Protein-codinggenes318298.36Genesinparalogclusters1283.96GenesassignedtoCOGs1ormoreconserveddomains131640.682ormoreconserveddomains1855.723ormoreconserveddomains491.514ormoreconserveddomains250.77Geneswithsignalpeptides2086.43Geneswithtransmembranehelices90728.04Paralogousgroups561.73表2LCT-H2基因組21個COG分類的基因數(shù)統(tǒng)計。CodeValue%ageDescriptionJ1213.74TranslationA10.03RNAprocessingandmodificationK1083.34TranscriptionL802.47Replication,recombinationandrepairD150.46Cellcyclecontrol,mitosisandmeiosisV220.68DefensemechanismsT481.48SignaltransductionmechanismsM591.82Cellwall/membranebiogenesisN110.34CellmotilityU230.71IntracellulartraffickingandsecretionO481.48Posttranslationalmodification,proteinturnover,chaperonesC962.97EnergyproductionandconversionG1354.17CarbohydratetransportandmetabolismE2046.31AminoacidtransportandmetabolismF571.76NucleotidetransportandmetabolismH561.73CoenzymetransportandmetabolismI662.04LipidtransportandmetabolismP1344.14InorganiciontransportandmetabolismQ391.21Secondarymetabolitesbiosynthesis,transportandcatabolismR1755.41GeneralfunctionpredictiononlyS772.38Functionunknown-166051.31NotinCOGs附圖說明圖1菌株LCT-H2的16SrRNA基因序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2菌株LCT-H2的革蘭氏染色。圖3菌株LCT-H2的電子顯微鏡觀察。具體實施方式下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施實例一：菌株LCT-H2培養(yǎng)。菌株LCT-H2為“神舟九號”飛船的返回艙內冷凝水分離得到。菌株分別于37℃培養(yǎng)箱或搖床中進行靜置或振蕩培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基為腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI，Oxiod)，配方為37g/LBHI；固體培養(yǎng)基為MH平板。實施實例二：菌株LCT-H2菌種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建。LCT-H2接種至BHI液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)，6000rpm離心5min收集菌體，棄上清。利用Qiagen公司的基因組DNA提取試劑盒(CodeNo.51304，詳細步驟見產(chǎn)品說明書)提取收集的菌體的基因組DNA。以Microbacteriumsp.LCT-H2的基因組DNA為模板，利用細菌16srRNA通用測序引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）擴增其16srRNA片段并測序，得到其堿基序列。用CLUSTALW（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進行多序列比對，并用MEGA5.0構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(3)。實施實例三：菌株LCT-H2的革蘭氏染色。采用革蘭氏染色試劑盒（CodeNo.G1060,Solarbio）對LCT-H2菌體進行染色。BHI液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)菌體，將菌液滴于載玻片中央，在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥。結晶紫、沙黃染色液對干燥菌體一次染色脫色，詳細步驟見產(chǎn)品說明書。染色完成并晾干后，置于光學顯微鏡下觀察染色情況。實施實例四：菌株LCT-H2的電子顯微鏡觀察。分別在透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察菌體形態(tài)。1ml培養(yǎng)至穩(wěn)定前期的菌液，6000rpm離心5min收集菌體，棄上清；PBS緩沖液洗滌一次后將菌體懸浮至合適濃度。菌懸液等體積與4%多聚甲醛+0.5%戊二醛溶液混合，滴在有支持膜的銅網(wǎng)上，15min后用濾紙吸取未吸附樣品；吸取磷鎢酸染液小心滴在銅網(wǎng)上，染色1min后用濾紙吸取未吸附的樣品；樣品干燥后在PhilipsEM400T型透射電子顯微鏡（TEM）下觀察菌體形態(tài)。首先用2.5%戊二醛、PBS緩沖液以及1%鋨酸清洗菌體，乙醇梯度脫水并乙酸異戊酯置換，樣品干燥后做噴金處理(4)，處理好的樣品置于FEIQuanta200型掃描電鏡下觀察。實施實例五：菌株LCT-H2的生理生化鑒定實驗。Biolog微孔板（BiologGENIIIMicroPlate,Biolog）用來對LCT-H2菌株進行94種表型檢測，其中包括71種碳源利用率分析和23種化學敏感性分析。Microbacteriumsp.LCT-H2接種至BHI液體培養(yǎng)基，37°C，180rpm過夜培養(yǎng)，6000rpm離心5min收集菌體，棄上清。將菌體用IF-B接種液懸浮并調節(jié)至適當濃度（OD600約為0.8），分別取100ul接種液加入Biolog微孔板的96個孔中，將微孔板放置在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，用酶標儀測定590nm各孔的吸光度值（OD590）。實施實例六：菌株LCT-H2的基因組測序、組裝及注釋?；蚪MDNA樣品委托美吉生物有限公司進行全基因組序列測定、基因預測、基因功能注釋、非編碼RNA預測等工作，序列分析工作委托美吉生物有限公司和上海瀚宇生物科技有限公司共同完成?；蚪MDNA提取后進行質量鑒定，在濃度和純度達到測序要求后進行全基因組測序。利用Covaris進行基因組DNA片段化，構建插入片段約300-500bp的基因組測序文庫，通過橋式PCR擴增得到DNA簇，然后采用IlluminaHiseq2000測序技術完成該菌株的基因組掃描測序，獲得約1Gb的原始測序數(shù)據(jù)。IlluminaHiSeq2000測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過BaseCalling轉化為序列數(shù)據(jù)，結果以FASTQ文件格式來存儲，包含測序read的序列信息以及測序質量信息；原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預處理去除接頭、引物及低質量數(shù)據(jù)后，利用SOAPdenovo（http://soap.genomics.org.cn/）拼接軟件對優(yōu)化序列進行多個Kmer參數(shù)的拼接，得到最優(yōu)的組裝結果，并運用GapCloser軟件對組裝結果進行局部內洞填充和堿基校正；分別利用RNAmmer和tRNAscan-SE軟件對基因組中包含的rRNA和tRNA進行預測；利用Glimmer3.0（http://www.cbcb.umd.edu/software/glimmer/）軟件進行基因預測；利用各種數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋和分類。關于保藏的LCT-H2菌株的說明A.菌種的保藏單位名稱和地址名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所B.交機構保藏的日期2016年6月1日C.保藏機構給予的保藏號CGMCCNo.12570D.分類命名微桿菌Microbacteriumsp。當前第1頁1 2 3