本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是菘藍IiAP2/ERF049基因在調(diào)控木脂素類化合物合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

菘藍(Isatis indigotica Fort.)，十字花科一年或兩年生草本，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其根入藥即為常用中藥板藍根，為我國歷代常用抗病毒中草藥?，F(xiàn)代臨床中用于流行性感冒、流行性乙型腦炎、流行性腮腺炎、急慢性肝炎、帶狀皰疹等，在非典型性肺炎(SARS)和甲型H1N1流感病毒的防治中起到了重要作用。本課題組前期通過體外抗病毒實驗明確了以落葉松脂素為代表的木脂素類化合物是菘藍發(fā)揮抗病毒活性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來鐘南山教授課題組也發(fā)現(xiàn)落葉松脂素的衍生物具有顯著的抗甲型和乙型流感病毒的作用。然而落葉松脂素在菘藍根中的含量極少，僅為47.14μg/g，嚴重影響了菘藍作為一個高品質(zhì)中藥的應(yīng)用。因此，從調(diào)控次生代謝的關(guān)鍵基因入手，改善菘藍的種質(zhì)，提高落葉松脂素的含量成為亟待解決的問題。

植物次生代謝工程是利用基因工程和分子生物學(xué)方法闡明植物次生代謝產(chǎn)物生物合成的機制，了解清楚代謝途徑和相關(guān)酶的信息，對控制生物合成路徑的基因進行調(diào)控，從而達到在分子水平上改造代謝途徑，調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物的定向合成。經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)，AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsive factor)家族轉(zhuǎn)錄因子可以顯著調(diào)控擬南芥、琵琶及胡蘿卜的木質(zhì)化程度，同時可以調(diào)控長春花中生物堿類成分，青蒿中萜類成分的合成，對于次生代謝產(chǎn)物的合成具有重要的調(diào)控作用，是木脂素合成的重要調(diào)控靶點。實驗同時以毛狀根為生物反應(yīng)器，具有遺傳特性較為穩(wěn)定、生長速度快、代謝產(chǎn)物含量高等優(yōu)點，有利于研究植物的代謝途徑，同時還可以利用某些基因工程手段探索與創(chuàng)造新的合成路線，得到價值更高的產(chǎn)品，可以節(jié)省藥材栽培土地，減少對農(nóng)田的占用，是生產(chǎn)中藥藥用資源的有效手段。

中國專利文獻CN104805097A公開了菘藍松脂醇還原酶蛋白編碼序列及應(yīng)用，編碼具有菘藍落葉松脂素還原酶活性的蛋白的核苷酸序列，在植物中高表達菘藍落葉松脂素還原酶從而提高落葉松脂素的產(chǎn)量。中國專利文獻CN104805096A公開了菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族編碼序列及應(yīng)用，通過調(diào)控菘藍4-香豆酰輔酶A家族蛋白的表達以改變落葉松脂素的生物合成的方法，在育種和生物能源方面具有重要的應(yīng)用價值。但是關(guān)于菘藍IiAP2/ERF049基因及其在調(diào)控木脂素類化合物合成中的應(yīng)用目前還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種菘藍中木脂素類化合物含量相關(guān)的AP2/ERF家族IiAP2/ERF049轉(zhuǎn)錄因子、編碼該轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列，及其在提高菘藍中落葉松脂素含量中的應(yīng)用。

為了發(fā)掘菘藍當(dāng)中究竟哪些AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子與木脂素的合成密切相關(guān)，本發(fā)明通過對菘藍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，注釋得到112個菘藍AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子。檢測MeJA誘導(dǎo)后不同時間點(0、3、6、12、24h)AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子、落葉松脂素合成途徑基因以及木脂素類化合物含量的變化，以皮爾森相關(guān)系數(shù)0.5為域值(lrl>0.5)，構(gòu)建“轉(zhuǎn)錄因子－基因－化合物”關(guān)聯(lián)性網(wǎng)絡(luò)，篩選獲得與菘藍中木脂素類化合物含量及木脂素合成途徑基因均相關(guān)的AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子IiAP2/ERF049。具體參見實施例1。

本發(fā)明的第一方面，提供一種菘藍IiAP2/ERF049基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述的核苷酸序列為684bp，其中，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。

所述的如SEQ ID NO:1的序列是菘藍IiAP2/ERF049基因組全長DNA的開放閱讀框(ORF)，所述的菘藍IiAP2/ERF049基因組全長DNA序列為1352bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，含有六個外顯子，五個內(nèi)含子。

本發(fā)明的第二方面，提供一種由上述菘藍IiAP2/ERF049基因編碼的蛋白，即IiAP2/ERF049轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，含有227個氨基酸。

本發(fā)明的第三方面，提供一種含有上述菘藍IiAP2/ERF049基因的重組表達載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因植物。

優(yōu)選的，在制備所述的重組表達載體或重組菌時，用于擴增菘藍IiAP2/ERF049基因的引物對為：

正向(F)：5'-ATGGTGAGCTTAAGAAGG-3'(SEQ ID NO:4)

反向(R)：5'-TCAGGTAGAAAGTGTACTGA-3'(SEQ ID NO:5)。

優(yōu)選的，所述的重組表達載體為植物表達載體。優(yōu)選質(zhì)粒pIiAP2/ERF049-OVX。

優(yōu)選的，所述的重組菌，即宿主細胞，為大腸桿菌、農(nóng)桿菌等。優(yōu)選為農(nóng)桿菌。更優(yōu)選發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1。

本發(fā)明的第四方面，提供上述的菘藍IiAP2/ERF049基因在提高菘藍中木脂素類化合物含量中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述的菘藍IiAP2/ERF049基因提高菘藍中落葉松脂素、松脂醇、開環(huán)異落葉松脂素的含量。

本發(fā)明的第五方面，提供上述的IiAP2/ERF049轉(zhuǎn)錄因子在提高菘藍中木脂素類化合物含量中的應(yīng)用。優(yōu)選的，上述的IiAP2/ERF049轉(zhuǎn)錄因子提高菘藍中落葉松脂素、松脂醇、開環(huán)異落葉松脂素的含量。

本發(fā)明的第六方面，提供一種提高菘藍中落葉松脂素含量的方法，包括以下步驟：

A、構(gòu)建含有上述菘藍IiAP2/ERF049基因的重組表達載體；

B、用步驟A構(gòu)建的重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，得到重組菌；

C、步驟B得到的重組菌轉(zhuǎn)化到菘藍組織或細胞中，篩選得到落葉松脂素含量增高的菘藍植株。

優(yōu)選的，所述的提高菘藍中落葉松脂素含量的方法，包括以下步驟：

(1)采用基因克隆的方法獲得菘藍IiAP2/ERF049的cDNA全長；

(2)將IiAP2/ERF049與綠色熒光蛋白標(biāo)簽GFP相連接，檢測IiAP2/ERF049在亞細胞水平的定位；

(3)將IiAP2/ERF049連接于表達調(diào)控序列，形成含有所述基因的植物表達載體，將該植物表達載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1，獲得IiAP2/ERF049的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株；

(4)將(3)所構(gòu)建的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化菘藍葉盤，獲得經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因毛狀根；

(5)陽性株系每9天換一次培養(yǎng)基，測定毛狀根質(zhì)量變化，至45天到達生長平臺期，繪制生長速率曲線；

(6)實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，Q-PCR)檢測菘藍毛狀根中IiAP2/ERF049的表達；

(7)液相色譜-二級質(zhì)譜連用檢測菘藍轉(zhuǎn)基因毛狀根中落葉松脂素及其前體化合物松脂醇，其開環(huán)產(chǎn)物開環(huán)異落葉松脂素的含量，篩選落葉松脂素含量顯著提高的毛狀根株系。

步驟(1)所述的基因克隆方法是指反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，使用的上游引物為：5'-ATGGTGAGCTTAAGAAGG-3'(SEQ ID NO:4)，下游引物為：5'-TCAGGTAGAAAGTGTACTGA-3'(SEQ ID NO:5)。

步驟(2)所述的檢測IiAP2/ERF049在亞細胞水平的定位所用的方法為聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，所用的原生質(zhì)體為水稻原生質(zhì)體。

步驟(4)所述的PCR檢測方法為：分別設(shè)計農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的rolb基因，載體上的潮霉素抗性基因hpt以及插入片段上下游的特異性引物(JDIiAP2/ERF049-F和JDIiAP2/ERF049-R)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察目的條帶，篩選獲得陽性轉(zhuǎn)基因菘藍毛狀根株系。

步驟(6)所述的Q-PCR檢測轉(zhuǎn)基因菘藍毛狀根中IiAP2/ERF049基因的表達方法為：用菘藍管家基因Actin和IiAP2/ERF049基因，進行定量PCR檢測，篩選IiAP2/ERF049基因高表達的轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。

步驟(7)中所述的含量檢測方法為：使用安捷倫1200液相色譜-G6410A三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測毛狀根中化合物含量變化，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(3.5μm,2.1×100mm)，使用乙腈-5mM乙酸銨水溶液梯度洗脫，程序為：0-4分鐘乙腈體積由14％增加至50％，5mM乙酸銨水溶液體積由86％降至50％；4-4.5分鐘乙腈體積由50％增加至85％，5mM乙酸銨水溶液體積由50％降至15％；4.5-8.5分鐘乙腈體積保持85％，5mM乙酸銨水溶液體積保持15％。其中落葉松脂素的母離子峰和子離子峰分別為359.2和329.0；松脂醇為357.1和151.1；開環(huán)落葉松脂素為361.1和164.6。柱溫為30℃，流速0.3mL/分鐘，進樣量5μL，使用兩點法計算毛狀根中三種化合物含量，計算公式為A₀/C₀＝A_x/C_x，其中A₀和C₀分別為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積和濃度，A_x和C_x分別為樣品溶液的峰面積和濃度。

本發(fā)明將菘藍IiAP2/ERF049轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入菘藍，篩選獲得落葉松脂素顯著提高的轉(zhuǎn)基因菘藍毛狀根。生長45天到達生長平臺期時，轉(zhuǎn)基因毛狀根生物積累量與野生型毛狀根生物積累量無顯著性差異，然而轉(zhuǎn)基因毛狀根中落葉松脂素含量顯著增加，其中含量變化最明顯的株系中落葉松脂素含量為424.60μg/g，與野生型對照(51.13μg/g)相比約提高了8.30倍。

本發(fā)明通過構(gòu)建IiAP2/ERF049的過量表達載體，將關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子IiAP2/ERF049遺傳轉(zhuǎn)化菘藍，打破落葉松脂素合成的瓶頸，獲得高產(chǎn)的菘藍毛狀根株系，為提高落葉松脂素的產(chǎn)量提供了高效調(diào)控靶點，在提高落葉松脂素含量，緩解落葉松脂素供應(yīng)緊缺，降低中藥提取中的成本，減少污染，培育優(yōu)良菘藍品系等方面具有巨大的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1篩選獲得與落葉松脂素合成相關(guān)的菘藍AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子。

圖2 IiAP2/ERF049基因的結(jié)構(gòu)域示意圖。

圖3 IiAP2/ERF049蛋白特異的定位在細胞的細胞核，其中A-D為IiAP2/ERF049-GFP蛋白特異表達在細胞核，E-H為空白GFP蛋白表達在細胞質(zhì)，A、E顯示GFP的綠光，B、F為葉綠體的紅光，C、G為綠光和紅光合并在一起，D、H是綠光、紅光、白光合并在一起。

圖4 IiAP2/ERF049轉(zhuǎn)錄因子在菘藍中過表達的植物表達載體pIiAP2/ERF049-OVX的構(gòu)建示意圖。

圖5轉(zhuǎn)基因毛狀根生物量累積。

圖6陽性毛狀根株系PCR鑒定結(jié)果。

圖7轉(zhuǎn)基因毛狀根中IiAP2/ERF049的轉(zhuǎn)錄水平。

圖8菘藍中過表達IiAP2/ERF049基因可以使落葉松脂素含量增高，其中A為松脂醇含量，B為落葉松脂素含量，C為開環(huán)異落葉松脂素含量。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻方法制備。下列實施例中的引物和測序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克?。簩嶒炇抑改稀?New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

實施例1：菘藍AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的篩選

分別從擬南芥數(shù)據(jù)庫(DATF,http://datf.cbi.pku.edu.cn/)和大白菜數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/)下載獲得擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子159個(Arabidopsis thaliana AP2/ERFs，AtAP2/ERFs)和大白菜AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子321個(Chinese cabbage AP2/ERFs，BraAP2/ERFs)，根據(jù)其氨基酸序列建立十字花科植物AP2/ERF數(shù)據(jù)庫。運用TBLASTN算法將該數(shù)據(jù)庫與菘藍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行比對(e-value值設(shè)為10^-5)，識別并提取菘藍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中與十字花科植物AP2/ERF同源的基因作為菘藍AP2/ERF候選基因。

應(yīng)用生物信息學(xué)軟件Vector NTI 11.5和MEGA 5.05分析上述獲得的菘藍AP2/ERF候選基因的核苷酸序列，提取開放閱讀框(open reading frame，ORF)，并翻譯成氨基酸序列。應(yīng)用Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.janelia.org/)和SMART分析工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)對所獲氨基酸的AP2/ERF功能結(jié)構(gòu)域進行識別，最終確定菘藍AP2/ERF編碼基因(IiAP2/ERFs)共112個。

根據(jù)菘藍AP2/ERF編碼基因的注釋，從課題組前期建立的MeJA(0.5μM)處理后不同時間點(0、1、3、6、12和24h)菘藍毛狀根的基因表達譜數(shù)據(jù)庫中，提取MeJA(0.5μM)處理下不同時間點菘藍毛狀根中AP2/ERF編碼基因表達信息及木脂素類化合物合成途徑基因表達量信息(設(shè)0h的表達水平為1作為參照)。同時采用實施例7中的方法測定MeJA(0.5μM)處理后不同時間點(0、1、3、6、12和24h)菘藍毛狀根中松脂醇、松柏苷、落葉松質(zhì)素、開環(huán)異落葉松質(zhì)素四種木脂素類化合物含量變化。

運用SPSS軟件中典型相關(guān)分析(canonical correlation analysis)方法，將MeJA誘導(dǎo)作用下不同時間點(0、3、6、12、24h)112個AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子表達水平的變化與LC-MS/MS測定得到的MeJA誘導(dǎo)作用下不同時間點木脂素(松脂醇、松柏苷、落葉松質(zhì)素、開環(huán)異落葉松質(zhì)素)含量變化進行整合，構(gòu)建“轉(zhuǎn)錄因子-化合物”關(guān)聯(lián)性網(wǎng)絡(luò)；使用相同的方法將MeJA誘導(dǎo)作用下不同時間點(0、3、6、12、24h)112個AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子表達水平的變化與MeJA誘導(dǎo)作用下不同時間點木脂素類化合物合成途徑基因表達量變化進行整合，構(gòu)建“轉(zhuǎn)錄因子-基因”關(guān)聯(lián)性網(wǎng)絡(luò)。以皮爾森相關(guān)系數(shù)0.5為域值(lrl>0.5)，分別篩選獲得與落葉松質(zhì)素合成密切相關(guān)的AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子，與途徑基因表達密切相關(guān)的AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子，將兩組篩選得到的轉(zhuǎn)錄因子相比較，重合者即為與木脂素合成途徑基因表達及木脂素合成均顯著相關(guān)的AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子，篩選結(jié)果見圖1。由圖1可知，049號AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子IiAP2/ERF049與木脂素類化合物合成及木脂素合成途徑基因的表達均密切相關(guān)(AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子可進一步分為AP2、DREB、ERF、RAV、Soloist五個亞家族)。

實施例2：菘藍IiAP2/ERF049基因的克隆

1.菘藍DNA和總RNA的提取

取菘藍無菌苗約100mg，液氮中迅速研磨成粉末，使用CTAB法提取菘藍DNA；另取菘藍無菌苗約100mg，液氮中迅速研磨成粉末，加入預(yù)先裝有植物組織裂解液的1.5ml離心管中，充分振蕩混勻，然后按照TIANGEN TRNzol-A⁺總RNA提取試劑盒的說明書提取菘藍總RNA。使用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA和總RNA質(zhì)量，用Nano drop 2000C分光光度計(Thermo Scientific,San Jose,California,USA)檢測DNA和總RNA純度和濃度；

2.菘藍IiAP2/ERF049基因的克隆

以所提取的總RNA 1μg為模板，使用全式金TansScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix試劑盒合成菘藍cDNA。

根據(jù)IiAP2/ERF049基因的開放閱讀框設(shè)計基因特異性引物：

正向(F)：5'-ATGGTGAGCTTAAGAAGG-3'(SEQ ID NO:4)

反向(R)：5'-TCAGGTAGAAAGTGTACTGA-3'(SEQ ID NO:5)。

使用Trans Start Fast^@Pfu DNA Polymerase試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)體系及條件如下：模板(cDNA)1μL，正反引物各1μL，EasyPfu DNA Polymerase1μL，10×EasyPfu Buffer 5μL，2.5mM dNTPs 2.5μL，5×PCR buffer 5μL，去離子水13.5μL，構(gòu)成25μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性1分鐘，35個擴增循環(huán)(94℃變性20秒，45℃退火20秒，72℃延伸1分鐘)，72℃繼續(xù)延伸5分鐘。

獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)片段膠回收后與pGEMT-easy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，過夜培養(yǎng)后，挑單克隆，菌檢后送測序(由蘇州金唯智生物科技有限公司完成)，測序結(jié)果與菘藍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中IiAP2/ERF049序列一致的即為成功克隆得到的菘藍IiAP2/ERF049的開放閱讀框(ORF)(SEQ ID NO:1)。其中，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。

另外以菘藍DNA為模板，擴增菘藍AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子IiAP2/ERF049的基因組DNA(SEQ ID NO:2)，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同上，只是反應(yīng)中延伸時間設(shè)為3分鐘。

IiAP2/ERF049的基因組DNA為1352bp，開放閱讀框為684bp，將IiAP2/ERF049的基因組DNA與開放閱讀框相比較，發(fā)現(xiàn)IiAP2/ERF049的基因組DNA含有六個外顯子，五個內(nèi)含子。NCBI的ORF finder功能推導(dǎo)出其蛋白編碼序列(SEQ ID NO:3)，采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)軟件，預(yù)測出IiAP2/ERF049蛋白包含一個AP2結(jié)構(gòu)域(121-178氨基酸)，是一個AP2/ERF類的轉(zhuǎn)錄因子，共包含227個氨基酸(如圖2所示)。

實施例3：菘藍IiAP2/ERF049基因的亞細胞定位分析

根據(jù)實例2生物信息學(xué)分析的內(nèi)容可知，IiAP2/ERF049基因是具有一個AP2結(jié)構(gòu)域的AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子。為進一步驗證IiAP2/ERF049基因作為轉(zhuǎn)錄因子的性質(zhì)，我們構(gòu)建了IiAP2/ERF049基因的亞細胞定位載體，通過轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，證實IiAP2/ERF049定位于細胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子的特性。

1.亞細胞定位載體的構(gòu)建

在本實施例中，根據(jù)pCAMBIA1301-GFP載體序列及IiAP2/ERF049基因ORF區(qū)序列，設(shè)計帶有酶切位點的引物，其中正向引物含有Nco I酶切位點(5'-AACCATGGGAATGGTGAGCTTAAGAAGG-3'，SEQ ID NO:6)，反向引物含有Spe I酶切位點(5'-GGACTAGTGGTAGAAAGTGTACTGATCT-3'，SEQ ID NO:7)。PCR獲得含有Nco I和Spe I酶切位點的IiAP2/ERF049編碼區(qū)，分別使用Nco I和Spe I酶切IiAP2/ERF049編碼區(qū)和pCAMBIA1301-GFP載體，回收IiAP2/ERF049基因和pCAMBIA1301-GFP大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單菌落送測序，最終獲得測序正確的IiAP2/ERF049基因亞細胞定位載體。

2.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及觀察

按照QENGEN質(zhì)粒大提試劑盒的操作說明，提取獲得純度和濃度較高的IiAP2/ERF049基因亞細胞定位載體質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體。具體方法參照PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法。以相同條件下轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-GFP空載體的原生質(zhì)體作為陰性對照。

轉(zhuǎn)化完成的水稻原生質(zhì)體，室溫25℃培養(yǎng)18小時后用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)IiAP2/ERF049特異地定位在細胞核中，與轉(zhuǎn)錄因子的功能相一致(如圖3所示)。

實施例4：菘藍IiAP2/ERF049基因的植物過表達雙元載體的構(gòu)建

在本實施例中，以含IiAP2/ERF049的菌液為模板，設(shè)計帶酶切位點的正向引物：5'-AAGGATCCATGGTGAGCTTAAGAAGG-3'(SEQ ID NO:8，含Bam HI酶切位點)和反向引物：5'-CCACTAGTGGTAGAAAGTGTACTGA-3'(SEQ ID NO:9，含Spe I酶切位點)。使用NEB Phusion^@超保真PCR MasterMix進行PCR擴增，獲得帶有酶切位點的目的基因，酶切后將其插入PHB-flag表達載體，轉(zhuǎn)化后挑取單菌落送測序，最終獲得測序正確的IiAP2/ERF049過表達雙元載體(如圖4所示)。

實施例5：發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的IiAP2/ERF049過表達載體遺傳轉(zhuǎn)化菘藍葉片及轉(zhuǎn)基因毛狀根的獲得

1.IiAP2/ERF049過表達載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌

在該實施例中，將實施例4中獲得的IiAP2/ERF049植物雙元過表達載體，采用凍融法轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1中，PCR鑒定陽性的菌株即為成功轉(zhuǎn)入過表達載體的發(fā)根農(nóng)桿菌(C58C1-pIiAP2/ERF049-OVX)。

2.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)IiAP2/ERF049基因葉盤法轉(zhuǎn)化

2.1 葉盤法轉(zhuǎn)化步驟如下：

a.用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽性菌落，接種于2ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)過夜；

b.將C58C1空菌以及C58C1-PHB-flag、C58C1-pIiAP2/ERF049-OVX的菌液活化兩次，每次取20μL加入2mL YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)過夜。其中C58C1空菌使用YEB(40mg/L利福平)的培養(yǎng)基，其他菌株使用YEB(40mg/L利福平+75mg/L卡那霉素)的培養(yǎng)基；

c.取30mL YEB培養(yǎng)基，加入1mL活化好的農(nóng)桿菌，28℃，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)過夜；

d.5,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，用20mL含100μM乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體；

e.取菘藍無菌苗，超凈臺中將葉片剪成約1cm²大小，浸入重懸好的菌體中，28℃，200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)10分鐘；

f.將葉盤取出，使用無菌濾紙將葉盤上面的菌液吸干，正面向上放于MS培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中(25土1)℃暗培養(yǎng)2天。

g.葉盤暗培養(yǎng)兩天后取出，超凈臺中使用無菌水沖洗五次，無菌濾紙吸干，置于1/2MS(500mg/L頭孢霉素)培養(yǎng)基上，于(25土1)℃暗培養(yǎng)；

h.約兩周后，葉盤邊緣長出毛狀根，待發(fā)根長至3-5cm時小心剪下，每隔15d繼代一次，并不斷降低頭孢霉素濃度(300mg/L→100mg/L→0mg/L)，除了C58C1空菌誘導(dǎo)出的毛狀根，其他組在1/2MS+頭孢霉素基礎(chǔ)上另外添加10mg/L潮霉素，篩選陽性克隆，繼續(xù)(25土1)℃暗培養(yǎng)；

i.待頭孢霉素濃度降為0mg/L時，繼續(xù)培養(yǎng)約兩周，挑選生長狀態(tài)良好，分支較多的株系進行編號，C58C1空菌誘導(dǎo)出的為野生型毛狀根，編號為：WT1、WT2、WT3……；C58C1-PHB-flag誘導(dǎo)出的為空白毛狀根，編號為：CK-1、CK-2、CK-3……；C58C1-pIiAP2/ERF049-OVX誘導(dǎo)出的為轉(zhuǎn)基因毛狀根，分別編號為：OVX049-1、OVX049-2、OVX049-3……

j.經(jīng)PCR確認陽性的發(fā)根株系，取100mg轉(zhuǎn)入200mL1/2MS液體培養(yǎng)基中，置于搖瓶柜中，120轉(zhuǎn)/分鐘，25℃暗培養(yǎng)，每隔9天換一次培養(yǎng)液并記錄發(fā)根生長量變化，至45天收獲。如圖5所示，以濕重變化為縱坐標(biāo)，以生長時間為橫坐標(biāo)作圖。毛狀根在18d后生長迅速，36d時進入生長平臺期，45d時生物量雖略有升高，但變化不明顯，與野生型毛狀根和空白毛狀根相比，過量表達IiAP2/ERF049的轉(zhuǎn)基因毛狀根生物量積累無顯著性變化。

所述的YEB培養(yǎng)基為：分別取酵母提取物1g/L、蛋白胨5g/L、牛肉浸膏5g/L、蔗糖5g/L、硫酸鎂七水0.24g/L，pH＝7.2，若配制固體培養(yǎng)基，加入7g瓊脂即可。121℃高溫高壓滅菌20分鐘，備用。

所述的MS培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖(30g/L)+瓊脂(6g/L)，pH5.8-6.0，121℃高溫高壓滅菌20分鐘，備用。其中MS培養(yǎng)基購自Phyto Technology Laboratories(美國)。

所述的液體培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖，pH5.8-6.0。

2.2陽性毛狀根鑒定方法如下：發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中含有Ri質(zhì)粒，其上的rolb和rolc基因能夠誘發(fā)并維持發(fā)根形態(tài)，選取rolb基因來檢測所得為毛狀根，而非不定根。PHB-flag載體具有潮霉素抗性基因(hpt)，利用hpt基因以及載體特異性引物(JDPDK)對IiAP2/ERF049轉(zhuǎn)基因發(fā)根進行分子鑒定，C58C1-PHB-flag、C58C1-pIiAP2/ERF049-OVX菌液作為陽性對照。

根據(jù)實施例2所使用的CTAB法提取總DNA，以總DNA為模板進行PCR鑒定，所用引物序列如下：

rolb基因擴增引物為：

rolb-F:5'-CGAGGGGATCCGATTTGCTT-3'(SEQ ID NO:10)

rolb-R:5'-GACGCCCTCCTCGCCTTCCT-3'(SEQ ID NO:11)

hpt基因擴增引物為：

hpt-F:5'-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3'(SEQ ID NO:12)

hpt-R:5'-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3'(SEQ ID NO:13)

JDIiAP2/ERF049基因擴增引物為：

JDIiAP2/ERF049-F：5'-CTCAAGCAAGGATCCATGGTGA-3'(SEQ ID NO:14)

JDIiAP2/ERF049-R：5'-CGATACCGTCACTAGTGGTAGAA-3'(SEQ ID NO:15)

使用Takara rTaq酶進行PCR擴增，反應(yīng)體系及條件如下：模板(DNA)1μL，正反引物各1μL，2×rTaq PCR SuperMix 10μL，去離子水7μL，共20μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘，35個擴增循環(huán)(94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘)，72℃繼續(xù)延伸5分鐘。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠檢測PCR結(jié)果，其中rolb和hpt基因可分別擴增出423bp和812bp大小的特異性片段，使用PHB-flag載體上引物JDIiAP2/ERF049-F和JDIiAP2/ERF049-R擴增出來的序列與IiAP2/ERF049長度大小相等，故成功導(dǎo)入pIiAP2/ERF049-OVX的毛狀根株系可以檢測到約897bp的片段。

紫外燈下觀察到與rolB、hpt基因及JDIiAP2/ERF049大小一致的條帶，結(jié)果如圖6所示，表明篩選獲得的是由C58C1發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的含目的基因IiAP2/ERF049的毛狀根。

實施例6：轉(zhuǎn)基因毛狀根中IiAP2/ERF049轉(zhuǎn)錄水平檢測

在本實施例中，根據(jù)實施例2所使用的總RNA提取方法，提取實施例5中不同IiAP2/ERF049基因過表達轉(zhuǎn)基因菘藍毛狀根的RNA，并進一步反轉(zhuǎn)率為cDNA。通過primer 3設(shè)計IiAP2/ERF049基因和Actin內(nèi)參基因跨內(nèi)含子的實時定量PCR引物(表1)，使用TAKARA SYBR-Green PCR Mastermix試劑盒進行實時熒光定量PCR分析。儀器為Thermal Cycler Dice，兩步法進行PCR擴增，95℃預(yù)變性10秒，40個擴增循環(huán)(95℃5秒；60℃30秒)，分離反應(yīng)(95℃15秒；60℃30秒；95℃15秒)。使用2^-ΔΔCt法進行后期數(shù)據(jù)處理，結(jié)果如圖7所示，計算公式如下：

目的基因表達量＝2^-ΔΔCt

ΔΔCt＝(C_{t目的基因}-C_{t內(nèi)參基因})_實驗組-(C_{t目的基因}-C_{t內(nèi)參基因})_對照

表1 實時定量PCR引物序列

實施例7：利用LC-MS/MS測定轉(zhuǎn)基因毛狀根中落葉松脂素、松脂醇、開環(huán)異落葉松脂素含量

1.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取落葉松脂素、松脂醇、開環(huán)異落葉松脂素標(biāo)準(zhǔn)品2mg，加入2mL甲醇溶解，配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用；隨機抽測5個樣本，根據(jù)5個樣本中三種成分的平均濃度來確定混合標(biāo)準(zhǔn)品中各組分濃度。最終確定混合標(biāo)準(zhǔn)品中各組分濃度分別為：落葉松脂素300ng/mL、松脂醇100ng/mL、開環(huán)異落葉松脂素100ng/mL。

2.樣品溶液的制備

收獲的毛狀根樣品于45℃干燥箱中過夜烘干，研缽中充分研磨。稱取100mg粉末樣品放入10mL離心管中，加入5mL甲醇，振蕩混勻后超聲(40W)提取30分鐘，期間每隔5分鐘振蕩混勻一次；4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，傾出上清于一干凈管中，重復(fù)以上操作一次。合并兩次提取液，使用容量瓶定容到10mL。取1mL提取液真空揮干，每個樣品管中加入500μL初始流動相，渦旋1分鐘溶解樣品，14,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，上清液用0.22μm有機濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣。

3.質(zhì)譜檢測條件

質(zhì)譜采用電噴霧離子源，陰離子模式，噴霧器氣體壓力40psi，氣體溫度350℃，氣體流速10升/分鐘，毛細管電壓4000V，質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 優(yōu)化的質(zhì)譜條件

4.色譜分離條件

使用Agilent ZORBAX SB-C18(3.5μm,2.1×100mm)色譜柱，乙腈-5mM乙酸銨水溶液梯度洗脫，洗脫程序如表3所示，柱溫35℃，流速0.3毫升/分鐘，進樣量5μL，單針運行8.5分鐘。

表3 梯度洗脫程序

5.樣品的測定和計算

使用兩點法計算毛狀根中松脂醇、落葉松脂素、開環(huán)異落葉松脂素含量，計算公式為A₀/C₀＝A_x/C_x。其中A₀和C₀分別為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積和濃度，A_x和C_x分別為樣品溶液的峰面積和濃度。

在本發(fā)明中，IiAP2/ERF049基因過表達毛狀根中松脂醇、落葉松脂素、開環(huán)異落葉松脂素的含量均提高(如圖8所示)。與野生型相比，過表達IiAP2/ERF049基因的轉(zhuǎn)基因毛狀根中落葉松脂素含量為野生型的4.39-8.30倍，松脂醇含量為野生型的1.50-3.42倍，開環(huán)異落葉松脂素含量為野生型的5.75-10.57倍。結(jié)果為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計分析采用t-test檢驗。

總之，本發(fā)明通過在菘藍中過量表達IiAP2/ERF049轉(zhuǎn)錄因子，獲得了大量產(chǎn)生落葉松脂素的毛狀根株系，在緩解落葉松脂素供應(yīng)緊缺，降低中藥提取中的成本，減少污染，培育優(yōu)良菘藍品系等方面具有巨大的應(yīng)用前景。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。