本發(fā)明涉及抗體及其制備方法，特別涉及用于針對念珠菌甘露聚糖(Mannan，Mn)抗原的一種多克隆抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：白色念珠菌是一種條件致病念珠菌，人體在正常情況下不會受到白色念珠菌的感染，只有機(jī)體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用失調(diào)時(shí)，可能感染白色念珠菌，引起深部感染，甚至全身散播性感染。近年來由于人口老齡化，免疫抑制劑及廣譜抗生素的大量應(yīng)用，艾滋病、惡性腫瘤發(fā)病率的增加，器官、骨髓移植及介入治療的廣泛開展，臨床上侵襲性念珠菌感染的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。由于缺乏有效的診斷方法，侵襲性念珠菌感染后易造成漏診、誤診而延誤治療，因此，發(fā)展早期、快速且特異的侵襲性念珠菌感染診斷學(xué)方法成為臨床上迫切需要解決的問題。目前臨床對于侵襲性念珠菌感染常規(guī)的診斷方法主要包括以下幾種：(1)組織病理學(xué)診斷方法在組織切片中找到病原念珠菌是確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，有念珠菌侵襲和相應(yīng)的炎癥反應(yīng)與組織損害或組織標(biāo)本念珠菌培養(yǎng)陽性即可確定念珠菌感染的診斷。但組織病理學(xué)檢查取材需要侵入性操作，重癥患者難以耐受，可行性差。其敏感性受到取材的影響，一次切片未必能夠找到念珠菌成分，且侵襲性念珠菌感染可引起各種各樣的組織反應(yīng)，給診斷帶來較大困難。(2)直接鏡檢和培養(yǎng)直接鏡檢是念珠菌學(xué)檢查最經(jīng)典的方法，具有簡便、快速、實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)，可以在顯微鏡下直接觀察念珠菌形態(tài)。但直接鏡檢陽性率較低，陰性結(jié)果不能排除診斷，且同一菌屬內(nèi)的多種念珠菌鏡下形態(tài)相似，對于菌種鑒定沒特別的幫助。而培養(yǎng)檢查需要結(jié)合菌落特征、生化試驗(yàn)等進(jìn)行詳細(xì)觀察，培養(yǎng)過程耗時(shí)長，有時(shí)需要數(shù)周時(shí)間重復(fù)多次接種才能得出正確結(jié)果，且敏感性和陽性率較低，同時(shí)對操作人員的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)要求高，不利于早期診斷。(3)影像學(xué)檢查動態(tài)影像學(xué)檢查對提示診斷具有重要作用，胸部CT掃描，特別是高分辨率CT的臨床應(yīng)用對早期診斷價(jià)值較高。但影像學(xué)檢測特異性較差，接合菌、鐮孢菌、放線菌、奴卡菌、金黃色葡萄球菌等血管侵襲性感染在影像學(xué)上可能與侵襲性真菌相似，所以影像學(xué)檢查通常只能作為輔助診斷手段。甘露聚糖(mannan)是白色念珠菌細(xì)胞壁的主要抗原成分。對于白色念珠菌感染的診斷，除了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，測定血清中白色念珠菌甘露聚糖抗原，逐漸成為白色念珠菌早期診斷的簡單、快捷的方法。免疫檢測技術(shù)是利用抗原抗體間能特異性結(jié)合反應(yīng)，通過檢測標(biāo)記在反應(yīng)物上的標(biāo)記物，對抗原或抗體實(shí)現(xiàn)定性或定量檢測的方法。根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)的不同，分為酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(Enzyme-LinkedImmunosorbantAssay,ELISA)、免疫熒光檢測技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)、免疫微球技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)等。其中ELISA技術(shù)具有操作簡單，靈敏度高，檢測時(shí)間短的特點(diǎn)，在臨床檢測和科學(xué)研究中被廣泛使用。而測定抗原作為白色念珠菌感染診斷方法的關(guān)鍵，便是得到針對白色念珠菌甘露聚糖抗原的抗體。所以，迫切需要一種方法能夠制備針對白色念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗體。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種穩(wěn)定、高效、特異性高的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體及其制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體，按以下步驟制得：(1)用滅活的念珠菌菌體作為免疫原免疫動物，經(jīng)分離純化后得到初步純化的多克隆抗體；(2)將念珠菌甘露聚糖Mn抗原交聯(lián)于親和層析基質(zhì)，得到念珠菌甘露聚糖Mn免疫親和層析柱；(3)步驟(1)得到的初步純化的多克隆抗體經(jīng)步驟(2)得到的免疫親和層析柱純化后，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體。優(yōu)選的，所述步驟(1)中，將滅活的念珠菌菌體進(jìn)行破碎，用破碎后的念珠菌菌體作為免疫原；更優(yōu)選的，可采用反復(fù)凍融法、超聲破碎法、高速離心法、高速組織搗碎法和滲透壓差法中的一種或幾種進(jìn)行破碎；更優(yōu)選的，采用反復(fù)凍融法和/或超聲破碎法進(jìn)行破碎。優(yōu)選的，所述步驟(1)中，動物選自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、羊、馬、豬、驢中的一種或多種。念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體采用間接法ELISA檢測，效價(jià)不低于1:1×105。優(yōu)選的，所述步驟(1)中，免疫采用皮下注射法、脾內(nèi)注射法、靜脈注射法、腹腔注射法中的一種；所述的免疫的免疫劑量依照動物的種類確定，優(yōu)選為10-1000μg/只/次。優(yōu)選的，為獲得較好的免疫效果，所述步驟(1)中，每隔5-9天(優(yōu)選6-8天，更優(yōu)選為7天)測定免疫后動物的血清效價(jià)；免疫次數(shù)優(yōu)選為3-5次，例如4次。優(yōu)選的，所述步驟(1)中，分離純化的方法包括飽和硫酸銨鹽析法、辛酸沉淀法、DEAE離子交換層析法、羥基磷灰石層析法、凝膠層析法等。優(yōu)選的，采用飽和硫酸銨鹽析法進(jìn)行分離純化。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述步驟(1)具體包括：用反復(fù)凍融法和超聲破碎法將滅活的念珠菌菌體進(jìn)行破碎，用破碎后的念珠菌菌體免疫動物；測定免疫后動物的血清效價(jià)，從免疫后的動物體內(nèi)取血；用飽和硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化，得到初步純化的多克隆抗體。優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述親和層析基質(zhì)選自蛋白A微珠、蛋白G微珠、活性微珠；更優(yōu)選為蛋白G微珠。優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述念珠菌甘露聚糖Mn抗原與親和層析基質(zhì)的比例為：每1mL親和層析基質(zhì)結(jié)合1-4mg念珠菌甘露聚糖Mn抗原。優(yōu)選的，所述步驟(2)中，采用雙功能結(jié)合劑將念珠菌甘露聚糖Mn抗原交聯(lián)于親和層析基質(zhì)，所述雙雙功能結(jié)合劑選自二甲基庚二酸酯、羰基二咪唑、溴化氰、羥基丁二酰亞胺、乙?；?，優(yōu)選二甲基庚二酸酯。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述步驟(2)具體包括如下步驟：將念珠菌甘露聚糖Mn抗原溶于碳酸鹽緩沖液或醋酸-醋酸鈉緩沖液中，并與親和層析基質(zhì)混合成勻漿，其中，每1mL蛋白A微珠結(jié)合1-4mg念珠菌甘露聚糖Mn抗原；用0.1-0.3mol/L的硼酸鈉溶液洗滌得到的勻漿，并離心，得到抗原與親和層析基質(zhì)的混合物，其中，硼酸鈉溶液pH值為8.0-9.5，用量為5-15倍親和層析基質(zhì)體積；用0.1-0.3mol/L的硼酸鈉溶液重懸得到的抗原與親和層析基質(zhì)的混合物，向得到的混懸液中加入二甲基庚二酸酯，室溫孵育20-40min，并混勻，液固分離，得到親和層析基質(zhì)-抗原交聯(lián)復(fù)合物，其中，硼酸鈉溶液pH值為8.0-9.5，用量為5-15倍親和層析基質(zhì)體積，二甲基庚二酸酯在混懸液中的終濃度為10-30mmol/L；用0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液洗滌得到的親和層析基質(zhì)-抗原交聯(lián)復(fù)合物；將得到的親和層析基質(zhì)-抗原交聯(lián)復(fù)合物重懸于0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液中，室溫孵育1.5-2.5h，混勻；將得到的親和層析基質(zhì)-抗原交聯(lián)復(fù)合物填充入層析柱中，制得念珠菌甘露聚糖Mn免疫親和層析柱。優(yōu)選的，所述步驟(3)具體包括如下步驟：用10-25倍柱床體積的預(yù)洗脫緩沖液洗柱；將步驟(1)初步純化的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體上樣；用10-25倍柱床體積的結(jié)合緩沖液洗柱；用10-25倍柱床體積的預(yù)洗脫緩沖液洗柱；采用分段洗脫法，連續(xù)以0.4-0.8倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱，分別收集洗脫組分，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體。在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述結(jié)合緩沖液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液中的一種，優(yōu)選為PBS緩沖液；所述預(yù)洗脫緩沖液為碳酸鹽緩沖液或醋酸-醋酸鈉緩沖液；所述洗脫緩沖液選自0.1M甘氨酸緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH為3.0。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，檢測各洗脫組分中的多克隆抗體含量，將濃度高的多克隆抗體洗脫組分合并。此外，可用10-25倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱，使所述免疫親和層析柱再生，當(dāng)加入0.01％硫柳汞時(shí)，免疫親和層析柱可長期保存于4℃的環(huán)境中。本發(fā)明還提供了一種念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：(1)用滅活的念珠菌菌體作為免疫原免疫動物，經(jīng)分離純化后得到初步純化的多克隆抗體；(2)將念珠菌甘露聚糖Mn抗原交聯(lián)于親和層析基質(zhì)，得到念珠菌甘露聚糖Mn免疫親和層析柱；(3)步驟(1)得到的初步純化的多克隆抗體經(jīng)步驟(2)得到的免疫親和層析柱純化后，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體。優(yōu)選的，所述步驟(1)中，將滅活的念珠菌菌體進(jìn)行破碎，用破碎后的念珠菌菌體作為免疫原；更優(yōu)選的，可采用反復(fù)凍融法、超聲破碎法、高速離心法、高速組織搗碎法和滲透壓差法中的一種或幾種進(jìn)行破碎；更優(yōu)選的，采用反復(fù)凍融法和/或超聲破碎法進(jìn)行破碎。優(yōu)選的，所述步驟(1)中，動物選自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、羊、馬、豬、驢中的一種或多種。優(yōu)選的，所述步驟(1)中，免疫采用皮下注射法、脾內(nèi)注射法、靜脈注射法、腹腔注射法中的一種；所述的免疫的免疫劑量依照動物的種類確定，優(yōu)選為10-1000μg/只/次。優(yōu)選的，為獲得較好的免疫效果，所述步驟(1)中，每隔5-9天(優(yōu)選6-8天，更優(yōu)選為7天)測定免疫后動物的血清效價(jià)；免疫次數(shù)優(yōu)選為3-5次，例如5次。優(yōu)選的，所述步驟(1)中，分離純化的方法包括飽和硫酸銨鹽析法、辛酸沉淀法、DEAE離子交換層析法、羥基磷灰石層析法、凝膠層析法等。優(yōu)選的，采用飽和硫酸銨鹽析法進(jìn)行分離純化。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述步驟(1)具體包括：用反復(fù)凍融法和超聲破碎法將滅活的念珠菌菌體進(jìn)行破碎，用破碎后的念珠菌菌體免疫動物；測定免疫后動物的血清效價(jià)，從免疫后的動物體內(nèi)取血；用飽和硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化，得到初步純化的多克隆抗體。優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述親和層析基質(zhì)選自蛋白A微珠、蛋白G微珠、活性微珠；更優(yōu)選為蛋白G微珠。優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述念珠菌甘露聚糖Mn抗原與親和層析基質(zhì)的比例為：每1mL親和層析基質(zhì)結(jié)合1-4mg念珠菌甘露聚糖Mn抗原。優(yōu)選的，所述步驟(2)中，采用雙功能結(jié)合劑將念珠菌甘露聚糖Mn抗原交聯(lián)于親和層析基質(zhì)，所述雙雙功能結(jié)合劑選自二甲基庚二酸酯、羰基二咪唑、溴化氰、羥基丁二酰亞胺、乙?；?，優(yōu)選二甲基庚二酸酯。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述步驟(2)具體包括如下步驟：將念珠菌甘露聚糖Mn抗原溶于碳酸鹽緩沖液或醋酸-醋酸鈉緩沖液中，并與親和層析基質(zhì)混合成勻漿，其中，每1mL親和層析基質(zhì)結(jié)合1-4mg念珠菌甘露聚糖Mn抗原；用0.1-0.3mol/L的硼酸鈉溶液洗滌得到的勻漿，并離心，得到抗原與親和層析基質(zhì)的混合物，其中，硼酸鈉溶液pH值為8.0-9.5，用量為5-15倍親和層析基質(zhì)體積；用0.1-0.3mol/L的硼酸鈉溶液重懸得到的抗原與親和層析基質(zhì)的混合物，向得到的混懸液中加入二甲基庚二酸酯，室溫孵育20-40min，并混勻，液固分離，得到親和層析基質(zhì)-抗原交聯(lián)復(fù)合物，其中，硼酸鈉溶液pH值為8.0-9.5，用量為5-15倍親和層析基質(zhì)體積，二甲基庚二酸酯在混懸液中的終濃度為10-30mmol/L；用0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液洗滌得到的親和層析基質(zhì)-抗原交聯(lián)復(fù)合物；將得到的親和層析基質(zhì)-抗原交聯(lián)復(fù)合物重懸于0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液中，室溫孵育1.5-2.5h，混勻；將得到的親和層析基質(zhì)-抗原交聯(lián)復(fù)合物填充入層析柱中，制得念珠菌甘露聚糖Mn免疫親和層析柱。優(yōu)選的，所述步驟(3)具體包括如下步驟：用10-25倍柱床體積的預(yù)洗脫緩沖液洗柱；將步驟(1)初步純化的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體上樣；用10-25倍柱床體積的結(jié)合緩沖液洗柱；用10-25倍柱床體積的預(yù)洗脫緩沖液洗柱；采用分段洗脫法，連續(xù)以0.4-0.8倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱，分別收集洗脫組分，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體。在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述結(jié)合緩沖液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液中的一種，優(yōu)選為PBS緩沖液；所述預(yù)洗脫緩沖液為碳酸鹽緩沖液或醋酸-醋酸鈉緩沖液；所述洗脫緩沖液選自0.1M甘氨酸緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH為3.0。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，檢測各洗脫組分中的多克隆抗體含量，將濃度高的多克隆抗體洗脫組分合并。此外，可用10-25倍柱床體積的洗脫緩沖液洗柱，使所述免疫親和層析柱再生，當(dāng)加入0.01％硫柳汞時(shí)，免疫親和層析柱可長期保存于4℃的環(huán)境中。本發(fā)明還一方面提供一種用于檢測念珠菌的試劑盒，所述試劑盒包括如本發(fā)明所述的念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗體或者如本發(fā)明所述的制備方法制備得到的念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗體。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括稀釋劑，所述稀釋劑選自生理鹽水、磷酸鹽緩沖液，PBS緩沖液，Tris-HCl緩沖液，硼酸鹽緩沖液，琥珀酸鹽緩沖液，或檸檬酸緩沖液中的一種或多種。優(yōu)選的，所述試劑盒還可包括一種或多種藥學(xué)上可接受的藥物載體和/或賦形劑，其在使用時(shí)通常可凍干保存。優(yōu)選的，所述試劑盒還可包括酶標(biāo)試劑，顯色劑，終止液，洗滌液等。本發(fā)明采用念珠菌滅活菌體作為免疫原產(chǎn)生多克隆抗體，并采用念珠菌甘露聚糖Mn抗原對多克隆抗體進(jìn)行特異性純化，本發(fā)明得到的多克隆抗體為國內(nèi)首例使用免疫親和層析提純的念珠菌甘露聚糖抗原的多克隆抗體，填補(bǔ)了國內(nèi)空白。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明所述方法制得的多克隆抗體具有效價(jià)高，特異性好的特點(diǎn)，且多克隆抗體性質(zhì)穩(wěn)定，有很強(qiáng)的應(yīng)用前景。附圖說明圖1顯示了兔IgG型多克隆抗體的SDS-PAGE檢測的結(jié)果。圖2顯示了兔IgG型多克隆抗體的效價(jià)測定的結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明中所述念珠菌是一種條件致病念珠菌，人體在正常情況下不會受到念珠菌的感染，只有機(jī)體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用失調(diào)時(shí)，可能感染白色念珠菌，引起深部感染，甚至全身散播性感染。本發(fā)明中所述“念珠菌甘露聚糖抗原”，“念珠菌甘露聚糖Mn抗原”，“甘露聚糖Mn抗原”，“Mn抗原”可依照上下文語義互換使用。本發(fā)明中所述“念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體”、“抗甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體”和“多克隆抗體”可依照上下文語義互換使用。本發(fā)明所使用的念珠菌甘露聚糖Mn抗原由丹娜(天津)生物科技有限公司提供。實(shí)施例1：初步純化的念珠菌甘露聚糖Mn抗原(以下簡稱GXM抗原)的多克隆抗體的制備一、用反復(fù)凍融法和超聲破碎法將滅活后念珠菌進(jìn)行破碎。具體方法為：(1)液體培養(yǎng)基中加入甲醛溶液，使甲醛終濃度為3.7％，于4℃放置24h滅活孢子。(2)滅活后的念珠菌菌體4℃4000rpm離心10min，去上清。3)用預(yù)冷的生理鹽水重懸孢子后反復(fù)洗滌6-10次，充分去除甲醛溶液。(3)加入液氮用滅菌的研缽研磨破碎3-5次，加水，冰浴下使用探頭式超聲破碎30min。(4)進(jìn)行BCA蛋白定量和苯酚硫酸法糖定量。二、免疫動物(1)將破碎的滅活的念珠菌菌體與弗氏完全佐劑等體積混合至合適體積。充分乳化后對新西蘭大耳兔進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每只兔免疫劑量控制在0.01-1mg。免疫前3天取耳血，分離血清做陰性對照。初次免疫后每2周免疫1次，方法與第1次相同。(2)免疫過程中，免疫后每隔幾天采血測效價(jià)1次，免疫次數(shù)不少于3次。(3)血清效價(jià)達(dá)到最高時(shí)，用頸動脈放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分離出后，高速離心，取上清，-20℃保存。三、用飽和硫酸銨鹽析法進(jìn)行初步純化(1)取2mL抗血清樣本，加等體積的生理鹽水，再加入4mL飽和硫酸銨溶液，4℃沉淀過夜。(2)10000g低溫離心10min，棄上清，將沉淀用2mLPBS溶解，緩慢滴加1mL飽和硫酸銨溶液，4℃靜置1h。(3)10000g低溫離心10min，棄上清，將沉淀用1mLPBS溶解，用PBS溶液4℃透析過夜。實(shí)施例2：念珠菌甘露聚糖Mn免疫親和層析柱的制備(1)將Mn抗原溶于碳酸鹽緩沖液中，按每毫升濕的蛋白G微珠結(jié)合4mgMn抗原，將Mn抗原和蛋白G微珠混合成為稀薄的勻漿，在總量為10mL的碳酸鹽緩沖液中加入大約2mL蛋白G微珠，室溫孵育1h，輕輕搖動混勻。(2)用5-15倍體積的0.2mol/L硼酸鈉(pH8.0-9.5)洗滌勻漿2次，每次以3000g離心2min，或10000g離心30s，得到MN抗原-蛋白G微珠的混合物。(3)用5-15倍體積的0.2mol/L硼酸鈉(pH8.0-9.5)重懸MN抗原-蛋白G微珠的混合物，留取相當(dāng)于10mL濕蛋白G微珠的樣品，加入足量的二甲基庚二酸酯(固體)至微珠勻漿中，使終濃度為20mmol/L；室溫孵育30min，使結(jié)合在蛋白G微珠上的Mn抗原與蛋白G微珠基質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，并輕輕混勻，留取相當(dāng)于10mL交聯(lián)微珠的樣品，得到Mn抗原-蛋白G微珠交聯(lián)復(fù)合物。(4)用0.1-0.25mol/L乙醇胺(pH8.0)洗滌Mn抗原-蛋白G微珠交聯(lián)復(fù)合物1次以終止交聯(lián)反應(yīng)，然后將其重懸于0.2mol/L乙醇胺溶液中，室溫孵育2h，輕輕混勻，微珠用PBS洗滌后，重懸于PBS，加入硫柳汞保存。(5)將Mn抗原-蛋白G微珠交聯(lián)復(fù)合物轉(zhuǎn)入合適的層析柱中，用PBS沖洗容器，收集殘留的微珠。實(shí)施例3：念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體的免疫親和純化(1)用10-25倍柱床體積的預(yù)洗脫緩沖液洗柱。(2)將初步純化的念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體上樣，按每毫升柱體積大約1mL/h的流速，使樣品流過層析柱，用蠕動泵控制流速。(3)用10-25倍柱床體積的結(jié)合緩沖液洗柱。(4)用10-25倍柱床體積的預(yù)洗脫緩沖液洗柱。(5)采用分段洗脫法，連續(xù)以0.4-0.8倍柱床體積的洗脫緩沖液通過層析柱，分管收集每一組分。(6)檢測每管的抗體含量，將濃度高的各管合并，得到念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體。(7)用10-25倍柱床體積的起始緩沖液流經(jīng)基質(zhì)，使層析柱再生，加入0.01％硫柳汞保存于4℃的環(huán)境中。實(shí)施例4，念珠菌甘露聚糖Mn抗原的多克隆抗體的檢測1.SDS-PAGE電泳檢測對實(shí)施例3制得的多克隆抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對得到的凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。(1)配制濃度8％的SDS-PAGE凝膠，制膠；(2)每孔加10μL實(shí)施例3制得的單克隆抗體樣品；(3)60V恒壓電泳10min后120V恒壓電泳大約1h，至溴酚藍(lán)條帶距膠板下邊緣1cm時(shí)停止電泳；(4)考馬斯亮藍(lán)染色1h；(5)4℃脫色過夜；(6)拍照并觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1(pAb泳道為多克隆抗體，M泳道為蛋白Marker)。由圖中可看出，在25KD和50KD分子量區(qū)有清晰明顯的條帶，說明抗體純度很高。2.效價(jià)測定用間接ELISA法對本發(fā)明實(shí)施例3制得的多克隆抗體的抗體效價(jià)進(jìn)行測定。所用酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，陰性對照為PBS溶液，多克隆抗體分別稀釋16,000、32,000、64,000、128,000、256,000、512,000、1,024,000倍，以抗體溶液的OD值大于陰性對照OD值的2倍為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。檢測結(jié)果見表1和圖2。表1稀釋倍數(shù)OD450空白對照0.0481:5003.3611:10003.2371:50002.5321:100001.5201:500000.8791:1000000.4751:5000000.277從檢測結(jié)果可知，本發(fā)明多克隆抗體效價(jià)很高，大于1:1×105。本說明書上文中結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行了闡釋，但應(yīng)理解，這些描述和闡釋只是為了更好地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本申請說明書之后可對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行必要的改動而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3