本發(fā)明屬于化學(xué)藥物領(lǐng)域，涉及一種環(huán)肽類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)背景
魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜(Houttuynia cordata Thunb.)的新鮮全草或干燥地上部分，早在《本草綱目》和《新修本草》中便有記載。魚腥草味辛、微寒、歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、利尿通淋、止血、祛痰止咳、鎮(zhèn)痛等多種功效?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明魚腥草具有抗菌、抗炎、抗病毒等作用，臨床上用于呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、婦科疾病等的治療，被譽(yù)為一種天然的抗生素。魚腥草早已被國家衛(wèi)生部正式確定為藥食同源的極具開發(fā)潛力的資源之一。魚腥草的揮發(fā)油類成分也已被證明為具有顯著的抗菌活性的有效成分，其中魚腥草素(癸酰乙醛)及其合成衍生物已被開發(fā)成藥物應(yīng)用于臨床，如用于治療慢性支氣管炎及其他上呼吸道感染性疾病的魚腥草素鈉片。
環(huán)肽類化合物廣泛存在于各種生命物質(zhì)中，并且是一類具有多種生物活性的物質(zhì)，如具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、子宮收縮等活性。天然環(huán)肽主要由常見氨基酸組成，較線型多肽有更為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因此具有多種生理功能和醫(yī)藥價(jià)值。第一個(gè)被報(bào)道的天然環(huán)肽是從細(xì)菌中被分離得到的，命名為Gramicidin S，并且實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)G+菌有很好的抗菌活性。隨后人們便開啟了對(duì)環(huán)肽類物質(zhì)的深入研究，從微生物、植物以及海洋生物等生物中陸續(xù)分離到很多具有生物活性的特殊結(jié)構(gòu)的環(huán)肽類化合物。例如，從土壤絲狀真菌發(fā)酵液中分離的環(huán)(亮氨酸-亮氨酸)對(duì)青霉菌和黑曲霉菌有較好的抗真菌活性。從小紅參中分離的茜草科類型環(huán)肽是一類結(jié)構(gòu)新穎的具有強(qiáng)抗腫瘤活性的雙環(huán)環(huán)六肽，其顯示出對(duì)P-388有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。海洋生物中也富含環(huán)肽類物質(zhì)，如從海鞘Lissoclinum patella中分離得到的環(huán)肽也具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。
抗菌是指采用化學(xué)或物理方法殺滅細(xì)菌或妨礙細(xì)菌生長繁殖及其活性的過程，包括滅菌、殺菌、消毒、抑菌、防霉、防腐等。細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。常見的革蘭氏陽性菌包括：葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌、破傷 風(fēng)桿菌等，它們能產(chǎn)生外毒素使人致??；常見的革蘭氏陰性菌包括：痢疾桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、百日咳桿菌及霍亂弧菌等，它們產(chǎn)生內(nèi)毒素，靠內(nèi)毒素使人致病。臨床上常用的殺菌劑有：β-內(nèi)酰胺類、氨基糖甙類、氟喹諾酮類、磺胺類、多肽類等。如萬古霉素，為一種環(huán)肽類抗生素，它通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁中磷脂和多肽的生成，來抑制細(xì)菌的生長和繁殖。
炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。炎癥表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛，引起組織功能障礙。由感染引起的炎癥，稱為感染性炎癥，而不由感染引起的炎癥，稱為非感染性炎癥。炎癥與許多疾病都相關(guān)，例如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、退行性疾病等。因此尋找更為有效的抗炎藥物刻不容緩。
因此臨床上迫切需要此類環(huán)肽類的藥物，既具有抗炎抗菌效果，最好由具有生物活性的分子組成，會(huì)具有更低的生物毒性和更高的安全性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種從中藥魚腥草中分離提純的環(huán)肽類化合物，具有廣譜抗菌活性，對(duì)多種菌株均具有顯著的抗菌效果，具體為，一種環(huán)肽類化合物，全部由亮氨酸組成，通式為環(huán)-leu-[leu]n-，其特征在于，所述環(huán)肽類化合物中亮氨酸以肽鍵相互連接成環(huán)，n為1到7的整數(shù)，依次構(gòu)成環(huán)二肽到環(huán)八肽。結(jié)構(gòu)式分別為：
其中進(jìn)一步優(yōu)選，n＝2，則該環(huán)肽類化合物為亮氨酸環(huán)三肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括環(huán)二肽到環(huán)八肽共7種化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物及鹽類，該環(huán)二肽到環(huán)八肽依次按重量比為2-5：28-32：14-18：1-3：30-35：1：2-5。
本發(fā)明所述的該系列環(huán)肽化合物的組合物或其藥理學(xué)上容許的鹽，可以列舉為無機(jī)酸：鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、氫溴酸；有機(jī)酸：馬來酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、己二酸、對(duì)-苯甲磺酸、棕櫚酸、單寧酸；金屬離子：鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等成的鹽。
本發(fā)明在采用萃取、硅膠柱色譜、正相高效液相色譜、反相高效液相色譜等多種分離手段得到該系列環(huán)肽的基礎(chǔ)上，又對(duì)該系列環(huán)肽的組合物進(jìn)行了1)抗菌活性研究，包括：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌、弗氏志賀菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿 菌、傷寒沙門桿菌，結(jié)果顯示該系列環(huán)肽的組合物有良好的廣譜抗菌活性，可作為潛在的抗菌藥物。2)抗炎活性研究，結(jié)果顯示該系列環(huán)肽的組合物有顯著的抗炎活性，可作為潛在的抗炎藥物。另外，通過研究發(fā)現(xiàn)環(huán)肽類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的特定比例的組合，即A～G的比例為：A:B:C:D:E:F:G＝2～5:28～32:14～18:1～3:30～35:1:2～5時(shí)具有預(yù)料不到的技術(shù)效果，相對(duì)單體化合物而言上述化合物的組合之間具有協(xié)同作用，顯示優(yōu)良的抗菌活性和抗炎活性。
所述重量比進(jìn)一步優(yōu)選，即A～G的比例為：A:B:C:D:E:F:G＝3：30：16：1：35：1：4。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物為藥物制劑，由環(huán)肽類化合物及其藥學(xué)上可接受的衍生物和鹽類作為活性成分和藥學(xué)上可接受的賦形劑組成。
其中固體制劑包括：片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑等；液體制劑包括：注射劑等；眼用制劑包括：滴眼劑、眼用凝膠劑等。
本發(fā)明還提供了環(huán)肽類化合物的提取方法，由以下步驟組成：
1)取魚腥草全草粉碎，用水蒸汽蒸餾法得揮發(fā)油粗品，晾干，再用乙醚溶解，加硫酸溶液萃取多次，合并上層有機(jī)相，得到混合溶液；
2)向混合溶液中加氫氧化鈉溶液萃取多次，合并下層水相，再加硫酸溶液和乙醚萃取多次，合并上層有機(jī)相，減壓蒸去溶劑即得魚腥草揮發(fā)油；
3)將魚腥草揮發(fā)油進(jìn)行快速減壓柱色譜或常壓柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫，每固定體積為一餾分，收集多個(gè)餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，合并餾分；餾分經(jīng)正相制備高效液相色譜梯度洗脫分離得到多個(gè)餾分，所述梯度洗脫餾分經(jīng)反相制備高效液相色譜梯度洗脫分離，蒸發(fā)回收溶劑，得到所述環(huán)肽類化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種提取方法，由以下步驟組成：
1)取魚腥草全草6000g，用水蒸汽蒸餾法加熱2～5小時(shí)，得揮發(fā)油粗品，再用20～50倍乙醚溶解，置分液漏斗中加濃度8％～15％硫酸20～30ml萃取1～5次，取上層有機(jī)相，得到混合溶液；
2)向混合溶液中加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1％～3％氫氧化鈉溶液20～30ml萃取1～5次，取下層水相，再加濃度8％～15％硫酸20～30ml與相較揮發(fā)油粗品20～50倍的乙醚萃取1～5次，取上層有機(jī)相，減壓蒸干溶劑即得揮發(fā)油樣品100～300g；
3)揮發(fā)油樣品進(jìn)行快速減壓柱色譜或常壓柱色譜分離，所述石油醚的沸程為30～ 60℃，或60～90℃，所述石油醚-乙酸乙酯混合溶劑分別為體積比100:1、50:1、30:1、20:1、0:1五種流動(dòng)相,分別逐次進(jìn)行洗脫，柱子填料為200-300目柱層析凝膠，每300～500ml體積為一餾分，共收集到40～60個(gè)餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，合并得到5個(gè)餾分；5個(gè)餾分分別進(jìn)行生物活性測試，選用活性最高的餾分經(jīng)正相制備高效液相色譜正己烷-異丙醇等度洗脫，正己烷-異丙醇體積比為0.35％:1，流速1-3ml/min分離，色譜柱為安捷倫ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得到8個(gè)餾分，8個(gè)餾分分別進(jìn)行生物活性測試，選用活性最高的餾分經(jīng)反相制備高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫，所述反相制備高效液相色譜的流動(dòng)相為乙腈和水，洗脫流程為：0min，乙腈：水的體積比20％：80％到30min，乙腈：水為100％：0，流速0.5-1.5ml/min,柱子為Thermo C18 ODS柱,，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到環(huán)肽類化合物A～G。。
本發(fā)明還提供一種提純方法，所述正己烷-異丙醇的流速優(yōu)選2ml/min,
本發(fā)明還提供一種提純方法，所述反相制備高效液相色譜的流速優(yōu)選1ml/min。
所述活性測試為抗菌活性測試，為實(shí)施例26抗菌試驗(yàn)的精簡版，目的為快速篩選活性最高的餾分。
本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)為如專利CN102816212中提供了一種茜草科類型環(huán)肽及其藥物組合物和應(yīng)用，取茜草屬植物的根莖，經(jīng)干燥、粉碎后，進(jìn)行環(huán)肽提取，經(jīng)過我們的驗(yàn)證，現(xiàn)有方法并不能用于提取本環(huán)肽化合物，并且本環(huán)肽化合物首次使用正相高效液相色譜法，進(jìn)過上述步驟的梯度洗脫，才可以直觀的看到色譜峰的分布情況，較硅膠柱色譜峰、制備薄層色譜峰分離效果，避免各組分分叉嚴(yán)重的問題，因此本方法既是首次提取該類新化合物的方法，也屬于一種直觀高效提出該類化合物的新方法，具有突出的特點(diǎn)和實(shí)質(zhì)的進(jìn)步。
本發(fā)明還提供一種合成方法，由以下步驟組成：
a)L-亮氨酸和Boc-亮氨酸為初始原料合成保護(hù)型二肽；
b)在步驟a)保護(hù)型二肽基礎(chǔ)上，再與一分子Boc-亮氨酸合成保護(hù)型三肽；
c)在步驟a)保護(hù)型二肽基礎(chǔ)上，由一分子脫Boc-保護(hù)基的二肽和一分子脫酯基的二肽，合成保護(hù)型四肽；依次合成保護(hù)型五肽到八肽；
d)所述步驟a所述保護(hù)型二肽脫去Boc-保護(hù)基，在甲醇中回流，環(huán)合成環(huán)二肽；
e)將步驟b)，c)所述的保護(hù)下三肽到八肽分別進(jìn)行進(jìn)一步脫去Boc保護(hù)基和甲酯保護(hù)基，在縮合劑的作用下，依次合成環(huán)三肽到環(huán)八肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種合成方法，由以下步驟組成：
a)L-亮氨酸與甲醇和氯化亞砜在低溫的下反應(yīng)成亮氨酸甲酯鹽酸鹽，亮氨酸甲酯鹽酸鹽與BOC-亮氨酸以DIEA為縛酸劑，DCC與HOBT為混合縮合劑，二氯甲烷為溶劑縮合成保護(hù)型二肽；
b)保護(hù)型二肽在三氟乙酸：二氯甲烷，體積比1:4的作用下脫掉BOC-保護(hù)基，生成二肽的三氟乙酸鹽；在低溫的條件下，以DIEA為縛酸劑，DCC與HOBT為混合縮合劑，二氯甲烷為溶劑與Boc-亮氨酸縮合成保護(hù)型的三肽；
c)上步的保護(hù)型三肽再在三氟乙酸：二氯甲烷，體積比1:4的作用下脫掉Boc-保護(hù)基；脫去BOC-保護(hù)基的三肽甲酯在氫氧化鈉和水，體積比1:1的作用下脫去甲酯保護(hù)，生成三肽，三肽再在HATU與PyBOP縮合劑的存在下，以DIEA為縛酸劑，以四氫呋喃和二氯甲烷為溶劑，縮合成環(huán)三肽。
以下為各個(gè)化合物具體合成路線：
(1)本發(fā)明進(jìn)一步提供一種合成方法，由以下步驟組成：以L-亮氨酸、Boc-亮氨酸為初始原料合成保護(hù)型二肽：
(2)在保護(hù)型二肽基礎(chǔ)上，再與一分子Boc-亮氨酸合成保護(hù)型三肽：
(3)在保護(hù)型二肽基礎(chǔ)上，由一分子脫Boc-保護(hù)基的二肽和一分子脫酯基的二肽，合成保護(hù)型四肽：
(4)在保護(hù)型二肽、三肽的基礎(chǔ)上，由一分子脫Boc-保護(hù)基的三肽和一分子脫酯基的二肽，合成保護(hù)型五肽：
(5)在保護(hù)型三肽的基礎(chǔ)上，由一分子脫Boc-保護(hù)基的三肽和一分子脫酯基的三肽， 合成保護(hù)型六肽：
(6)在保護(hù)型五肽的基礎(chǔ)上，由一分子脫Boc-保護(hù)基的五肽和一分子脫酯基的二肽，合成保護(hù)型七肽：
(7)在保護(hù)型六肽的基礎(chǔ)上，由一分子脫Boc-保護(hù)基的六肽和一分子脫酯基的二肽，合成保護(hù)型八肽：
(7)保護(hù)型二肽脫去Boc-保護(hù)基，在甲醇中回流，環(huán)合成環(huán)二肽(A)：
(8)在脫去Boc-保護(hù)基的三肽的基礎(chǔ)上進(jìn)一步脫去甲酯保護(hù)基，在縮合劑的作用下，環(huán)合成環(huán)三肽(B)：
(9)在脫去Boc-保護(hù)基的四肽的基礎(chǔ)上進(jìn)一步脫去甲酯保護(hù)基，在縮合劑的作用下，環(huán)合成環(huán)四肽(C)：
(10)在脫去Boc-保護(hù)基的五肽的基礎(chǔ)上進(jìn)一步脫去甲酯保護(hù)基，在縮合劑的作用下，環(huán)合成環(huán)五肽(D)：
(11)在脫去Boc-保護(hù)基的六肽的基礎(chǔ)上進(jìn)一步脫去甲酯保護(hù)基，在縮合劑的作用下，環(huán)合成環(huán)六肽(E)：
(12)保護(hù)型七肽脫去兩端的保護(hù)基，在縮合劑的作用下，環(huán)合成環(huán)七肽(F)：
(13)保護(hù)型八肽脫去兩端的保護(hù)基，在縮合劑的作用下，環(huán)合成環(huán)八肽(G)：
以上合成路線所涉及縮寫分別代表：
BOC叔丁氧羰基
TFA三氟乙酸
BOP-Cl雙(2-氧代-3-惡唑烷基)次磷酰氯
PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU 2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
DIEA N,N-二異丙基乙胺
DMF四氫呋喃
目前也有環(huán)肽類化合物的報(bào)道，但均不適用與本環(huán)肽類化合物的合成，或者合成產(chǎn)物不理想，由于亮氨酸的側(cè)鏈基團(tuán)較大的環(huán)合時(shí)空間位阻也較大，因此其中本方法創(chuàng)新性使用了PyBOP和HATU，這兩種縮合劑的使用，可以高效地合成亮氨酸環(huán)肽，并提高化合物的純度和產(chǎn)量，具有很好的創(chuàng)新性和實(shí)用性。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的環(huán)肽類化合物在制備治療炎癥或細(xì)菌性疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：
1)首次從魚腥草的揮發(fā)油類成分中提取到一系列新型環(huán)肽類化合物。
2)首次提供了該類化合物的提取方法，采用正相制備高效液相色譜法來對(duì)揮發(fā)油等小極性物質(zhì)進(jìn)行分離，該方法快速、高效，可得到微量環(huán)肽，避免了一些不穩(wěn)定的物質(zhì)的分解。
3)提供了該類化合物的制備方法，制備方法簡單易行，可快速得到該類環(huán)肽類化合物，并為相似結(jié)構(gòu)化合物的合成提供了合成路線，也解決了極性物質(zhì)因極性小且極性相似而造成的分離難、分離效果差的問題。
4)提供了該類化合物在制劑上的應(yīng)用，包含多種制劑的制備。
5)提供了該類化合物在制備抗炎和抗菌藥物中的應(yīng)用，該藥物具有光譜抗菌活性，具有廣闊的市場應(yīng)用前景和實(shí)用性。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1：該系列環(huán)肽的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定
取魚腥草全草6000g，用水蒸汽蒸餾法加熱3小時(shí)，得揮發(fā)油粗品，再用30倍乙醚溶解，置分液漏斗中加濃度10％10％硫酸溶液25ml萃取一次，取上層有機(jī)相，加質(zhì)量體積比2％2％氫氧化鈉溶液25ml萃取一次，取下層水相，再加濃度10％10％硫酸溶液25ml和相當(dāng)于揮發(fā)油粗品的30倍乙醚萃取，取上層有機(jī)相，減壓旋干溶劑即得揮發(fā)油樣品220g。
將揮發(fā)油樣品進(jìn)行快速減壓柱色譜或常壓柱色譜分離，石油醚(沸程60-90℃)-乙酸乙酯(100:1、50:1、30:1、20:1、0:1,V/V)混合溶劑梯度洗脫，硅膠(200-300目)柱色譜，每400ml體積為一餾分，即100:1(4000ml)、50:1(4000ml)、30:1(5200ml)、20:1(5200ml)、0:1(800ml),V/V，共收集到48個(gè)餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，合并得到5個(gè)餾分；5個(gè)餾分分別進(jìn)行生物活性測試，選用活性最高的餾分經(jīng)正相制備高效液相色譜正己烷-異丙醇等度洗脫，正己烷-異丙醇體積比為0.35％:1，流速2ml/min分離，色譜柱為安捷倫ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得到8個(gè)餾分，8個(gè)餾分分別進(jìn)行生物活性測試，選用活性最高的餾分經(jīng)反相制備高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫，所述反相制備高效液相色譜的流動(dòng)相為乙腈和水，洗脫流程為：0min，乙腈：水的體積比20％：80％到30min，乙腈：水100％：0，流速1ml/min,柱子為Thermo C18 ODS柱,，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到一系列環(huán)肽類化合物A(3.3mg),B(30.7mg),C(16.2mg),D(1.3mg),E(31.5mg),F(1.1mg),G(4.9mg)。
環(huán)肽類化合物A～F的結(jié)構(gòu)解析如下：
cyclo(leu-leu)(A)：白色固體，MS:m/z 227.1738[M+H]+,m/z 249.1537[M+Na]+,calcd for C12H23N2O2m/z 227.1754；MS2:m/z 209(M+H-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.24(2H,S,-NH-×2),3.99(2H,m,N-CH×2),1.54(4H,m,CH2×2),1.81(2H,m,CH×2),0.88～0.90(12H,over,CH3×4)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:173.9(C＝O×2),52.9(N-CH×2),43.4(CH2×2),23.7(CH×2),22.8(CH3×4)。
cyclo(leu-leu-leu)(B)：白色固體，MS:m/z 340.2566[M+H]+,m/z 362.2357[M+Na]+, calcd for C18H34N3O3m/z 340.2568；MS2:m/z 322(M+H-H2O),227(b2LL)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.11～7.67(3H,over,-NH-×3),3.72～3.99(3H,m,N-CH×3),1.49～1.51(6H,over,CH2×3),1.76(3H,over,CH×3),0.88～0.90(18H,over,CH3×6)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:170.3(C＝O×3),56.4(N-CH),56.3(N-CH×2),42.8(CH2×2),42.7(CH2),24.1(CH×3),21.9(CH3×4),22.0(CH3×2)。
cyclo(leu-leu-leu-leu)(C)：白色固體，MS:m/z 453.3423[M+H]+,m/z 475.3208[M+Na]+,calcd for C24H45N4O4m/z 453.3435；MS2:m/z 435(b4LL-H2O),340(b3LL),322(b3LL-H2O)； 1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.47～7.52(4H,over,-NH-×4),4.15～3.88(4H,m,N-CH×4),1.45～1.49(8H,over,CH2×4),1.75～1.73(4H,over,CH×4),0.86～0.87(24H,over,CH3×8)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:172.4(C＝O×4),55.5(N-CH×4),41.0(CH2×4),23.8(CH×2),23.6(CH×2),22.6～22.3(CH3×8)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu)(D)：白色固體，MS:m/z 566.4242[M+H]+,m/z 588.4062[M+Na]+,calcd for C30H56N5O5m/z 566.4276；MS2:m/z 548(M+H-H2O),453(b4LL),435(b4LL-H2O),322(b3LL-H2O),227(b2LL)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.41～7.44(5H,over,-NH-×5),4.25～4.17(5H,m,N-CH×5),1.50～1.48(10H,over,CH2×5),1.77～1.73(5H,m,CH×5),0.90～0.92(30H,over,CH3×10)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:171.6～173.5(C＝O×5),56.3(N-CH×4),56.0(N-CH),41.2～41.0(CH2×5),24.3(CH×5),22.4(CH3×4),22.3(CH3×2),22.2(CH3×4)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu-leu)(E)：白色固體，MS:m/z 679.5077[M+H]+,m/z 701.4913[M+Na]+,calcd for C36H67N6O6m/z 679.5117；MS2:m/z 661(M+H-H2O),548(b5LL-H2O),435(b4LL),340(b3LL),322(b3LL-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:8.22～7.49(6H,over,-NH-×6),4.30～4.27(6H,m,N-CH×6),1.50～1.47(12H,over,CH2×6),1.77～1.74(6H,over,CH×6),0.87～0.90(36H,over,CH3×12)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:172.9～172.4(C＝O×6),56.3(N-CH),56.1(N-CH×3),56.0(N-CH×2),41.4(CH2×6),24.4(CH×2),24.0(CH×4),22.5(CH3×4),22.6(CH3×8)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu-leu-leu)(F)：白色固體，MS:m/z 792.5931[M+H]+,m/z814.5742[M+Na]+,calcd for C42H78N7O7m/z 792.5957,MS2:m/z 774(M+H-H2O),661(b6LL-H2O),548(b5LL-H2O),453(b4LL),340(b3LL),322(b3LL-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:7.99～7.66(7H,over,-NH-×7),4.44～4.40(7H,m,N-CH×7),1.58～1.55 (14H,over,CH2×7),1.81～1.79(7H,over,CH×7),0.90～0.92(42H,over,CH3×14)； 13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:174.3～174.0(C＝O×7)，56.9(N-CH×2),56.8(N-CH×4),55.9(N-CH),41.2(CH2×5),41.2(CH2×2),5.2(CH×7),22.6～22.1(CH3×14)。
cyclo(leu-leu-leu-leu-leu-leu-leu-leu)(G)：白色固體，MS:m/z 452.3314[M+2H]+,calcd for C48H88N8O8m/z 904.6714,MS2:m/z 792(b7LL),774(b7LL-H2O),679(b6LL),661(b6LL-H2O),566(b5LL),548(b5LL-H2O),453(b4LL),435(b4LL-H2O),340(b3LL),322(b3LL-H2O),227(b2LL),209(b2LL-H2O)；1H-NMR(400MHz,DMSO)δppm:7.95～7.50(8H,over,-NH-×8),4.19～4.17(7H,over,N-CH×8),1.49～1.51(14H,over,CH2×8),1.74～1.70(7H,over,CH×8),0.89～0.91(48H,over,CH3×16)；13C-NMR(300MHz,DMSO)δppm:173.9～173.7(C＝O×8),56.3(N-CH×8),41.6(CH2×4),41.3(CH2×4),25.4(CH×3),24.7(CH×2),24.6(CH×2),24.2(CH),22.5～22.2(CH3×16)。
實(shí)施例2：該系列環(huán)肽的提取分離
取魚腥草全草6000g，用水蒸汽蒸餾法加熱4小時(shí)，得揮發(fā)油粗品，再用20倍乙醚溶解，置分液漏斗中加濃度8％硫酸溶液20ml萃取3次，取上層有機(jī)相，加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2％氫氧化鈉溶液30ml萃取3次，取下層水相，再加濃度8％硫酸溶液30ml和相當(dāng)于揮發(fā)油粗品的20倍乙醚萃取3次，合并上層有機(jī)相，減壓旋干溶劑即得揮發(fā)油樣品282g。
將揮發(fā)油樣品進(jìn)行快速減壓柱色譜或常壓柱色譜分離，石油醚(沸程60-90℃)-乙酸乙酯(100:1、50:1、25:1、20:1、0:1,V/V)混合溶劑梯度洗脫，每300ml體積為一餾分，即100:1(3300ml)、50:1(3300ml)、30:1(4500ml)、20:1(4200ml)、0:1(600ml),V/V，硅膠(200-300目)柱色譜
共收集到53個(gè)餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，合并得到5個(gè)餾分；5個(gè)餾分分別進(jìn)行生物活性測試，選用活性最高的餾分經(jīng)正相制備高效液相色譜正己烷-異丙醇等度洗脫，正己烷-異丙醇體積比為0.35％:1，流速2ml/min分離，色譜柱為安捷倫ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得到8個(gè)餾分，8個(gè)餾分分別進(jìn)行生物活性測試，選用活性最高的餾分經(jīng)反相制備高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫，所述反相制備高效液相色譜的流動(dòng)相為乙腈和水，洗脫流程為：0min，乙腈：水的體積比20％：80％到30min，乙腈：水100％：0，流速1ml/min,柱子為Thermo C18ODS柱,，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到一系列環(huán)肽類化合物A(2.1mg),B(28.1mg),C(6.8mg),D(1.7mg),E(27.8mg),F(8.8mg),G(15.2mg)。
實(shí)施例3：該系列環(huán)肽的提取分離
取魚腥草全草6000g，用水蒸汽蒸餾法加熱3小時(shí)，得揮發(fā)油粗品，再用20倍乙醚溶解，置分液漏斗中加濃度15％硫酸溶液20ml萃取一次，取上層有機(jī)相加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)5％氫氧化鈉溶液30ml萃取2次，合并下層水相，再加濃度15％硫酸溶液30ml和相當(dāng)于揮發(fā)油粗品的30倍乙醚萃取2次，合并上層有機(jī)相，減壓旋干溶劑即得揮發(fā)油樣品137g。
將揮發(fā)油樣品進(jìn)行快速減壓柱色譜或常壓柱色譜分離，石油醚(沸程60-90℃)-乙酸乙酯(100:1、50:1、25:1、20:1、0:1,V/V)混合溶劑梯度洗脫，每500ml體積為一餾分，即100:1(5000ml)、50:1(5000ml)、30:1(6500ml)、20:1(6500ml)、0:1(1000ml),V/V，共收集到48個(gè)餾分，經(jīng)硅膠薄層層析檢識(shí)，合并得到5個(gè)餾分；5個(gè)餾分分別進(jìn)行生物活性測試，選用活性最高的餾分經(jīng)正相制備高效液相色譜正己烷-異丙醇等度洗脫，正己烷-異丙醇體積比為0.35％:1，流速2ml/min分離，色譜柱為安捷倫ZORBAX,9.4×250mm,5μm；得到8個(gè)餾分，8個(gè)餾分分別進(jìn)行生物活性測試，選用活性最高的餾分經(jīng)反相制備高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫，所述反相制備高效液相色譜的流動(dòng)相為乙腈和水，洗脫流程為：0min，乙腈：水的體積比20％：80％到30min，乙腈：水100％：0，流速1ml/min,柱子為Thermo C18ODS柱,，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得到一系列環(huán)肽類化合物A(4.0mg),B(29.9mg),C(4.3mg),D(1.1mg),E(30.7mg),F(1.4mg),G(3.6mg)。
實(shí)施例4：亮氨酸甲酯鹽酸鹽的制備
在裝有滴液漏斗、帶CaCl2干燥管和回流管的二口瓶中加入15ml甲醇和40mmol L-亮氨酸,于冰-鹽浴中冷至-5℃,磁力攪拌下緩慢滴加50mmol氯化亞砜,維持溫度0℃以下,繼續(xù)反應(yīng)1h,加熱升溫至45℃攪拌30min,使固體全溶,冷卻,旋干溶劑,剩余物用10ml熱甲醇溶解,冷卻，加入大量的乙醚,有大量白色結(jié)晶析出,抽濾，再用少量甲醇洗滌濾餅。濾液會(huì)繼續(xù)析出大量結(jié)晶，再進(jìn)行抽濾，直至不再出現(xiàn)結(jié)晶為止。合并兩次濾餅，即為白色亮氨酸甲酯鹽酸鹽，產(chǎn)率：95.1％。
實(shí)施例5：保護(hù)型二肽的制備
在0℃下,將二異丙基乙胺(DIEA)20mmol緩慢滴加到7mmol亮氨酸甲酯鹽酸鹽的 30ml二氯甲烷中,并調(diào)PH 7-8,然后再加入Boc-Leu 7mmol與1-羥基苯并三唑(HOBT)7mmol,在0℃下再反應(yīng)15min,然后再加入DCC 7mmol,室溫下反應(yīng)17h(TLC跟蹤反應(yīng)),停止反應(yīng)后，過濾，減壓蒸去溶劑，硅膠柱層析進(jìn)行純化,產(chǎn)率：90.7％。
實(shí)施例6：保護(hù)型二肽脫Boc-保護(hù)基的制備
取2.8mmol Boc-Leu-Leu-OCH3溶解于圓底燒瓶中,用12ml二氯甲烷溶解,并冷卻到0℃,然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反應(yīng)4h,反應(yīng)結(jié)束后,在減壓下旋走二氯甲烷與未反應(yīng)的三氟醋酸,得到白色固體，產(chǎn)率：86.4％。
實(shí)施例7：保護(hù)型三肽的制備
在0℃下,將DIEA 21mmol緩慢滴加到Leu-Leu甲酸三氟醋酸鹽7mmol的30ml二氯甲烷中,攪拌10min,然后再加入Boc-亮氨酸7mmol與HOBT 7mmol,在0℃下再反應(yīng)15min,然后再加入DCC 7.5mmol,然后升到室溫反應(yīng)18h(TLC跟蹤反應(yīng)),停止反應(yīng)后,過濾,減壓蒸去溶劑,用硅膠柱層析進(jìn)行純化，產(chǎn)率：88.3％。
實(shí)施例8：保護(hù)型二肽脫甲酯保護(hù)基的制備
取2mmol Boc-Leu-Leu-OCH3加入1N NaOH 8ml和甲醇8ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下皂化3h,點(diǎn)板至原料點(diǎn)消失，加HCl調(diào)PH 7-8,停止反應(yīng)旋去甲醇。在冰浴下加HCl調(diào)PH 2-3,有大量的白色沉淀析出,用無水乙醚萃取一次,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有機(jī)相,用飽和NaCl洗3次,乙酸乙酯相用無水Na2SO4干燥2h,過濾濃縮，得白色固體,產(chǎn)率：88.8％。
實(shí)施例9：保護(hù)型四肽的制備
向裝有2mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入2mmol Leu-Leu-OCH3.TFA,攪拌下加入2.5mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,緩慢升至室溫后反應(yīng)16h,停止反應(yīng)后,過濾,減壓蒸去溶劑,用硅膠柱層析進(jìn)行純化,產(chǎn)率：37.7％。
實(shí)施例10：保護(hù)型三肽脫Boc-保護(hù)基的制備
取2.5mmol Boc-Leu-Leu-Leu-OCH3溶解于25ml的圓底燒瓶中,用15ml二氯甲烷溶 解，并冷卻到0℃,然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反應(yīng)2h,反應(yīng)結(jié)束后,在減壓下旋走二氯甲烷與未反應(yīng)的三氟醋酸,得到白色固體,產(chǎn)率：84.6％。
實(shí)施例11：保護(hù)型五肽的制備
向裝有2.2mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入2mmol Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,攪拌下加入2.5mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,緩慢升至室溫后反應(yīng)16h,停止反應(yīng)后,過濾,減壓蒸去溶劑,用硅膠柱層析進(jìn)行純化。產(chǎn)率：45.8％。
實(shí)施例12：保護(hù)型三肽脫甲酯保護(hù)基的制備
取2mmol Boc-Leu-Leu-Leu-OCH3加入1N NaOH 8ml和甲醇8ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下皂化3h,點(diǎn)板至原料點(diǎn)消失,加HCl調(diào)PH 7-8,停止反應(yīng)旋去甲醇。在冰浴下加HCl調(diào)PH 2-3,有大量的白色沉淀析出,用無水乙醚萃取一次,水相用乙酸乙酯萃取一次,合并有機(jī)相,用飽和NaCl洗3次,乙酸乙酯相用無水Na2SO4干燥3h,過濾濃縮,得白色固體,產(chǎn)率：81.7％。
實(shí)施例13：保護(hù)型六肽的制備
向裝有2mmol Boc-Leu-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入2mmol Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,攪拌下加入2.5mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,緩慢升至室溫后反應(yīng)12h,停止反應(yīng)后,過濾,減壓蒸去溶劑,用硅膠柱層析進(jìn)行純化，產(chǎn)率：45.5％。
實(shí)施例14：保護(hù)型五肽脫Boc-保護(hù)基的制備
取2mmol Boc-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3溶解于25ml的圓底燒瓶中,用15ml二氯甲烷溶解,并冷卻到0℃,然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反應(yīng)2h,反應(yīng)結(jié)束后,在減壓下旋干溶劑,得到白色固體，產(chǎn)率：68.9％。
實(shí)施例15：保護(hù)型七肽的制備
向裝有1.7mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5ml二氯甲烷,再加入1.7 mmol Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,攪拌下加入2.0mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,緩慢升至室溫后反應(yīng)16h(TLC跟蹤反應(yīng)),停止反應(yīng)后,過濾,減壓蒸去溶劑,用硅膠柱層析進(jìn)行純化,產(chǎn)率：34.8％。
實(shí)施例16：保護(hù)型六肽脫Boc-保護(hù)基的制備
取3mmol Boc-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3溶解于25ml的圓底燒瓶中,用20ml二氯甲烷溶解,并冷卻到0℃，然后加入3ml三氟醋酸,在0℃反應(yīng)2h,反應(yīng)結(jié)束后,在減壓下旋干溶劑,得到白色固體，產(chǎn)率66.4％。
實(shí)施例17：保護(hù)型八肽的制備
向裝有1.7mmol Boc-Leu-Leu-OH的25ml單口瓶中加入5.0ml二氯甲烷,再加入1.7mmol Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-OCH3.TFA,攪拌下加入2.0mmol BOP-Cl。冰浴下滴加三乙胺0.5ml,緩慢升至室溫后反應(yīng)16h(TLC跟蹤反應(yīng)),停止反應(yīng)后,過濾,減壓蒸去溶劑,用硅膠柱層析進(jìn)行純化,產(chǎn)率：32.4％。
實(shí)施例18：環(huán)二肽的制備
2mmol Leu-Leu-OCH3.TFA加適量乙酸乙酯溶解，使用5％Na2CO3洗滌至PH 7-8，除去溶劑，再加入20ml甲醇，加熱回流72h，減壓除去大部分甲醇，加入冰冷的30ml無水乙醚，立即放冰箱中快速冷卻至-5℃冷藏3h，過濾，用少量無水乙醚洗滌濾餅，真空干燥得白色粉末，產(chǎn)率：71.3％。
實(shí)施例19：環(huán)三肽的制備
取實(shí)施例10所得(Leu)3-OCH3 3.2mmol加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下3h,點(diǎn)板至原料點(diǎn)消失,加HCl調(diào)PH 7-8,停止反應(yīng)旋去甲醇。在冰浴下加HCl調(diào)PH 5-7,有大量的白色沉淀析出,過濾濃縮,得白色固體，將其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫?cái)嚢璺磻?yīng)36h。減壓濃縮除去溶劑，在殘余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相。經(jīng)硅膠柱層析純化，產(chǎn)率：32.9％。
實(shí)施例20：環(huán)四肽的制備
取實(shí)施例9所得Boc-(Leu)4-OCH3 3.8mmol于圓底燒瓶中,用30ml二氯甲烷溶解,并冷卻到0℃,然后加入10ml三氟醋酸,在0℃反應(yīng)2h,反應(yīng)結(jié)束后,在減壓下旋干溶劑,得到白色固體,再加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下3h,點(diǎn)板至原料點(diǎn)消失,加HCl調(diào)PH 7-8,停止反應(yīng)旋去甲醇。在冰浴下加HCl調(diào)PH 5-7,過濾濃縮,得白色固體，再將其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫?cái)嚢璺磻?yīng)36h。減壓濃縮除去溶劑，在殘余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相。經(jīng)硅膠柱層析純化，產(chǎn)率：30.7％。
實(shí)施例21：環(huán)五肽的制備
取實(shí)施例14所得(Leu)5-OCH3 3mmol加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下3h,點(diǎn)板至原料點(diǎn)消失,加HCl調(diào)PH 7-8,停止反應(yīng)旋去甲醇。在冰浴下加HCl調(diào)PH 5-7,有大量的白色沉淀析出,過濾濃縮,得白色固體，將其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫?cái)嚢璺磻?yīng)36h。減壓濃縮除去溶劑，在殘余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相。經(jīng)硅膠柱層析純化，產(chǎn)率：31.1％。
實(shí)施例22：環(huán)六肽的制備
取實(shí)施例16所得(Leu)6-OCH3 3mmol加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下3h,點(diǎn)板至原料點(diǎn)消失,加HCl調(diào)PH 7-8,停止反應(yīng)旋去甲醇。在冰浴下加HCl調(diào)PH 5-7,有大量的白色沉淀析出,過濾濃縮,得白色固體，將其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫?cái)嚢璺磻?yīng)36h。減壓濃縮除去溶劑，在殘余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相。經(jīng)硅膠柱層析純化，產(chǎn)率：28.0％。
實(shí)施例23：環(huán)七肽的制備
取實(shí)施例15所得Boc-(Leu)7-OCH3 3mmol于圓底燒瓶中,用20ml二氯甲烷溶解,并冷卻到0℃,然后加入5ml三氟醋酸,在0℃反應(yīng)2h,反應(yīng)結(jié)束后,在減壓下旋干溶劑,得到白色固體，再加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下4h, 點(diǎn)板至原料點(diǎn)消失,加HCl調(diào)PH 7-8,停止反應(yīng)旋去甲醇。在冰浴下加HCl調(diào)PH 5-7,過濾濃縮,得白色固體，將其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫?cái)嚢璺磻?yīng)36h。減壓濃縮除去溶劑，在殘余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相。經(jīng)硅膠柱層析純化，產(chǎn)率：28.2％。
實(shí)施例24：環(huán)八肽的制備
取實(shí)施例17所得Boc-(Leu)8-OCH3 3mmol于圓底燒瓶中,用20ml二氯甲烷溶解,并冷卻到0℃,然后加入5ml三氟醋酸,在0℃反應(yīng)2h,反應(yīng)結(jié)束后,在減壓下旋干溶劑,得到白色固體，再加入1N NaOH 12ml和甲醇12ml,冰浴下加入,5min后讓其在室溫下3h,點(diǎn)板至原料點(diǎn)消失,加HCl調(diào)PH 7-8,停止反應(yīng)旋去甲醇。在冰浴下加HCl調(diào)PH 5-7,有大量的白色沉淀析出,過濾濃縮,得白色固體，并將其溶于30ml DMF和270ml二氯甲烷溶解后加入12.5mmol PyBOP、2.5mmol HATU、30mmol DIEA,常溫?cái)嚢璺磻?yīng)36h。減壓濃縮除去溶劑，在殘余液中加入250ml水，用100ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相。經(jīng)硅膠柱層析純化，產(chǎn)率：27.2％。
實(shí)施例25：抗炎活性的測定
a：實(shí)驗(yàn)方法
SD大鼠，體重180-200g，雌雄各半，按右后足周長長度分組，每組6只。分為模型組，樣品組(每組給藥0.2g)和扶他林組(0.2g)。于每只大鼠右后足趾部皮下注射1％角叉菜膠溶液0.1ml致炎，致炎半小時(shí)后，按上述各組劑量將藥物均勻涂抹于右后足趾部，于給藥0.5，1，2，3，4.5h后分別測量右后足的周長。計(jì)算致炎前后的右后足周長差值，再計(jì)算足腫脹率，結(jié)果見表1。
表1各組化合物角叉菜膠致炎后大鼠足腫脹
*P<0.05 **P<0.01與模型組相比
注：組合物1A:B:C:D:E:F:G(5:28:14:2:33:1:3)；組合物2A:B:C:D:E:F:G(3:30:16:1:35:1:4)；組合物3A:B:C:D:E:F:G(1:35:12:1:25:1:7)；組合物4A:B:C:D:E:F:G(6:15:20:5:40:1:1)。
b、結(jié)論：
結(jié)果顯示：給藥后，樣品組和扶他林組都有顯著的抗炎活性，化合物A～G單獨(dú)使用時(shí)，抗炎活性較弱且低于扶他林組。當(dāng)7個(gè)化合物組合使用時(shí)，抗炎活性較強(qiáng)且強(qiáng)于扶他林組，且在A:B:C:D:E:F:G＝2～5:28～32:14～18:1～3:30～35:1:2～5的比例范圍內(nèi)活性更好，顯示協(xié)同作用效果。
實(shí)施例26：抗菌活性的測定
a：細(xì)菌培養(yǎng)
金黃色葡萄球菌(MRSA、MSSA)、表皮葡萄球菌(MRSE、MSSE)、枯草芽孢桿菌、 糞腸球菌、大腸桿菌、弗氏志賀菌、肺炎克雷伯氏桿菌、普通變形桿菌、傷寒沙門桿菌和銅綠假單胞菌在Mueller-Hinto(M-H)肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)并稀釋使其接種量控制為105-106CFU。
肺炎鏈球菌和甲型溶血性鏈球菌在含5％去纖維羊血的M-H肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)并稀釋使接種量控制為105-106CFU。
b：方法
抗菌活性的測定采用世界衛(wèi)生組織推薦的瓊脂稀釋法。藥物濃度采用連續(xù)倍數(shù)稀釋法，加入到50-60℃M-H瓊脂中混合均勻。上述稀釋后的實(shí)驗(yàn)菌懸液用多頭接種儀接種于含不同濃度化合物的培養(yǎng)皿中，在35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。其中稀釋后的肺炎鏈球菌和甲型溶血性鏈球菌加入到含5％去纖維羊血的M-H瓊脂中，在5％CO2、35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。
肉眼觀察結(jié)果，抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)菌生長的最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表1。
表2臨床分離菌株的最小抑菌濃度(μg/ml)
注：1：化合物A；2:化合物B；3:化合物C；4:化合物D；5:化合物E；6:化合物F；7:化合物G；8：組合物1A:B:C:D:E:F:G(5:28:14:2:33:1:3)；9：組合物2A:B:C:D:E:F:G(3:30:16:1:35:1:4)；10：組合物3A:B:C:D:E:F:G(1:35:12:1:25:1:7)；11：組合物4A:B:C:D:E:F:G(6:15:20:5:40:1:1)；12：替考拉寧；13：氧氟沙星。
c：結(jié)論
結(jié)果顯示：給藥后，化合物A～G和他們的組合物對(duì)多種臨床分離菌株均有抗菌作用，化合物A～G單獨(dú)使用時(shí)，抗菌活性較弱且低于替考拉寧、氧氟沙星。當(dāng)7個(gè)化合物組合使用時(shí)，抗菌活性顯著增加且強(qiáng)于替考拉寧、氧氟沙星，且在A:B:C:D:E:F:G＝2～5:28～32:14～18:1～3:30～35:1:2～5的比例范圍內(nèi)活性更好，顯示協(xié)同作用效果。
實(shí)施例27：片劑的制備
取上述實(shí)施例1～3任一方法或?qū)嵤├?～24方法所得的化合物A～G，按3:30:16:1:35:1:4比例混合，共50g，粉碎后過80目篩，與淀粉100g混勻，加10％淀粉漿10g制成軟材，干燥后加入硬脂酸鎂1g，干淀粉10g混勻后，總重量共計(jì)171g，制成1000片。
實(shí)施例28：膠囊劑的制備
取上述實(shí)施例1～3任一方法或?qū)嵤├?～24方法所得的化合物A～G，按2:33:15:3:32:1:5比例混合，共50g，粉碎后過80目篩，與淀粉100g混勻，加10％淀粉漿10g制成軟材，用20目篩制粒后，置60℃-70℃干燥后于18目篩整粒，套入1號(hào)空心膠囊中，共裝1000粒。
實(shí)施例29：丸劑的制備
取上述實(shí)施例1～3任一方法或?qū)嵤├?～24方法所得的化合物A～G，按3:28:14:2:33:1:3比例混合，共50g，粉碎后過100-120目篩，適量蜂蜜作黏合劑制成丸。
實(shí)施例30：顆粒劑的制備
取上述實(shí)施例1～3任一方法或?qū)嵤├?～24方法所得的化合物A～G，按3:30:16:1:35:1:4比例混合，共50g，粉碎后過80目篩，加10％淀粉漿制成軟材，用20目篩制粒后，置60℃-70℃干燥后于18目篩整粒，分裝，密封，包裝既得。
實(shí)施例31：注射劑的制備
其中注射劑包括小針劑、粉針劑、大輸液。
取上述實(shí)施例1～3任一方法或?qū)嵤├?～24方法所得的化合物A～G，按 5:28:16:1:35:1:5比例混合，共20g，加入甘露醇30g，加入乙醇5Kg、甘油1Kg和丙二醇4Kg，過濾除菌，分裝1000瓶，灌封，滅菌即得小針劑。
取上述實(shí)施例1～3任一方法或?qū)嵤├?～24方法所得的化合物A～G，按5:28:16:1:35:1:5比例混合，共10g，加入右旋糖酐20 30g，加水20L，溶解，過濾除菌，分裝1000瓶，冷凍干燥，得粉針劑。
取上述實(shí)施例1～3任一方法或?qū)嵤├?～24方法所得的化合物A～G，按5:28:16:1:35:1:5比例混合，共50g，加入乙醇2Kg、丙二醇3Kg、甘油2Kg、聚乙二醇5Kg溶解，加入氯化鈉900g、注射用水100Kg，溶解、混勻，過濾除菌，分裝1000瓶，灌裝，滅菌即得大輸液。
實(shí)施例32：滴眼劑的制備
取上述實(shí)施例1～3任一方法或?qū)嵤├?～24方法所得的化合物A～G，按4:28:15:1:33:1:4比例混合，共0.5g，溶解于適量注射用水中，加入甘油15g，丙二醇13g，磷酸氫二鈉2g，EDTA 0.1g，羥苯乙酯0.3g，攪拌溶解，用注射用水補(bǔ)全量至1000g，微孔濾膜過濾，分裝容器中，封口，得成品。
實(shí)施例33：眼用凝膠劑的制備
取上述實(shí)施例1～3任一方法或?qū)嵤├?～24方法所得的化合物A～G，按5:32:18:3:35:1:5比例混合，共0.5g，加入甘油15g，丙二醇13g，磷酸氫二鈉2g，EDTA0.1g，羥苯乙酯0.3g，溶解于適量注射用水中，加入溶脹后的1％羥丙甲纖維素400g中攪拌，用注射用水補(bǔ)全量至1000g，微孔濾膜過濾，分裝容器中，封口，得成品。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制，應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改造，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。