本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)的檢測豬人住肉孢子蟲的試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

住肉孢子蟲病是一類重要的食源性寄生蟲病，是由復頂亞門、孢子蟲綱、真球蟲目、住肉孢子蟲科、住肉孢子蟲屬原蟲寄生于動物肌肉和各臟器毛細血管內(nèi)皮細胞內(nèi)所引起的一類人獸共患原蟲病。目前，豬住肉孢子蟲病的病原有三種：米氏住肉孢子蟲(S.miescheriana)、豬人住肉孢子蟲(S.suihominis)和豬貓住肉孢子蟲(S.porcifelis)。豬人住肉孢子蟲中間宿主是豬，終末宿主是人和非人類的靈長類動物，人食入豬肉中的肉孢子蟲后有一定的危害，可引起人惡心、腹瀉。因此，開展對豬人住肉孢子蟲病的研究對人類健康及養(yǎng)殖業(yè)有重要的意義。

目前對豬住肉孢子蟲病的診斷技術(shù)主要依賴于臨床癥狀的觀察、流行病學調(diào)查、剖檢大體變化等作初步判斷，而確診則依賴顯微鏡檢觀察或組織病理學的染色技術(shù)。這些傳統(tǒng)方法存在費時費事、靈敏性和特異性不強、檢測程序繁瑣、工作量大等不足，很難適應現(xiàn)代化食品安全快速檢測的需要。雖然PCR方法雖然較傳統(tǒng)方法擁有操作簡單，靈敏性與特異性強等優(yōu)點，但仍然需要3個小時左右的時間才能出結(jié)果，無法立即確診，并且必須配備專用儀器，且常有非特異性出現(xiàn)。

環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)(LAMP)技術(shù)是一種新穎的恒溫核酸擴增方法。其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件(65℃左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。該方法不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，并且反應結(jié)果可通過添加SYBR Green I觀察體系顏色變化確定組織中是否感染豬人住肉孢子蟲，若感染，則體系為黃綠色，未感染則為橙黃色。目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)廣泛應到病原微生物的檢測上，在寄生蟲診斷方面也有部分報道，如旋毛蟲、牛巴貝斯蟲、胎兒毛滴蟲、賈第蟲、火雞組織滴蟲等，而在豬人住肉孢子蟲方面的研究卻是空白。與上述幾種實驗室診斷方法相比，環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)對儀器設備要求不高，具有操作簡單、臨床上容易做到、檢測時間短的特點。中國專利ZL201210494834.3公開了一種適用于火雞組織滴蟲LAMP檢測試劑盒，包括含有10x等溫反應緩沖液、BstDNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、四種引物混合液、甜菜堿和去離子水的反應液A，以及含有1000x的熒光染料SYBR Green I的反應液B，通過肉眼檢測反應液顏色差異，實現(xiàn)至少為1個基因拷貝的檢測靈敏度。然而，基于火雞組織滴蟲與豬人住肉孢子蟲的病原學、寄生部位及各自生活史的不同，該試劑盒不能用于檢測豬人住肉孢子蟲。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，從而快速、準確、而且更加靈敏、高效地檢測豬人住肉孢子蟲。其設計理念是：充分利用LAMP技術(shù)特異性強、靈敏度高、快速且成本低等優(yōu)點，并針對豬人住肉孢子蟲對靶基因的特點設定4種引物，利用鏈置換反應在恒溫下使靶基因高效擴增。

為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒，包括以下成分：

(1)反應液A：

含有10x等溫反應緩沖液、8000U/mL BstDNA聚合酶、0.5mM dNTP、2mM MgCl₂、含1.4μM內(nèi)引物1和1.4μM內(nèi)引物2的內(nèi)引物混合液、含0.2μM外引物1和0.2μM外引物2的外引物混合液、1M甜菜堿和去離子水，其中：

10x等溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8.8)、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％(m/V)曲拉通X-100(pH8.8，25℃)；

內(nèi)引物1為:TCTACCATAAACTATGCCGACTAGACTTTGATTTCTCATGAGGTGC(SEQ ID No.1)，

內(nèi)引物2為:ACCCCCTACTGTCGTTCTTGATTGTTAAAGACGAACTACTGCG(SEQ ID No.2)，

外引物1為:CGTATTTAACTGTCAGAGGTGA(SEQ ID No.3)，

外引物2為:TTCAGCCTTGCGACCATA(SEQ ID No.4)；

(2)反應液B：1000x熒光染料SYBR Green I。

本發(fā)明還提供了一種使用上述豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒檢測豬人住肉孢子蟲的方法，其主要技術(shù)步驟包括：

1)提取待測樣品DNA，制備DNA處理液；

2)豬人住肉孢子蟲的環(huán)介導等溫擴增：

將體積比為24:1的反應液A和步驟1)中所得的DNA處理液混勻離心，于60-65℃恒溫放置45-60min；

3)擴增產(chǎn)物的顯色檢測：

在步驟2)中所得的混合液中加入反應液B，其體積比為25:1，反應結(jié)束后充分混合，肉眼觀察反應液顏色：如顏色變?yōu)榫G色，表明樣品中豬人住肉孢子蟲，如顏色為黃色，說明待檢樣品不含有豬人住肉孢子蟲。

本發(fā)明還提供了上述豬人住肉孢子蟲LAMP檢測的引物組合、上述豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒、以及上述豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒的檢測方法在檢測豬人住肉孢子蟲方面的應用。

本發(fā)明的技術(shù)方案達到了如下的有益效果：

a)本發(fā)明建立了豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒，該試劑盒根據(jù)豬人住肉孢子蟲的18SrRNA基因保守區(qū)的6個部位設定了4種引物分別為：兩個特異性內(nèi)引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為豬人住肉孢子蟲所共有；

b)本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，特異性強，且比PCR檢測方法有更高的靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的金屬浴或水浴箱即可，且結(jié)果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速。可用于豬人住肉孢子蟲的檢測，特別適合于基層現(xiàn)場應用。

LAMP技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、快速且成本低等優(yōu)點，其特點是對靶基因的6個部位設定4種引物，利用鏈置換反應在恒溫下使靶基因高效擴增。由于其反應是多種引物共同啟動，使得反應結(jié)果比PCR更特異，另外，由于實行的是等溫擴增，反應在恒溫水浴箱內(nèi)便可完成，不僅節(jié)約儀器成本，而且操作方法更簡單，適于現(xiàn)場快速檢測。

本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測豬人住肉孢子蟲的方法所需周期長、靈敏度較低、成本高、現(xiàn)場應用困難等缺陷，提供的豬人住肉孢子蟲的檢測試劑盒及其檢測方法，對豬人住肉孢子蟲進行LAMP檢測，快速、準確性高、靈敏性好、現(xiàn)場應用方便，可廣泛應用于獸醫(yī)、食品、出入境檢疫領域。

附圖說明

圖1是具體實施例1的檢測結(jié)果。

圖中，左圖：陽性樣品，中圖：陰性樣品，右圖：空白對照。

具體實施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實施方式對本發(fā)明做進一步的介紹。

下列實例進一步說明本發(fā)明，但不應該當作對本發(fā)明的限制。

實施例1：

按下列配方制作豬人住肉孢子蟲的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒：

(1)反應液A：

含有10×等溫反應緩沖液、8000U/ml Bst DNA聚合酶、0.5mM dNTP、2mM MgCl2、1.4μM內(nèi)引物1和1.4μM內(nèi)引物2混合液、0.2μM外引物1和0.2μM外引物2混合液、1M甜菜堿和去離子水，其中：

10×等溫反應緩沖液含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8.8)、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％(m/V)曲拉通X-100(pH8.8，25℃)；

內(nèi)引物1為:TCTACCATAAACTATGCCGACTAGACTTTGATTTCTCATGAGGTGC(SEQ ID No.1)

內(nèi)引物2為:ACCCCCTACTGTCGTTCTTGATTGTTAAAGACGAACTACTGCG(SEQ ID No.2)

外引物1為:CGTATTTAACTGTCAGAGGTGA(SEQ ID No.3)

外引物2為:TTCAGCCTTGCGACCATA(SEQ ID No.4)

(2)反應液B：1000×的熒光染料SYBR Green I。

LAMP反應液A以每管24μL計，為2.5μL 10×等溫反應緩沖液、1.0μL 8U/μL Bst DNA聚合酶、1.25μL 0.5mM dNTP、3μl 2mM MgCl₂、2μL外引物混合液、7μL內(nèi)引物混合液、2.5μL 1M甜菜堿、4.75μL去離子水。

實施例2：

利用豬人住肉孢子蟲LAMP檢測試劑盒檢測豬人住肉孢子蟲。

待測樣本處理液制備：以樣本取自豬肉為例，感染豬人住肉孢子蟲豬肉作為陽性樣品，正常豬肉作為陰性樣品，同時設立不含樣品的去離子水作為空白對照。

A.取豬肉組織0.5g，置于1.5mL離心管中，研磨后加入1mL的組織裂解液(100mM pH8.0Tris，500mM pH 8.0EDTA，20mM NaCL，10％SDS)；

B.加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)混勻，置于65℃恒溫水浴鍋中水浴30min；

C.12000×g離心5min，將上清移入新離心管中；

D.加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)振蕩渦旋，12000×g離心5min，將上層液入另一離心管中；

E.加入2倍體積預冷的無水乙醇混勻，4℃沉淀20min，12000×g離心10min，去上清；

F.沉淀用800μL預冷的75％乙醇洗滌一次后12000×g，離心5min；

G.棄掉上清液，離心管倒置于吸水紙上，室溫干燥2-3min；

H.用20μL去離水重新溶解干燥后的沉淀，然后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

檢測：

(1)豬人住肉孢子蟲的環(huán)介導等溫擴增

在裝有24μL反應液A的PCR反應管中分別加入1μL上述制得的待檢陽性樣品的DNA處理液、正常豬肉的DNA處理液或者滅菌去離子水，作為陽性對照、陰性對照以及空白對照，混勻離心，將1μL的反應液B分別滴在PCR管蓋內(nèi)側(cè)中間，蓋緊管蓋(小心操作，以防顯色液墜入反應混合液中)，于60-65℃恒溫水浴箱中放置60min；

(2)擴增產(chǎn)物的顯色檢測

顛倒PCR管數(shù)次，使反應混合液與反應液B充分混合，觀察反應液顏色，根據(jù)反應液的顏色變化肉眼判斷檢測結(jié)果。陽性對照顏色變?yōu)榫G色，表明樣品中含有豬人住肉孢子蟲。陰性對照以及空白對照顏色為黃色，說明不含有豬人住肉孢子蟲。檢測試驗結(jié)果如圖1。

實施例3：豬人住肉孢子蟲檢測方法靈敏度試驗

取含有豬人住肉孢子蟲特異基因的質(zhì)粒DNA，按10倍比稀釋作為LAMP檢測試驗模板，使每μL稀釋液中含有模板基因拷貝數(shù)分別為10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10，1；

在裝有24μL反應液A的PCR反應管中分別加入1μL上述基因組稀釋液，同時設置不加質(zhì)粒DNA的空白對照，混勻離心，將1μL的反應液B滴在PCR管蓋內(nèi)側(cè)中間，蓋緊管蓋于60-65℃恒溫水浴箱中放置60min；

顛倒PCR管數(shù)次，使反應混合液與反應液B充分混合，肉眼觀察反應液顏色，結(jié)果顯示加有質(zhì)粒DNA的反應管變?yōu)榫G色，對照管顏色為黃色，說明該試劑盒的檢測靈敏度至少為10個基因拷貝。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。