本發(fā)明涉及一種腦海綿狀血管瘤突變基因及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

腦海綿狀血管瘤(Cerebral Cavernous Malformations，CCM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱匿性血管畸形的一種，臨床上分為家族性和散發(fā)性兩大類，目前統(tǒng)計人群發(fā)病率約為0.5％，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管畸形的10—20％，其中家族性腦海綿狀血管瘤約50％。該病的主要臨床表現(xiàn)為癲癇(占37-—50％)、腦出血(占20—40％)、非特異性反復頭痛(占10—30％)和局灶性中樞神經(jīng)功能缺損癥狀(占35—40％)。約9％的患者在10歲前發(fā)病，60—70％的患者發(fā)病年齡在10—40歲間，有19％左右的患者在40歲后發(fā)病，而25％有腦海綿狀血管瘤的個體終生無癥狀，此類患者大多數(shù)在因其他疾病做頭部影像學檢查及尸體解剖時發(fā)現(xiàn)。

腦海綿狀血管瘤患者臨床特點多樣而且無特異性，因此CT(Computed Tomography,計算機斷層掃描)和MRI(Magnetic Resonance Imaging,磁共振成像)為術(shù)前診斷的主要方法，術(shù)后的病理檢查為金標準。該病CT平掃特征性表現(xiàn)為腦實質(zhì)中邊界清楚的圓形或不規(guī)則形高密度或混雜密度灶，增強后70％-94％的病變可有輕、中度增強，典型表現(xiàn)為不均勻的斑點狀增強，但是灶周水腫一般不明顯。磁共振掃描檢查對CCM的診斷具有較高的特異性：在T2WI序列表現(xiàn)混雜信號,周圍可有一均勻的低信號環(huán)；在T1WI序列多表現(xiàn)為均勻的低或等信號影。病灶周圍無明顯水腫，增強掃描無明顯強化效應,無血管流空效應，多數(shù)臨床醫(yī)師認為上述特征性的表現(xiàn)是診斷顱內(nèi)腦海綿狀血管瘤的主要依據(jù)，一般DSA檢查腦海綿狀血管瘤呈陰性，故又稱隱匿性血管畸形。腦海綿狀血管瘤是由不規(guī)則的、大小不等的血管腔隙聚集成一堆的血管組織，其管壁僅為一層扁平血管內(nèi)皮細胞和少量成纖維細胞，無成形的血管壁，病灶內(nèi)無神經(jīng)組織，其病理結(jié)構(gòu)類是于肝竇結(jié)構(gòu)，剖面呈海綿狀或蜂窩狀。術(shù)后的病理檢查仍是CCM診斷的金標準。

臨床上腦海綿狀血管瘤分為家族性腦海綿狀血管瘤和散發(fā)性腦海綿狀血管瘤。家族性腦海綿狀血管瘤多發(fā)病灶常見，散發(fā)性腦海綿狀血管瘤多為單發(fā)病灶。家族性腦海綿狀血管瘤呈常染色體不完全顯性遺傳，目前被已明確并克隆的致病基因有CCM1(KRIT1,7q11.2-q21),CCM2(MGC4607,7p15-p13)和CCM3(PDCD10,3q26.1)。雖然散發(fā)性腦海綿狀血管瘤無遺傳性，但國外也相繼有新發(fā)現(xiàn)突變位點的報導。更值得注意的是，目前大多 數(shù)研究者認為散發(fā)性多發(fā)病灶腦海綿狀血管可能是遺傳性病例，來自無癥狀父母。

CCM1基因含有20個外顯子，其中外顯子4到外顯子19共16個外顯子編碼合成含有736個氨基酸的Krit1蛋白，因此又稱之為KRIT1基因。1982年Hayman等對一個龐大的墨西哥家系進行遺傳學研究,證實該病呈常染色體顯性遺傳后，1995年Dubovsky等對一西班牙裔人腦海綿狀血管瘤大家系采用連鎖分析和短串聯(lián)重復序列多態(tài)性的方法將CCM1定位到7q11-q22。Gunel等也用連鎖分析方法將致病基因CCM1更精細地定位到7q11.2-q21，發(fā)現(xiàn)CCM1基因5’端存在8個新的外顯子,使得CCM1的完整基因充分被人們所認識。

CCM2基因表達的蛋白產(chǎn)物為MGC4607，所以稱為MGC4607基因，被Denier等在2004年對30個無CCM1基因突變的腦海綿狀血管瘤家系進行遺傳連鎖分析，而確定在7p15-p13上，含有10個外顯子，編碼含有444個氨基酸的MGC460蛋白。

2005年Bergametti等^[14]對無CCM1和CCM2突變的20個腦海綿狀血管瘤家用18個基因微衛(wèi)星標記，將CCM3基因位置逐步確定在3q25.2-27，確定CCM3基因就是PCD10基因，含有10個外顯子，其中有七個外顯子編碼形成含有222個氨基酸的PDCD10蛋白。

到目前為止已發(fā)現(xiàn)報導了110余個CCM1突變位點，近40個CCM2突變位點，約60個CCM3突變位點(本文所附綜述中有詳細介紹)。迄今的報道，僅歐美國家有較大樣本量的研究，其他地區(qū)，比如我國、日本，對腦海綿狀血管瘤遺傳基因報道多僅是在個別家系發(fā)現(xiàn)了新的突變位點。目前國內(nèi)研究僅報道了CCM1基因上8個突變位點，尚無CCM2、CCM3基因突變的報道。

目前我國對腦海綿狀血管瘤基因突變方向的研究較少，多發(fā)性腦海綿狀血管瘤尤其彌漫性較少見，而較多研究發(fā)現(xiàn)散發(fā)性多發(fā)性腦海綿狀血管瘤其實也是遺傳病例，而也有散發(fā)單發(fā)病灶病例為來自無癥狀父母的遺傳病例。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人通過調(diào)查病例資料和電話隨訪，收集了2011年-2015年在我院神經(jīng)內(nèi)外科住院的漢族腦海綿狀血管瘤患者78例，男性43例，女性35例。發(fā)病年齡在2-77歲，平均發(fā)病年齡45.73±17.45歲。多發(fā)病灶3例，單發(fā)病灶75例。所有病例經(jīng)神經(jīng)內(nèi)外科及影像科3位副主任或者主任醫(yī)師診斷，符合周良輔主編第二版《中國現(xiàn)代神經(jīng)外科學》腦海綿狀血管瘤的診斷標準，均具有典型臨床癥狀和影像學特征，其中經(jīng)術(shù)后病理證實28例。通過詳系調(diào)查患者家屬的所有就診經(jīng)歷、免費MRI檢查和測序分析，本研究采 集血樣的22例患者證實均是散發(fā)性腦海綿狀血管瘤。通過詳系調(diào)查患者家屬的所有就診經(jīng)歷，其余56例患者也基本明確為是散發(fā)性腦海綿狀血管瘤。

抽取22例(3例多發(fā)病灶，19例單發(fā)病灶)病人和9位可疑家屬的外周血3-4ml，放置EDTAK2(或EDTANa4)抗凝管中，均放置在-80℃超低溫冰箱保存。選取100位健康人群作為對照組，經(jīng)知情同意后抽取外周血3-4ml，同樣方法保存。樣本送至華大基因科技有限公司武漢分公司進行CCM1、CCM2和CCM3基因全場測序。

測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多發(fā)病病灶病例S29檢測到的CCM1基因c.1784delC，導致框移突變，導致KRIT1蛋白在595位氨基酸開始出現(xiàn)錯位，并提前出現(xiàn)終止密碼，KRIT1蛋白功能缺失。在100位對照組中沒有檢測CCM1基因c.1784delC，變該變異位點在突變數(shù)據(jù)庫及SNP數(shù)據(jù)庫都沒有收錄，既往也無文獻報道，該突變基因序列如SEQ ID NO.1所示，即為本發(fā)明所述的腦海綿狀血管瘤突變基因，該突變基因可用作檢測腦海綿狀血管瘤的生物標志物，還可以用于制備檢測腦海綿狀血管瘤試劑、試劑盒或生物芯片等。同時，本發(fā)明提供了一種檢測腦海綿狀血管瘤的試劑盒，所述試劑盒中包括如下引物對：上游引物：5’-GCCCGGCCAGTAAAATGTTT-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物：5’-TTGAATGAAGCAGGGAACGG-3’(SEQ ID NO.2)，該引物對即是檢測所述突變基因的引物對。另外，本發(fā)明還對該突變基因進行了SNP驗證：收集100例健康人的血樣標本，提取全基因組DNA。然后對CCM1基因13號外顯子進行測序分析，發(fā)現(xiàn)100例健康人種均沒有發(fā)現(xiàn)c.1784delC突變，因此認定該突變不是單核苷酸多態(tài)性(SNP)。

附圖說明

圖1為KRIT1基因c.1784delC突變測序圖，圖中：突變測序結(jié)果及正常對照結(jié)果(箭頭示突變位點)；

具體實施方式

對多發(fā)病病灶病例S29號標本進行CCM1、CCM2和CCM3基因全場測序，檢測到的CCM1基因c.1784delC(圖1)，檢測CCM1基因c.1784delC的引物對為：

5’-GCCCGGCCAGTAAAATGTTT-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物：

5’-TTGAATGAAGCAGGGAACGG-3’(SEQ ID NO.2)，導致框移突變，導致KRIT1蛋白在595位氨基酸開始出現(xiàn)錯位，并提前出現(xiàn)終止密碼，KRIT1蛋白功能缺失。在100位對照組中沒有檢測CCM1基因c.1784delC，變該變異位點在突變數(shù)據(jù)庫及SNP數(shù)據(jù)庫都沒有收錄，既往也無文獻報道。