本發(fā)明屬于微生物的測定或檢驗方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及為基于3D的Caco-2細(xì)胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法。

背景技術(shù)：

目前，納米材料對環(huán)境和人類健康影響的研究還不完善，相關(guān)的信息比較少。與常規(guī)食品材料相比，納米食品材料粒徑較小，與其在理化性質(zhì)上的差異較大，并且納米材料在機(jī)體內(nèi)的生物活性，以及產(chǎn)生的生物正副效應(yīng)均得到放大，誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性也可能會增強(qiáng)。因此，需要大量科學(xué)的毒理學(xué)權(quán)威信息，解釋什么劑量范圍內(nèi)是危險的，什么劑量范圍內(nèi)是安全的。

在眾多的金屬納米材料中，納米氧化鋅是被廣泛應(yīng)用的材料之一。納米氧化鋅是一種粒徑在 1～100nm 的新型高功能精細(xì)無機(jī)材料。與常規(guī)氧化鋅相比，納米氧化鋅具有極強(qiáng)的抗氧化性、抗腐蝕性、光催化性和獨特的抗紫外線性，使其在光電學(xué)、橡膠工業(yè)、涂料陶瓷、化妝品、食品添加劑、生物醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用廣泛，而且在光、聲、電納米器件等領(lǐng)域?qū)⒂兄鴱V闊的應(yīng)用前景。

目前已知納米氧化鋅可通過皮膚接觸、呼吸道、消化道和靜脈注射等途徑進(jìn)入機(jī)體，但機(jī)體很難排除這類微小物質(zhì)，因此潛在一定的毒性效應(yīng)。物質(zhì)被納米化后，其毒性、吸收和排泄方式都有所改變。納米氧化鋅的細(xì)胞毒理學(xué)研究開展較為廣泛，已證明納米氧化鋅對人肺腺癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人胚肺成纖維細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞系有毒性作用。

細(xì)胞是大多數(shù)生物體的基本單位，其變化大體上可反映生物機(jī)體功能與結(jié)構(gòu)的變化，而當(dāng)機(jī)體功能與結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化時，細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)也可能發(fā)生改變。細(xì)胞毒理學(xué)主要是應(yīng)用體外細(xì)胞技術(shù)手段研究環(huán)境中物理、化學(xué)和生物等多種污染物對細(xì)胞的損傷效應(yīng)與規(guī)律，從而獲得該物質(zhì)的細(xì)胞毒效應(yīng)、與劑量有關(guān)的暴露特征（如暴露時間、暴露途徑、暴露頻率）、毒作用機(jī)理等諸多信息。以細(xì)胞為研究對象進(jìn)行納米顆粒生物效應(yīng)研究，主要是應(yīng)用體外培養(yǎng)的細(xì)胞株對納米顆粒進(jìn)行毒效應(yīng)監(jiān)測，評價納米顆粒對人體可能產(chǎn)生的危害。

一般測試方法是將傳代細(xì)胞或原代細(xì)胞置于塑料培養(yǎng)皿，加入一定量的納米材料，然后觀察細(xì)胞反應(yīng)。目前主要采用的細(xì)胞類型包括吞噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞和各種癌細(xì)胞。目前涉及的主要檢測項目包括細(xì)胞毒性檢測、細(xì)胞凋亡檢測以及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。

追溯到上個世紀(jì)七十年代，各國科學(xué)家們意識到癌細(xì)胞生長的外環(huán)境對其表型形成是非常重要的。很多研究表明正常組織細(xì)胞以及癌細(xì)胞在傳統(tǒng)二維（2D）塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)會失去其原有的組織結(jié)構(gòu)與表現(xiàn)，相比體內(nèi)細(xì)胞往往會進(jìn)行代謝、表型和基因表達(dá)的改變，這些改變會影響到癌細(xì)胞的發(fā)展和功能。Brinster等人發(fā)現(xiàn)將胚胎腫瘤細(xì)胞接種到小鼠皮下形成了胚胎癌，而將次細(xì)胞接種到已孕小鼠胚胎囊里則可以發(fā)育成小鼠，這個結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境差異對其形成腫瘤的可能性影響很大。建立在這些理論基礎(chǔ)上，Emerman、Elsdale以及Weaver等人提出可以利用再造細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）以構(gòu)成網(wǎng)架結(jié)構(gòu)并支持和連接組織結(jié)構(gòu)來構(gòu)建體外3D細(xì)胞培養(yǎng)模型。

3D細(xì)胞培養(yǎng)定義為細(xì)胞、一些生長因子和再造基質(zhì)蛋白以及骨架共培養(yǎng)，以模仿體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境的特性。通過模仿體內(nèi)環(huán)境的特性，并利用傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)研究工具，3D細(xì)胞培養(yǎng)提供了獨特的視角來觀察干細(xì)胞的行為、組織器官和腫瘤的發(fā)展過程。

細(xì)胞在塑料培養(yǎng)皿的表面生長，即只能在二維（2D）平面上生長，但在體內(nèi)，細(xì)胞則被其他細(xì)胞、組織和細(xì)胞外基質(zhì)重重包圍。以前科學(xué)家們從分子以及基因水平對體外2D細(xì)胞進(jìn)行研究，以探索特定分子和基因改變對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。盡管體內(nèi)動物模型更能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的代謝、表型和基因表達(dá)，但實現(xiàn)大規(guī)模分子水平的研究也是非常困難的。建立體外3D培養(yǎng)模型將有助于跨越2D細(xì)胞培養(yǎng)與動物試驗之間的鴻溝，因為3D細(xì)胞培養(yǎng)可以利用傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)研究工具，并模擬體內(nèi)狀態(tài)提供細(xì)胞生長支架，綜合了2D細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型的優(yōu)點。3D細(xì)胞培養(yǎng)可以模擬細(xì)胞生長的微環(huán)境，模擬體內(nèi)細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)的相互作用，準(zhǔn)確反映癌細(xì)胞和間質(zhì)之間作用的機(jī)理。同時，3D細(xì)胞模型營造出的細(xì)胞微環(huán)境也更適合于誘導(dǎo)出細(xì)胞的極性，這對組織和其產(chǎn)品的直接分泌是很重要的。

隨著人們與納米氧化鋅接觸的日益增多，其對人類健康的潛在毒性影響也引起了高度關(guān)注。研究納米材料對細(xì)胞毒性的眾多試驗中，二維（2D）單層細(xì)胞培養(yǎng)仍然是占主導(dǎo)地位的體外模型。在傳統(tǒng)2D塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞會失去其原有的組織結(jié)構(gòu)，極性以及蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)相互作用，而且相比體內(nèi)模型往往會改變細(xì)胞的代謝、表型以及基因表達(dá)。當(dāng)二維細(xì)胞培養(yǎng)模型擴(kuò)展到納米毒理學(xué)研究，它的這些限制有可能導(dǎo)致獲得誤導(dǎo)性結(jié)果和結(jié)論的風(fēng)險。實際上在體內(nèi)的所有細(xì)胞都生長在一個三維（3D）環(huán)境中，單個細(xì)胞的表型和功能是高度依賴于三維組織-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白和鄰近細(xì)胞的復(fù)雜相互作用。

因此，在一個高度模擬體內(nèi)生理環(huán)境的體外3D模型中進(jìn)行納米粒子的毒性研究可以為納米材料的生物安全性評價提供更多理論基礎(chǔ)和參考價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述提到的缺陷和不足，而提供基于3D的Caco-2細(xì)胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法。

本發(fā)明實現(xiàn)其目的采用的技術(shù)方案如下。

基于3D的Caco-2細(xì)胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）3D細(xì)胞培養(yǎng)：在試驗前將無菌離心管分裝的Matrigel膠置于冰上溶解2~3 h，再將移液器槍頭和96孔培養(yǎng)板置于冰上冷卻1 h；取10~20 μL Matrigel膠均勻的包埋細(xì)胞培養(yǎng)板底部，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min使其凝固；消化二維細(xì)胞，計數(shù)并稀釋至2 x 10⁴/mL，分別吸取50 μL細(xì)胞懸液和Matrigel膠，按1:1混勻后轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板，再置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min使其凝固；重新凝固的膠上層滴加100 μL 含有10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培養(yǎng)基，在條件為37 ℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔2~3天換一次完全DMEM培養(yǎng)基；

2）細(xì)胞傳代：Caco-2細(xì)胞貼壁生長，經(jīng)過3-4 d，細(xì)胞生長至單層80%-95%時，棄掉上清液，用適量PBS輕輕沖洗，棄掉廢液，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化3-5 min，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞剛剛變圓時，加入少量10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化過程，用吸管吸取培養(yǎng)基，輕輕吹打使細(xì)胞不再貼壁，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，并加入適量培養(yǎng)基，放入條件為37 ℃、5% CO²的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4 d后，進(jìn)行下一次傳代培養(yǎng)；

3）將納米氧化鋅粉末分散在無血清的DMEM培養(yǎng)基中，制成不同濃度納米氧化鋅懸液；放入4 ℃冰箱中備用；每次使用前，需使用使用超聲波細(xì)胞破碎儀使納米材料解聚，超聲條件為：3 min，超3 s停2 s，功率300 w；

4）在3D培養(yǎng)條件下，進(jìn)行納米材料表征和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，采用MTT比色法檢測細(xì)胞活性，對炎癥因子白細(xì)胞介素-8（IL-8）進(jìn)行檢測，借助流式細(xì)胞儀檢測不同的細(xì)胞死亡方式；使用 SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，計算p<0.05和p<0.01的差異顯著性。

進(jìn)一步，步驟4）中，所述納米材料表征，包括以下步驟：納米顆粒由無水乙醇超聲混懸，滴加到銅網(wǎng)上干燥透射電鏡下鏡檢；采用馬爾文粒徑儀對納米顆粒進(jìn)行強(qiáng)度和粒徑分布的分析。

進(jìn)一步，步驟4）中，所述細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，包括以下步驟：將3D 培養(yǎng)條件下的Caco-2細(xì)胞，進(jìn)行染毒處理，細(xì)胞分別與濃度為10和75 μg/mL的24 nm納米氧化鋅染毒溶液共培養(yǎng)12 h；孵育12 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍攝照片；對照組細(xì)胞是與無血清的DMEM培養(yǎng)基共培養(yǎng)。

進(jìn)一步，步驟4）中，采用MTT比色法檢測細(xì)胞活性，包括以下步驟：將3D細(xì)胞進(jìn)行染毒處理，即加入0， 10， 25， 50， 75， 100 μg/ml不同濃度的24， 56， 87 nm三種粒徑納米氧化鋅染毒液與細(xì)胞共培養(yǎng)12 h；染毒時間結(jié)束后，PBS潤洗2次，每孔加入0.05 mg/mL的MTT200 μL，進(jìn)行4 h孵育后，吸除MTT上清液，再加入150 μL DMSO于搖床上進(jìn)行低速震蕩15 min，為使細(xì)胞內(nèi)形成的紫色結(jié)晶物充分溶解；用多功能酶標(biāo)儀測量570 nm處的OD值；試驗中設(shè)調(diào)零組（DMEM，MTT和DMSO），對照組（細(xì)胞，DMEM，MTT和DMSO）；3D培養(yǎng)需要設(shè)不含細(xì)胞，只含有凝膠的空白對照組；

計算細(xì)胞活力，公式如下：

細(xì)胞活力= OD(Aexp)-OD(Aneg)/OD(Acon)-OD(Aneg)

其中，Aexp是試驗組；Aneg是調(diào)零組；Acon是試驗對照組。

進(jìn)一步，步驟4）中，對炎癥因子白細(xì)胞介素-8（IL-8）進(jìn)行檢測，包括以下步驟：

（1）準(zhǔn)備試劑：

采用IL-8檢測試劑盒對IL-8蛋白水平進(jìn)行檢測；按照試劑盒說明書來進(jìn)行試劑的準(zhǔn)備，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（2）制備樣品：

將3D細(xì)胞進(jìn)行染毒處理，即加入0 ~ 100 μg/mL不同濃度的三種粒徑納米氧化鋅染毒液與細(xì)胞共培養(yǎng)12 h；染毒時間結(jié)束后，1000 rpm，離心10 min以除去一些聚合物和納米顆粒，收集上清液并轉(zhuǎn)入新的96孔板，待進(jìn)行后續(xù)試驗；

（3）分析樣品：

酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，計算樣品濃度。

進(jìn)一步，步驟4）中，借助流式細(xì)胞儀檢測不同的細(xì)胞死亡方式，采用Annexin V-Alexa Fluor 488法，包括以下步驟：

在3D培養(yǎng)條件下，進(jìn)行細(xì)胞染毒處理，即加入不同濃度的24 nm納米氧化鋅染毒液與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h；染毒時間結(jié)束后，棄上層納米氧化鋅染毒液，加入100 μL的3D細(xì)胞回收液，輕輕的將膠層刮起，置于冰上融解30 min，每隔10 min搖勻一次，待細(xì)胞沉淀可以順利沉到管底，說明Matrigel膠基本融解完全；此時，2000 rpm，離心5 min，棄上清液，待進(jìn)行后續(xù)試驗；

將上述3D細(xì)胞樣品每孔加入100 μL的1X Annexin-binding buffer重懸細(xì)胞；向每孔分別加5 μL Annexin V-Alexa Fluor? 488和1μL的100 μg/mL PI工作液，于室溫下孵育15 min后立即利用流式細(xì)胞儀在530 nm和575 nm處檢測熒光值。

本發(fā)明的基于3D的Caco-2細(xì)胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，評估了在3D細(xì)胞培養(yǎng)模型中納米氧化鋅對細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)以及對納米氧化鋅毒性。這些研究對于體外探討納米氧化鋅的腸毒性具有一定的理論意義，并為納米氧化鋅限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考，為進(jìn)一步研究納米氧化鋅的安全問題提供可靠的科學(xué)依據(jù)，為其它納米材料的安全性評價提供參考，同時也為納米氧化鋅的安全使用提供理論支撐。

附圖說明

圖1是三種納米氧化鋅(24 nm，56 nm，87 nm)透射電鏡(TEM)實驗圖；

圖2是三種納米氧化鋅(24 nm，56 nm，87 nm)馬爾文粒徑儀檢測粒徑分布圖；

圖3是正常3D細(xì)胞形態(tài)圖；

圖4是3D Caco-2細(xì)胞與25μg/ml的24nm納米氧化鋅接觸培養(yǎng)12h后的形態(tài)圖；

圖5是3D Caco-2細(xì)胞與100μg/ml的24nm納米氧化鋅接觸培養(yǎng)12h后的形態(tài)圖；

圖6是三種納米氧化鋅(24，56，87 nm)染毒3DCaco-2細(xì)胞12 h后活力比較；

圖7是三種納米氧化鋅(24，56，87 nm)染毒3D細(xì)胞后IL-8蛋白含量；

圖8是24 nm納米氧化鋅染毒24 h后3DCaco-2細(xì)胞不同死亡方式的百分比。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實驗材料：

人結(jié)腸腺癌上皮（Caco-2）細(xì)胞 上海漢恒生物

納米氧化鋅 秦皇島太極環(huán)

DMEM培養(yǎng)基 美國Hyclone公司

MTT細(xì)胞增殖及毒性檢驗試劑盒 Beyotime（碧云天）

磷酸鹽緩沖液(PBS) 美國Gibco公司

胎牛血清(FBS) 杭州四季青

0.25％胰酶(Typsin) 美國Hyclone公司

人白細(xì)胞介素8（IL-8）檢測試劑盒 安迪生物

吖啶橙（AO） 美國Sigma分裝

溴乙錠（EB） 美國Sigma分裝

Annexin V-Alexa Fluor? 488凋亡檢測試劑盒 上海麥約爾

其他化學(xué)試劑均為分析純。

主要儀器：

超聲波清洗儀 寧波市鄞州弗蘭克超聲機(jī)械設(shè)備廠

高速冷凍離心機(jī) 美國熱電公司

真空干燥箱 上海美譜達(dá)儀器有限公司

超純水系統(tǒng) Millipore公司

恒溫數(shù)顯水浴鍋 上海申源科學(xué)儀器有限公司

透射電鏡 日本JEOL公司

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo公司

酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司

倒置熒光顯微鏡 德國Leica公司

超聲波細(xì)胞破碎儀 德國Microson公司

真空干燥箱超凈工作臺 蘇州凈化

Nano-S90納米粒度分析 英國Malvan公司

流式細(xì)胞儀 德國Partech公司

基于3D的Caco-2細(xì)胞對納米氧化鋅生物安全性的評價方法，包括如下步驟：

1）3D細(xì)胞培養(yǎng)：在試驗前將無菌離心管分裝的Matrigel膠置于冰上溶解2~3 h，再將移液器槍頭和96孔培養(yǎng)板置于冰上冷卻1 h。取10~20 μL Matrigel膠均勻的包埋細(xì)胞培養(yǎng)板底部，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min使其凝固；消化二維細(xì)胞，計數(shù)并稀釋至2 x 10⁴/mL，分別吸取50 μL細(xì)胞懸液和Matrigel膠，按1:1混勻后轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板，再置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱30 min使其凝固；重新凝固的膠上層滴加100 μL 含有10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培養(yǎng)基，在條件為37 ℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔2~3天換一次完全DMEM培養(yǎng)基。

2）細(xì)胞傳代：Caco-2細(xì)胞貼壁生長，經(jīng)過3-4 d，細(xì)胞生長至單層80%-95%時，棄掉上清液，用適量PBS輕輕沖洗，棄掉廢液，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化3-5 min，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞剛剛變圓時，加入少量10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化過程，用吸管吸取培養(yǎng)基，輕輕吹打使細(xì)胞不再貼壁，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，并加入適量培養(yǎng)基，放入條件為37 ℃、5% CO²的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4 d后，進(jìn)行下一次傳代培養(yǎng)。

3）將納米氧化鋅粉末分散在無血清的DMEM培養(yǎng)基中，制成不同濃度納米氧化鋅懸液。放入4 ℃冰箱中備用。因為納米材料易發(fā)生團(tuán)聚，使得該分散體系不穩(wěn)定，因此每次使用前，需使用使用超聲波細(xì)胞破碎儀使納米材料解聚，超聲條件為：3 min，超3 s停2 s，功率300 w。

4）在3D培養(yǎng)條件下，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞活性檢測：

4.1）納米材料表征：納米顆粒由無水乙醇超聲混懸，滴加到銅網(wǎng)上干燥透射電鏡下鏡檢。采用馬爾文粒徑儀對納米顆粒進(jìn)行強(qiáng)度和粒徑分布的分析。

4.2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：將3D 培養(yǎng)條件下的Caco-2細(xì)胞，進(jìn)行染毒處理，細(xì)胞分別與濃度為10和75 μg/mL的24 nm納米氧化鋅染毒溶液共培養(yǎng)12 h。孵育12 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍攝照片。對照組細(xì)胞是與無血清的DMEM培養(yǎng)基共培養(yǎng)。

4.3）采用MTT比色法檢測細(xì)胞活性：將3D細(xì)胞進(jìn)行染毒處理，即加入0， 10， 25， 50， 75， 100 μg/ml不同濃度的24， 56， 87 nm三種粒徑納米氧化鋅染毒液與細(xì)胞共培養(yǎng)12 h。染毒時間結(jié)束后，PBS潤洗2次，每孔加入0.05 mg/mL的MTT200 μL，進(jìn)行4 h孵育后，吸除MTT上清液，再加入150 μL DMSO于搖床上進(jìn)行低速震蕩15 min，為使細(xì)胞內(nèi)形成的紫色結(jié)晶物充分溶解。用多功能酶標(biāo)儀測量570 nm處的OD值。試驗中設(shè)調(diào)零組（DMEM，MTT和DMSO），對照組（細(xì)胞，DMEM，MTT和DMSO）。3D培養(yǎng)需要設(shè)不含細(xì)胞，只含有凝膠的空白對照組；

計算細(xì)胞活力，公式如下：

細(xì)胞活力= OD(Aexp)-OD(Aneg)/OD(Acon)-OD(Aneg)

其中，Aexp是試驗組；Aneg是調(diào)零組；Acon是試驗對照組。

4.4）炎癥因子人白細(xì)胞介素-8（IL-8）的測定：

（4.4.1）準(zhǔn)備試劑：

采用IL-8檢測試劑盒對IL-8蛋白水平進(jìn)行檢測。按照試劑盒說明書來進(jìn)行試劑的準(zhǔn)備，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（4.4.2）制備樣品：

將3D細(xì)胞進(jìn)行染毒處理，即加入0 ~ 100 μg/mL不同濃度的三種粒徑納米氧化鋅染毒液與細(xì)胞共培養(yǎng)12 h。染毒時間結(jié)束后，1000 rpm，離心10 min以除去一些聚合物和納米顆粒，收集上清液并轉(zhuǎn)入新的96孔板，待進(jìn)行后續(xù)試驗；

（4.4.3）分析樣品：

酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，計算樣品濃度。

4.5）Annexin V-Alexa Fluor 488法：

在3D培養(yǎng)條件下，進(jìn)行細(xì)胞染毒處理，即加入不同濃度的24 nm納米氧化鋅染毒液與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。染毒時間結(jié)束后，棄上層納米氧化鋅染毒液，加入100 μL的3D細(xì)胞回收液，輕輕的將膠層刮起，置于冰上融解30 min，每隔10 min搖勻一次，待細(xì)胞沉淀可以順利沉到管底，說明Matrigel膠基本融解完全。此時，2000 rpm，離心5 min，棄上清液，待進(jìn)行后續(xù)試驗；

將上述3D細(xì)胞樣品每孔加入100 μL的1X Annexin-binding buffer重懸細(xì)胞。向每孔分別加5 μL Annexin V-Alexa Fluor? 488和1μL的100 μg/mL PI工作液，于室溫下孵育15 min后立即利用流式細(xì)胞儀在530 nm和575 nm處檢測熒光值。

4.6）數(shù)據(jù)處理

結(jié)果使用 SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，計算p<0.05和p<0.01的差異顯著性。所有數(shù)據(jù)被表示為三個獨立試驗的平均值±SE，P＜0.05為在統(tǒng)計學(xué)意義的差異具有顯著性。*表示 p<0.05（與對照組相比），**表示p<0.01（與對照組相比）。

實驗結(jié)果與討論

1）納米材料的形態(tài)和粒徑分布

如圖1 PBS作為分散劑超生混懸納米氧化鋅樣品后，在透射電鏡下觀察三種粒徑納米氧化鋅樣品形態(tài)，可見其分散性良好，部分粒子呈聚集狀態(tài)，單粒子多呈棒狀或球形。

如圖2三種粒徑的納米氧化鋅樣品粒徑分布范圍從左往右依次為15-30 nm、30-70 nm、60-100 nm。

2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

如圖3，在3D培養(yǎng)模型中細(xì)胞聚集生長，形成比較大且呈球狀的細(xì)胞團(tuán)。

當(dāng)25 μg/mL的24 nm納米氧化鋅染毒3D細(xì)胞后，相比對照組，圖4中的3D細(xì)胞的形態(tài)沒有變化。

當(dāng)染毒濃度增加至75 μg/mL時，圖5中3D細(xì)胞的形態(tài)仍沒有發(fā)生明顯的變化，但細(xì)胞球團(tuán)變小。

3）MTT法檢測細(xì)胞活性

圖6是三種粒徑的納米氧化鋅染毒Caco-2 的3D細(xì)胞12 h后的細(xì)胞活性比。

如圖6所示，3D細(xì)胞活性隨染毒濃度的升高而減少，但與對照組相比，低濃度（≤25 μg/mL）下的細(xì)胞活力與之沒有顯著性差異，濃度高于50 μg/mL的試驗組細(xì)胞活力與對照組相比具有顯著性差異。進(jìn)行組內(nèi)比較粒徑大小對細(xì)胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)24 nm，56 nm和87 nm納米氧化鋅試驗組的細(xì)胞活力差異沒有顯著性，表明納米氧化鋅的粒徑大小對3D細(xì)胞毒性影響沒有明顯差異。

4）炎癥因子IL-8的測定

如圖7所示，不同濃度的三種粒徑納米氧化鋅與3D細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，IL-8蛋白含量隨著濃度的增加而呈現(xiàn)出遞增趨勢。尤其是24 nm納米氧化鋅的濃度高于75 μg/mL后，IL-8含量顯著增加；與對照組相比，濃度為100 μg/mL引起IL-8含量增加了2.5倍。進(jìn)行組內(nèi)比較，在濃度高于50 μg/mL后，24 nm納米氧化鋅引起最高的炎癥反應(yīng)，而比較56 nm納米氧化鋅與87 nm納米氧化鋅的染毒結(jié)果表明兩者沒有明顯的差異。

5）Annexin V-Alexa Fluor 488法

如圖8所示，濃度為75 μg/mL和100 μg/mL，3D培養(yǎng)條件下早期凋亡細(xì)胞比例分別為5.61%，7.42%。濃度為100 μg/mL 引起3D培養(yǎng)條件下晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞分別是對照組的21.1倍和2.5倍。當(dāng)濃度為100 μg/mL時，3D培養(yǎng)條件下正?；罴?xì)胞數(shù)相對輕微減少，比例為72.4%。不同濃度的納米氧化鋅染毒3D細(xì)胞，細(xì)胞死亡的主要形式都是凋亡。

本實驗三種粒徑納米氧化鋅指采用24， 56， 87 nm的納米氧化鋅。本發(fā)明按照實施例進(jìn)行了說明，在不脫離本原理的前提下，本裝置還可以作出若干變形和改進(jìn)。應(yīng)當(dāng)指出，凡采用等同替換或等效變換等方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。