本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的化合物，具體涉及從中藥紅花中提取的得到的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物新化合物及其在預防和治療腫瘤疾病和炎癥疾病中的用途，屬醫(yī)藥技術(shù)領域。

背景技術(shù)：

紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，始載于《開寶本草》，主產(chǎn)于新疆、河南、浙江、云南等地，味辛性苦，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效，作為傳統(tǒng)活血化瘀中藥治療中風、冠心病和心絞痛已有2500多年的歷史。紅花水提物制成的紅花注射液收載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑二十冊中，臨床上廣泛用于心血管疾病的治療。目前已從紅花中分離得到200多種化合物，包括醌式查爾酮苷類、黃酮類、生物堿類、有機酸類和甾體類等，而醌式查爾酮苷類是紅花水提物的主要成分，如羥基紅花黃色素A(HSYA)、紅花黃色素A、safflomin C和脫水紅花黃色素B(AHSYB)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，紅花及其活性成分具有抗凝血、抗氧化、抗炎、保肝、降壓等活性。

本發(fā)明繼續(xù)對紅花化學成分系統(tǒng)深入研究，對水部位中的醌式查爾酮苷類化合物進行系統(tǒng)分離，研究開發(fā)其新的活性結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎之上，對紅花化學成分系統(tǒng)深入研究，對水部位中的醌式查爾酮苷類化合物進行系統(tǒng)分離，研究開發(fā)出新的活性結(jié)構(gòu)，并通過藥理實驗篩選其在防治腫瘤疾病、炎癥疾病和抗血栓疾病中的新用途。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示：

具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物的制備方法，包括以下步驟：

(1)取紅花，加乙醇提取得到乙醇提取液，合并提取液，濃縮，得乙醇浸膏；

(2)取步驟(1)制得的乙醇浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯和水進行萃取，萃取后濃縮，分別得到石油醚、乙酸乙酯和水的萃取物；

(3)取步驟(2)得到的水的萃取物，上大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，然后分別用體積濃度為5～95％的乙醇洗脫，收集體積濃度為30％的乙醇洗脫液，濃縮，得大孔吸附樹脂洗脫物；

(4)取步驟(3)得到的大孔吸附樹脂洗脫物上LH-20凝膠柱層析，洗脫液為H₂O-MeOH(體積比為從100∶0到0∶100)，得到30個流分；

(5)取步驟(4)LH-20凝膠柱洗脫物，上pre-HPLC色譜進行分離，得到式Ⅰ所示的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物。

作為優(yōu)選方案，以上具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物的制備方法，步驟(1)的提取方法為滲漉法，超聲提取法，浸泡法或回流法。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物的制備方法，步驟(5)pre-HPLC色譜分離的分離條件：XBridge^TMC18OBD^TM柱(150×30mm,5μm)，流動相為0.1％甲酸水(A)和甲醇(B)，采用梯度洗脫程序：0-5min，16％-19％B；5-15min，19％B；15-20min，19％-44％B；20-30min，44％B；30-32min，44％-100％B。流速為15mL/min；柱溫為室溫(25℃)。

本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物在制備抗炎藥物中的應用。

作為另一優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物在制備抗血栓性疾病中的應用。

作為另一優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述的腫瘤為肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌或腎癌。

本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物，將醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物化合物和藥學上可接受的載體制備成片劑、膠囊劑、注射劑、粉針劑、顆粒劑、微囊、丸劑、軟膏劑或透皮控釋貼劑劑型的藥物。

將本發(fā)明提供的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物制成片劑時，把醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物和乳糖或玉米淀粉，需要時加入潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，整粒，然后壓片制成片劑。

本發(fā)明提供的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物制成膠囊劑時把醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物和載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。

本發(fā)明提供的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物制成顆粒劑時，把醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物和稀釋劑乳糖或玉米淀粉、混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。

本發(fā)明提供的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物制成粉針劑、注射液時加入載體按藥學常規(guī)方法制備得到。

本發(fā)明提供的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物制成脂肪乳劑、軟膏劑或透皮控釋貼劑等劑型時加入載體按藥學常規(guī)方法制備得到。

有益效果：本發(fā)明提供的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明通過對紅花化學成分進行系統(tǒng)深入研究，經(jīng)過波譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析表明從紅花中分離得到醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物，式Ⅰ化合物為首次從自然界中分離得到的醌式查爾酮和黃酮的二聚體為新骨架結(jié)構(gòu)化合物。且經(jīng)過抗炎和抗腫瘤活性研究表明，本發(fā)明提供的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物具有很好的抗炎活性，并且能抑制DNA拓撲異構(gòu)酶I，對多種腫瘤均具有很強的抗腫瘤活性，且經(jīng)過毒性實驗研究表明，本發(fā)明提供的具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物毒性較低，可開發(fā)成新的抗腫瘤藥物或抗炎藥物，具有重要的應用價值。

本發(fā)明提供的制備方法，工藝設計合理，可操作性強，制備得到的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物純度高。

附圖說明

圖1為醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物式Ⅰ的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物式Ⅰ的¹H-NMR圖；

圖3為醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物式Ⅰ的的¹³C NMR圖；

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物的制備

具有抗腫瘤活性和抗炎活性的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物的制備方法，包括以下步驟：

(1)取紅花15kg，依次加入體積濃度為95％和70％的乙醇滲漉提取至無色，得到乙醇提取液，合并提取液，濃縮，得乙醇浸膏1950g；

(2)取步驟(1)制得的乙醇浸膏，分散在水中，依次用石油醚和乙酸乙酯進行萃取，萃取后濃縮，分別得到石油醚、乙酸乙酯和水的萃取物；

(3)取步驟(2)得到的水的萃取物，上D101大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，然后分別用體積濃度為5～95％的乙醇洗脫，收集體積濃度為30％的乙醇洗脫液，濃縮，得大孔吸附樹脂洗脫物；

(4)取步驟(3)得到的大孔吸附樹脂洗脫物上LH-20凝膠柱層析，洗脫液為H₂O-MeOH(體積比為從100∶0到0∶100)，得到30個流分；

(5)取步驟(4)LH-20凝膠柱洗脫流分第9流分和第3流分，上pre-HPLC色譜進行分離，pre-HPLC色譜分離的分離條件：XBridge^TMC18OBD^TM柱(150×30mm,5μm)，流動相為0.1％甲酸水(A)和甲醇(B)，采用梯度洗脫程序：0-5min，16％-19％B；5-15min，19％B；15-20min，19％-44％B；20-30min，44％B；30-32min，44％-100％B。流速為15mL/min；柱溫為室溫(25℃)。

得到式Ⅰ所示的醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物，結(jié)構(gòu)式如圖1。

式Ⅰ所示：

式Ⅰ的結(jié)構(gòu)解析：黃色粉末，[α]_D²⁰:+363.6(c 0.1,MeOH)。高分辨質(zhì)譜(HR-ESI-MS:m/z＝1087.2563[M-H]^-1,calcd.1087.2572)表明其分子式為C₄₉H₅₁O₂₈。紅外光譜在3434cm^-1處的強吸收顯示它有羥基存在，在1651cm^-1處也出現(xiàn)羰基的特征吸收，同時在1539和1401cm^-1處也出現(xiàn)芳環(huán)的特征吸收。紫外光譜顯示228、271、342和402nm有最大吸收，說明分子中存在高度共軛體系。¹H-NMR(圖2)顯示一套反式雙鍵H信號δ7.40(1H,d,J＝16.0Hz)和7.33(1H,d,J＝16.0Hz)，一套AA′BB′系統(tǒng)δ7.43(2H,d,J＝8.5Hz)和6.77(2H,d,J＝8.5Hz)，一個酚羥基H信號δ9.83(1H,s)，以及一個特征性的低場H信號δ18.67(1H,s)，由此證明分子中可能含有醌式查爾酮的骨架。在¹H-NMR中還有一套AA′BB′系統(tǒng)δ8.46(2H,d,J＝8.5Hz)和6.89(2H,d,J＝8.5Hz)，以及三個酚羥基H信號δ13.47(1H,br s)、12.82(1H,s)和10.15(1H,s)。此外還有一個亞甲基氫信號δ4.11(1H,d,J＝14.5Hz)和3.32(1H,d,J＝14.5Hz)，三個糖端基氫信號δ5.50(1H,d,J＝7.2Hz)、4.98(1H,d,J＝7.5Hz)和3.52(1H,d,J＝9.5Hz)，以及一些脂肪族H信號δ2.88-5.50ppm。

¹³C-NMR(圖3)顯示有49個碳原子，結(jié)合HSQC譜可判定有四個亞甲基碳，25個次甲基碳，以及20個季碳信號。其中，歸屬出三套吡喃葡萄糖碳信號。另外，此化合物的碳譜數(shù)據(jù)與羥基紅花黃色素A和6-羥基山柰酚-3,6-二-O-β-D-葡萄糖苷比較發(fā)現(xiàn)，區(qū)別在于化合物1缺少一個碳苷葡萄糖基并存在一個亞甲基(δ17.1)信號。結(jié)合氫譜的數(shù)據(jù)，推測此化合物是由醌式查爾酮苷和黃酮苷組成的二聚體。

在HMBC光譜上，兩個不等價亞甲基H信號δ4.11和3.32與δ103.3(C-6)、107.2(C-8′)、149.3(C-7′)、157.5(C-9′)、184.6(C-1)和188.9(C-5)相關(guān)，表明醌環(huán)的C-6位(A環(huán))與苯環(huán)的C-8′位(C環(huán))通過亞甲基相連。在MS/MS譜圖結(jié)果顯示式Ⅰ化合物經(jīng)麥氏重排裂解成兩個特征碎片m/z 625.14([M-H-C₂₂H₂₂O₁₁]^-)和461.11([M-H-C₂₇H₃₀O₁₇]^-)，再次證明C-6/CH₂/C-8′的橋連存在。通過酸水解和柱前衍生化，3′位和6′位的葡萄糖經(jīng)HPLC分析確定為D構(gòu)型。另外，酚羥基δ18.67和δ184.6(C-1)、177.8(C-7)、121.6(C-8)、106.9(C-2)和103.3(C-6)HMBC相關(guān)，表明化合物1的醌式查爾酮苷部分在DMSO-d₆中呈現(xiàn)1-烯醇-3,7-二酮和7-烯醇-1,3-二酮兩種互變異構(gòu)體共存狀態(tài)。根據(jù)在溶液中醌式查爾酮碳苷優(yōu)勢構(gòu)型的規(guī)律，式Ⅰ化合物的優(yōu)勢構(gòu)型應為為1-烯醇-3,7-二酮。

式Ⅰ化合物的ECD上λ_max(nm)(Δε)值為212(-21.80)、245(+9.45)、268(-30.53)和415(+16.61)。此化合物在270nm附近為負cotton效應，由此確定此化合物在C-4位的絕對構(gòu)型為S。

實施例2抑制LPS誘導的HUVEC細胞炎癥反應的活性篩選

血瘀證的本質(zhì)是微循環(huán)障礙或血液流變性異常。隨著細胞、分子生物學研究的深入，炎癥反應與血瘀證關(guān)系密切，一系列的炎癥細胞和炎癥因子參與血瘀證的疾病過程。故本實驗采用LPS誘導HUVEC建立體外細胞炎癥反應模型評價醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物的抗炎活性。

1、實驗材料

1.1儀器

SERIES II WATER JAVKET型CO₂孵育箱(美國Thermo公司)；1300SERIES A2型生物安全柜(美國Thermo公司)；BWS-10型水浴鍋(昆山一恒儀器有限公司)；TOMY SX-500高壓蒸汽滅菌鍋(日本Queensland公司)；EPED超純水系統(tǒng)(南京易普易達科技發(fā)展有限公司)；CKX31SF型倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)；Allegra X-12R通用臺式離心機(美國BECKMAN公司)；6孔培養(yǎng)板(美國Costar公司)；WGL-230B型電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；qPCR儀(美國Applied Biosystem公司)；超微量核酸蛋白檢測儀(日本Queensland公司)。

1.2細胞及試劑

HUVEC細胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；高糖DEME培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；脂多糖(LPS)購自于美國Sigma-Aldrich公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；PrimeScript^TMRT reagent kit購自中國大連TaKaRa公司。

2、實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)

HUVEC細胞培養(yǎng)于含10％的胎牛血清、100mg·mL^-1青霉素、100mg·mL^-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中。2～3d更換培養(yǎng)液，3～4d傳代一次。2.2細胞處理及分組

將HUVEC細胞按1×10⁵個·mL^-1接種于六孔板，每孔滿體積2mL。實驗分為3組：空白組，不加入LPS和藥物；模型組，加入LPS，終濃度10μg·mL^-1，不加藥物；給藥組：依次加入以上式Ⅰ化合物，使式Ⅰ-1化合物濃度為0.8μmol·L^-1、式Ⅰ-2化合物濃度為4μmol·L^-1、式Ⅰ-3化合物濃度為20μmol·L^-1、式Ⅰ-4化合物濃度為100μmol·L^-1藥物。連續(xù)給藥2天后收集細胞，用于提取總RNA。

2.3RNA提取

于6孔板每個孔各加入500μLRNAzol，準備1.5mL子彈頭，標記好記號，用刮刀將細胞HUVEC仔細的刮下并且轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中；加入500μL DEPC H₂O，混懸15s；離心(13200rpm，10min，4℃)；取上清1000μL到新的EP管中，離心(13200rpm，30min，4℃)；觀察RNA形態(tài)，傾倒出上層液體，每個EP管中加入500μL 70％乙醇，離心(13200rpm，10min，4℃)；重復1次，倒置，晾干后，各加入20μL 55℃ DEPC H₂O，-80℃保存；Nano drop測定RNA含量(A260/280的范圍在1.8-2.0)。

2.4轉(zhuǎn)cDNA

TaKaRa試劑盒：PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser

1)基因組DNA去除反應

2)逆轉(zhuǎn)錄反應

Store at 4℃；

3)Nano drop測定cDNA含量(A260/280的范圍在1.6-1.8)。

2.6.1.2.5 qRT-PCR SYBR Green試劑盒(QIAGEN)

1)qPCR反應體系配制

2)qPCR反應程序設置

取對數(shù)生長期HUVEC，加入一定濃度藥物作用，利用RNAzol一步法提取總RNA，1μg的總RNA以10μL體系進行逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA并反轉(zhuǎn)錄PCR。使用引物如下：

3、實驗結(jié)果

表1式Ⅰ醌式查爾酮苷化合物抑制LPS誘導的HUVEC細胞炎癥因子表達結(jié)果

與空白組相比，^#P<0.05，^##P<0.01，與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01.

由以上表1實驗結(jié)果表明，式Ⅰ醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物顯著上調(diào)抗炎因子IL-10的基因表達作用，且式Ⅰ醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物可選擇性抑制IL-1和IL-6的mRNA表達；式Ⅰ醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物僅在高劑量濃度下對TNF-α的基因表達具有顯著抑制作用，進一步表明，醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物具有特異性的抗炎活性，有開發(fā)成為新一代抗炎藥的潛力。

實施例3抑制DNA拓撲異構(gòu)酶I的活性篩選

DNA拓撲異構(gòu)酶(Topoisomerase)是一種重要的核酶，參與DNA復制、轉(zhuǎn)錄、重組、基因調(diào)節(jié)及細胞有絲分裂等重要生命活動，可通過催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合控制其拓撲結(jié)構(gòu)。腫瘤細胞中，Topo I含量及活性遠高于正常體細胞，抑制Topo I-DNA可裂解復合物解離，就能選擇性抑制腫瘤細胞的快速增殖，進而殺死腫瘤細胞^[8]。Topo I由此成為公認的抗癌藥作用靶點。故本實驗采用體外抑制DNATopo I的模型評價醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物的抗腫瘤活性。

1、實驗材料

1.1儀器

凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)，電泳儀(北京市六一儀器廠)，金屬浴(杭州博日科技有限公司)。

1.2藥物及試劑

DNA Topo I、ρBR322DNA、Agarose Regular、6×Loading Buffer、Tris-Borate-EDTA Buffer(TBE)powder均購自寶生物(大連)有限公司；10-羥基喜樹堿(OPT)和十二烷基硫酸鈉購自上海阿拉丁生化科技公司；Super green I購自北京泛博生物化學有限公司。實施例1制備得到的式Ⅰ醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物。

2、實驗方法

該測試采用20μL反應體系，包括10×Topo I緩沖液(350mM Tris-HCl pH 8.0，720mM KCI，50mM MgCl₂，50mM DTT，50mM spermidine)、0.1％BSA、0.5μg小牛胸腺ρBR322DNA、1U Topo I、待測化合物的DMSO溶液，陽性藥為10-羥基喜樹堿(OPT)。置于37℃金屬浴中反應30min，加入5μL反應終止液1.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)終止反應。1μL產(chǎn)物與2μL 6×loading buffer混合上樣，1％瓊脂糖凝膠、TBE緩沖液、90V電壓，電泳60min。Sybr green I染色30min，凝膠成像儀觀察結(jié)果，拍照記錄。酶活力單位定義：能在37℃ 30min松馳0.5μg負超螺旋ρBR322DNA所需的Topo I酶量，為1個單位(U)。

3、實驗結(jié)果

式Ⅰ化合物在500μM時對Topo I有抑制作用，結(jié)果表明醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物具有較好的抗腫瘤活性。

實施例4體外抗腫瘤實驗

本發(fā)明使用改良MTT法對本發(fā)明實施例1制備得到的式Ⅰ醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物進行體外抗腫瘤細胞實驗：將肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌或腎癌用胰酶進行消化、計數(shù)、制成濃度為5×10⁴個/ml的細胞懸液。將96孔板中每孔加入100μl細胞懸液(每孔5×10³個細胞)，然后置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；用非完全培養(yǎng)基稀釋式Ⅰ醌式查爾酮苷化合物至所需的不同梯度濃度，每孔加入100μL相應的含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組，溶媒對照組和陽性對照組，再將96孔板置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。然后每孔加入20μLMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μLDMSO溶解，搖床10分鐘輕輕混勻。在λ＝4570nm、620nm兩波長下用酶標儀檢測每孔的吸光度即OD值，以各復孔的平均值作為該組細胞的OD值，計算各藥物的抑制率。

實驗結(jié)果顯示本發(fā)明實施例1制備得到的式Ⅰ醌式查爾酮與黃酮醇結(jié)合物，對肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌或腎癌均具有較強的抑制作用，在10μg/ml劑量下，對肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌或腎癌抑制率均大于50％。

以上實施方式只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人了解本發(fā)明內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。