本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及氨力農(nóng)的新用途，具體涉及氨力農(nóng)的藥物組合物及其在高血壓治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：氨力農(nóng)又名氨基雙吡酮、氨聯(lián)吡啶酮、氨雙吡酮、氨吡酮、安聯(lián)酮、安諾可、強心隆、乳酸氨利酮，是一種新型的非甙、非兒茶酚胺類強心藥，口服和靜注均有效，兼有正性肌力作用和血管擴張作用，能增加心肌收縮力，增加心排血量，降低心臟前、后負荷，降低左心室充盈壓，改善左心室功能，增加心臟指數(shù)，但對平均動脈壓和心率無明顯影響。腎血管性高血壓繼發(fā)于許多心血管疾病，如動脈粥樣硬化、腎動脈狹窄等，其發(fā)生率隨著年齡的增長而增加。腎素-血管緊張素系統(tǒng)與此型高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腎素-血管緊張素系統(tǒng)由腎素、血管緊張素原、血管緊張素Ⅰ、血管緊張素Ⅱ及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶構(gòu)成。其中血管緊張素Ⅱ通過激動血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體而對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生生理和病理作用。腎動脈狹窄后，RAS被激活，血管緊張素Ⅱ生成增加，它除激活血管緊張素受體強烈收縮血管外，還通過刺激腎上腺髓質(zhì)釋放兒茶酚胺，以及刺激其它縮血管物質(zhì)的合成與釋放(如誘導(dǎo)內(nèi)皮素合成)來增強縮血管效應(yīng)，致使外周阻力增加，血壓升高。此外，血管緊張素Ⅱ激活組織NADH/ADPH氧化途徑，促進超氧陰離子產(chǎn)生，氧化滅活舒血管因子EDRF/NO，進而減弱舒血管效應(yīng)，導(dǎo)致外周阻力進一步升高。近年研究認為，血漿中血管緊張素Ⅱ在高血壓早期起重要作用，而在高血壓中、晚期，組織局部RAS激活可能起的作用更大。目前觀點認為，血壓升高并不是導(dǎo)致心血管重構(gòu)的唯一因素，血管緊張素Ⅱ還具有生長因子的特性，它通過作用于細胞膜受體，激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶(如MAPK)來誘導(dǎo)原癌基因c-fos和c-myc基因的過量表達，促進血管平滑肌細胞的增殖和細胞基質(zhì)的改變，導(dǎo)致血管壁細胞的重新排列而引起血管壁向心性重構(gòu)，血管管徑變小阻力增加，進一步促進高血壓的發(fā)生發(fā)展血管重構(gòu)在不同的高血壓血管壁結(jié)構(gòu)表現(xiàn)不同，在遺傳性自發(fā)性高血壓大鼠，血管重構(gòu)指數(shù)較高(90％)，血管壁并不增厚，血管平滑肌細胞有較少增殖或肥大，而管腔直徑和面積縮小，管壁厚度與管徑之比和管壁面積和管腔面積比值增加；在繼發(fā)性高血壓大鼠，血管重構(gòu)指數(shù)較低(75％)，血管壁增厚，血管平滑肌細胞增殖或肥大，管腔直徑和面積縮小，管壁厚度與管徑之比和管壁面積和管腔面積比值增加。迄今為止，尚未見氨力農(nóng)的藥物組合物與腎血管性高血壓的相關(guān)性報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種氨力農(nóng)的藥物組合物，該藥物組合物中含有氨力農(nóng)和一種從草本中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，氨力農(nóng)和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療腎血管性高血壓。本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(Ⅰ)，一種氨力農(nóng)的藥物組合物，包括氨力農(nóng)、如上所述的化合物(Ⅰ)和藥學上可以接受的載體。如上所述的化合物(Ⅰ)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將射干的干燥根莖粉碎，用75～85％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用25％乙醇洗脫8個柱體積，再用70％乙醇洗脫12個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72％的甲醇水溶液等度洗脫，收集10～16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)。進一步地，步驟(a)用80％乙醇熱回流提取，合并提取液。進一步地，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。如上所述的化合物(Ⅰ)在制備治療腎血管性高血壓的藥物中的應(yīng)用。如上所述的氨力農(nóng)的藥物組合物在制備治療腎血管性高血壓的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明提供的氨力農(nóng)的藥物組合物中含有氨力農(nóng)和一種從射干的干燥根莖中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，氨力農(nóng)和該天然產(chǎn)物單獨作用時，對腎血管性高血壓具有治療作用；二者聯(lián)合作用時，對腎血管性高血壓的治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療腎血管性高血壓的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。具體實施方式下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。實施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證分離方法：(a)將射干的干燥根莖(2kg)粉碎，用80％乙醇熱回流提取(15L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用25％乙醇洗脫8個柱體積，再用70％乙醇洗脫10個柱體積，收集70％洗脫液，減壓濃縮得70％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中70％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1(10個柱體積)、45:1(8個柱體積)、25:1(10個柱體積)和15:1(8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1(10個柱體積)、15:1(8個柱體積)和1:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72％的甲醇水溶液等度洗脫，收集10～16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(385mg，HPLC歸一化純度大于98％)。結(jié)構(gòu)確證：無色結(jié)晶，HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z317.2079，結(jié)合核磁特征可得分子式為C20H28O3，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δH(ppm，pyridine-d5，500MHz)：H-1(6.04，dd，J＝6.7，12.1Hz)，H-2(6.52，dd，J＝12.1，9.5Hz)，H-3(7.13，d，J＝9.5Hz)，H-5a(3.23，d，J＝15.6Hz)，H-5b(2.98，dd，J＝15.6，9.3Hz)，H-6(5.06，dd，J＝9.3，1.4Hz)，H-7(1.87，m)，H-8(1.53，m)，H-9a(2.02，m)，H-9b(1.61，m)，H-10(1.96，m)，H-11(1.77，m)，H-12(0.85，d，J＝5.9Hz)，H-13(1.13，d，J＝6.8Hz)，H-14(1.20，d，J＝6.8Hz)，H-3’(7.01，m)，H-4’(1.65，d，J＝7.3Hz)，H-5’(1.84，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δC(ppm，pyridine-d5，125MHz)：133.2(CH，1-C)，127.4(CH，2-C)135.3(CH，3-C)，122.5(C，4-C)，28.3(CH2，5-C)，77.4(CH，6-C)，52.7(CH，7-C)，27.7(CH，8-C)，35.2(CH2，9-C)，42.8(CH，10-C)，26.4(CH，11-C)，22.1(CH3，12-C)，23.8(CH3，13-C)，18.4(CH3，14-C)，171.2(C，15-C)，200.1(C，1’-C)，129.3(C，2’-C)，138.2(CH，3’-C)，14.5(CH3，4’-C)，13.1(CH3，5’-C)。紅外波譜中的1756cm-1吸收帶與UV譜中的236nm吸收帶表明該化合物含有α,β-不飽和內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，紅外波譜中的1715cm-1與1624cm-1吸收帶表明結(jié)構(gòu)中存在酮基與α,β-不飽共軛體系。13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有20個碳信號，包括五個甲基，兩個亞甲基，九個次甲基(一個連氧碳和四個烯烴碳)，以及四個季碳(兩個羰基碳和兩個烯烴碳)，以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為雙環(huán)結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示五個甲基質(zhì)子信號δH0.85(3H，d，J＝5.9Hz)、1.13(3H，d，J＝6.8Hz)、1.20(3H，d，J＝6.8Hz)、1.65(3H，d，J＝7.3Hz)、1.84(3H，s)，兩組亞甲基質(zhì)子信號δH3.23(1H，d，J＝15.6Hz)與2.98(1H，dd，J＝15.6，9.3Hz)、2.02(1H，m)與1.61(1H，m)，三個共軛烯烴質(zhì)子信號δH6.04(1H，dd，J＝6.7，12.1Hz)、6.52(1H，dd，J＝12.1，9.5Hz)與7.13(1H，d，J＝9.5Hz)，一個烯烴質(zhì)子信號δH7.01(1H，m)，一個連氧次甲基質(zhì)子信號δH5.06(1H，dd，J＝9.3，1.4Hz)，四個次甲基質(zhì)子信號δH1.87(1H，m)、1.53(1H，m)、1.96(1H，m)、1.77(1H，m)。1H-1HCOSY譜中存在H-1/H-2/H-3、H2-5/H-6/H-7/H-8/H2-9/H-10、H-7/H-11/H3-12、H-11/H3-13以及H-8/H3-14相關(guān)信號，結(jié)合HMBC譜中顯示的H-2、H2-9和H-10與C-1以及H-2、H2-5和H-6與C-4相關(guān)信號可以構(gòu)建吉馬烷型倍半萜骨架。HMBC譜中H-3’與C-2’和C-4’相關(guān)信號可以構(gòu)建2’-甲基-2’-丁烯酮基片段，同時HMBC譜H-10與C-1’相關(guān)信號表明這一片段與吉馬烷型倍半萜骨架連接的位置。另外HMBC譜H-3、H2-5和H-6與C-15相關(guān)信號暗示C-6與C-15之間存在一個內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)。NOESY譜中，假設(shè)H-8為β構(gòu)型，那么H-8與H-10的相關(guān)信號表明H-10也為β構(gòu)型，因此，2’-甲基-2’-丁烯酮基為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。該化合物化學式及碳原子編號如下：實施例2：藥理作用1、材料與方法1.1動物SD大鼠，體重200～250g，購于中南大學湘雅醫(yī)學院動物部。實驗前在本實驗室喂養(yǎng)1wk，測定其基礎(chǔ)血壓。1.2試劑與樣品氨力農(nóng)購自中國藥品生物制品檢定所?；衔?Ⅰ)自制，制備方法見實施例1。血管緊張素Ⅱ、腎素活性檢測試劑盒購于解放軍總院放射免疫研究所；其余均為市售分析純。1.3儀器高速離心機(法國產(chǎn))；電泳系統(tǒng)(北京六一儀器產(chǎn))；鼠尾測壓儀(HX-1型)購于中南大學湘雅醫(yī)學院；生理記錄二道儀由成都儀器廠生產(chǎn)。1.4大鼠分組及模型制備大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60mg·kg-1)麻醉后，從腹部左側(cè)切口，分離左側(cè)腎動脈，用直徑為0.3mm的銀夾夾住腎動脈使其狹窄后，放回腹腔，臟器恢復(fù)原位，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組只實行相同的手術(shù)程序，而不結(jié)扎腎動脈。待術(shù)后3d，動物恢復(fù)后，從尾動脈測定收縮壓，連續(xù)觀察血壓的變化。高血壓模型以術(shù)后4wk，選取血壓維持在160mmHg(21.3kPa)以上動物用于實驗。大鼠分為6組，分別為正常對照組、假手術(shù)組、模型對照組、氨力農(nóng)組(20mg·kg-1)、化合物(Ⅰ)組(20mg·kg-1)、氨力農(nóng)與化合物(Ⅰ)組合物組【10mg·kg-1氨力農(nóng)+10mg·kg-1化合物(Ⅰ)】。1.5血管緊張素Ⅱ濃度測定實驗結(jié)束時，頸動脈插管連接壓力感受器于生理二道儀測定平均動脈壓，然后取血4ml置于含有抑肽酶的試管中，于4℃離心3000r·min-1，10min，取血漿保存于-20℃?zhèn)溆?。取冰凍的血漿標本在流動的冷水浴中快速融化，取樣放入冰水浴中。試管分組編號，加樣步驟參照試劑盒程序說明表進行。放射性標記物為125IAngⅡ。技術(shù)特性指標為：靈敏度為10ng·L-1；曲線范圍為25～800ng·L-1；精密度為：批內(nèi)變異(CVw)<5％，批間變異(CVb)<10％。1.6腎素活性測定通過單位時間內(nèi)生成血管緊張素Ⅰ的速率來確定。取雙份血漿，一份直接與抗血清反應(yīng)，測定其血管緊張素Ⅰ的濃度(對照管)，另一份在37℃溫育一定時間，再與抗血清反應(yīng)，測定其血管緊張素Ⅰ的濃度(測定管)。測定管的濃度減去對照管的濃度，再除于被溫育時間，則為單位時間內(nèi)血管緊張素Ⅰ的產(chǎn)生速率，即為腎素活性。1.7統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)資料用x±s表示。數(shù)據(jù)分析采用方差分析及Newman-Keuls多重比較t檢驗。2、實驗結(jié)果2.1對高血壓大鼠模型血漿血管緊張素Ⅱ的變化與正常對照組比較，模型對照組大鼠血漿血管緊張素Ⅱ水平顯著升高(P＜0.01)；與模型對照組比較，氨力農(nóng)與化合物(Ⅰ)組合物組血漿血管緊張素Ⅱ水平顯著降低(P<0.01)；與模型對照組比較，氨力農(nóng)組、化合物(Ⅰ)組血漿血管緊張素Ⅱ水平降低(P＜0.05)。結(jié)果見表1。2.2對高血壓大鼠模型血漿腎素活性的變化與正常對照組比較，模型對照組大鼠血漿腎素活性在高血壓組升高(P<0.05)；與模型對照組比較，氨力農(nóng)與化合物(Ⅰ)組合物組大鼠血漿腎素活性明顯降低(P<0.01)；與模型對照組比較，氨力農(nóng)組、化合物(Ⅰ)組血漿腎素活性降低(P<0.05)。結(jié)果見表1。表1對高血壓大鼠模型血漿血管緊張素Ⅱ和血漿腎素活性的變化組別血管緊張素Ⅱ濃度(ng·L-1)腎素活性(ng·L-1)正常對照組7412假手術(shù)組7013模型對照組12026氨力農(nóng)組8517化合物(Ⅰ)組8218氨力農(nóng)與化合物(Ⅰ)組合物組7012腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活性增高是造成血壓升高的重要機制之一，其中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)與血壓升高有直接關(guān)系。在腎動脈狹窄后，腎血流量減少促使腎素釋放增多，血漿中血管緊張素原生成血管緊張素Ⅱ增多。循環(huán)系統(tǒng)的血管緊張素Ⅱ通過促進醛固酮的分泌影響水電解質(zhì)平衡，增加血管張力等因素而發(fā)揮作用。隨著血壓的持續(xù)長時間升高，局部組織(心、腦、血管)增多的血管緊張素Ⅱ與其它生長因子刺激心血管壁發(fā)生向心性血管重構(gòu)是維持血壓升高的病理基礎(chǔ)。抑制高血壓大鼠模型的血管緊張素Ⅱ濃度和腎素活性可以控制高血壓病情的進一步發(fā)展。本發(fā)明提供的氨力農(nóng)與化合物(Ⅰ)組合物可以顯著降低高血壓大鼠模型的血管緊張素Ⅱ濃度和腎素活性，且組合物的效果優(yōu)于氨力農(nóng)或化合物(Ⅰ)單獨的作用效果。氨力農(nóng)與化合物(Ⅰ)組合物可以開發(fā)成治療腎血管性高血壓的藥物。上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。當前第1頁1 2 3