本發(fā)明涉及一類熒光核苷的合成方法，具體涉及一種用于細(xì)胞成像的熒光核苷及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近些年來，由于各種原因，心腦血管疾病的發(fā)病率越來越高，且逐漸年輕化。心腦血管疾病具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高,并發(fā)癥多”等特點(diǎn)。目前，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬人，居各種死因首位。血黏度升高，導(dǎo)致人體新陳代謝速度減慢，血液流速會(huì)減慢，造成心腦供血不足進(jìn)而引發(fā)冠心病、高血壓、腦血栓等心腦血管疾病。所以建立一種簡便的、快捷的、高效的、靈敏的血液黏度檢測技術(shù)是預(yù)防和檢測心腦血管疾病的一項(xiàng)重要的工作。對于宏觀的大體積的黏稠流體的黏度測試方法是利用黏度計(jì)。但是，對于微環(huán)境(尤其是細(xì)胞內(nèi)或生物組織內(nèi)的黏度，利用黏度儀是不能實(shí)現(xiàn)其黏度的測定。目前，已經(jīng)報(bào)道的年度轉(zhuǎn)子主要有：熒光強(qiáng)度黏度轉(zhuǎn)子、比例熒光黏度轉(zhuǎn)子、熒光壽命年度轉(zhuǎn)子、熒光比例和壽命雙模式黏度轉(zhuǎn)子。然而，這些轉(zhuǎn)子都不能在網(wǎng)織紅細(xì)胞甚至紅細(xì)胞內(nèi)成像和檢測黏度。

隨著雙光子技術(shù)的發(fā)展，雙光子激光共聚焦顯微成像在生命科學(xué)的研究中已經(jīng)成為最重要的成像技術(shù)。與傳統(tǒng)的單光子激光共聚焦顯微成像相比，激光共聚焦顯微成像具有明顯優(yōu)勢，包括近紅外激發(fā)、暗場成像、避免熒光漂白和光致毒、定靶激發(fā)、高橫向分辨率與縱向分辨率、降低生物組織吸光系數(shù)及降低組織自發(fā)熒光干擾等(Helmchen F,Svoboda K,Denk W et al.Nature 1999,2,989-996.Zhang,H.；Fan,J.L.；Wang,J.Y.；Zhang,S.Z.；Dou,B.R.；Peng,X.J.J.Am.Chem.Soc.2013,135,11663-11669.Zhang,H.；Fan,J.L.；Wang,K.；Li,J.；Wang,C.X.；Nie,Y.M.；Jiang,T.；Mu,H.Y.；Peng,X.J.；Jiang,K.Anal.Chem.2014,86,9131-9138)，因此雙光子顯微成像技術(shù)使生物成像研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。而對網(wǎng)織紅細(xì)胞成像及其黏度變化的檢測的專一性多模式成像的熒光核苷還尚未有人報(bào)道，開發(fā)專一性好的篩選網(wǎng)織紅細(xì)胞及檢測其粘度變化的熒光核苷是一個(gè)開創(chuàng)性的工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于細(xì)胞成像的熒光核苷及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種用于細(xì)胞成像的熒光核苷，所述熒光核苷具有通式I結(jié)構(gòu)：

其中：

B選自dA、dG、dC、dT或dU，其中R⁷獨(dú)立選自烷基鏈、-H、-TBDMS、-Boc、-Ac或-DMTr；

R¹選自-Ph、-Ph(CH₃)_n、-Ph(CH₂CH₃)_n、-Ph((OCH₂CH₂)_nOCH₃)_m、-Ph((OCH₂CH₂CH₂)_nOCH₃)_m,-Ph((OCH₂CH₂CH₂)_nOCH₃)₂或-PhN((OCH₂CH₂CH₂)_nOCH₃)₂,其中n選自1-8的整數(shù)；m選擇1-3的整數(shù)；

R²、R³、R⁴、R⁵各自獨(dú)立地選自-CH₃或-(CH₂)_nCH₃，其中n選自1-8的整數(shù)；

R⁶獨(dú)立地選自-N(CH₃)₂或-N(CH₂)_nCH₃，其中n選自1-8的整數(shù)；

，其中n選自1-3的整數(shù)；

L選自烷基鏈、-Ph-、-CH₂-(CH＝CH)_n-(C≡C)_m-CH₂-、-(CH₂)_nCH＝CH(CH₂)_n-或-(CH₂)_nC≡C(CH₂)_n-,其中n，m獨(dú)立選自0-4的整數(shù)。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)包括：

所述的熒光核苷，選自下列化合物：

本發(fā)明的另一目的在于提供了一種制備上述的熒光核苷的方法，包括以下步驟：

)化合物a與三甲基硅基乙炔按照摩爾比1:1-1:6反應(yīng)，制備化合物b:

反應(yīng)溫度為0-50℃，Pd、Cu和胺同時(shí)催化，反應(yīng)時(shí)間為6-24小時(shí)，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、乙醚或二惡烷中的至少一種；

2)化合物b與四丁基氟化銨按照摩爾比1:0.8-1:4反應(yīng)，制備化合物c：

反應(yīng)溫度為0-50℃，反應(yīng)時(shí)間為10min-5h，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、乙醚或二惡烷中的至少一種；

3)將步驟1)或2)中制備得到的化合物b或c,分別與步驟化合物dAI按照摩爾比1:1-3反應(yīng)，制備化合物dABp-1-dABp-4：

反應(yīng)溫度為0-50℃，Pd、Cu和胺同時(shí)催化，反應(yīng)時(shí)間為8-24h，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、乙醚或二惡烷中的至少一種。

上述的熒光核苷在生物成像中的應(yīng)用。

所述的熒光核苷在生物成像中的應(yīng)用，其生物樣品是包括血細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞在內(nèi)的活細(xì)胞。

本發(fā)明改進(jìn)現(xiàn)有的黏度熒光核苷在應(yīng)用的不足，設(shè)計(jì)并合成出雙光子激發(fā)、適用于有效的、專一的識別含有RNA的網(wǎng)織紅細(xì)胞(在血細(xì)胞中)及檢測細(xì)胞粘度的并對其成像的熒光核苷。該類核苷熒光染料在RNA含量少的細(xì)胞區(qū)域和組織內(nèi)具有較低的背景熒光，在RNA含量高的細(xì)胞區(qū)域和組織內(nèi)具有較強(qiáng)的熒光信號，且當(dāng)細(xì)胞的黏度發(fā)生變化是，熒光強(qiáng)度及壽命也隨之變化。

由于網(wǎng)織紅細(xì)胞僅含有RNA,所以此類熒光分子能從血細(xì)胞中篩選出網(wǎng)織紅細(xì)胞，并對其進(jìn)行多模式成像。這類化合物在水中具有一定溶解度，同時(shí)具有良好的水油兩親性，能穿過細(xì)胞膜；并且還具有較大的有效的雙光子吸收截面。此外，本發(fā)明的這類化合物還具有較低的生物毒性、光漂白性和高的光穩(wěn)定性，且其光譜范圍與生物樣品的自身的光譜范圍有足夠大的差別。

本發(fā)明所述的熒光核苷具備以下優(yōu)點(diǎn)：所述化合物引入了專一性識別和定位基團(tuán)，提高了對細(xì)胞和組織識別的專一性、特異性；所述化合物具有良好的雙光子性能，應(yīng)用于生物樣品成像時(shí)具有低的生物光漂白、光損傷和生物毒性；所述化合物部分分子的熒光發(fā)射波長較長，可用于活細(xì)胞成像；所述化合物均可作為比例和壽命熒光核苷對網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)行成像，排除環(huán)境因素對熒光強(qiáng)度的干擾；所述化合物毒副性小，原料易得，結(jié)構(gòu)簡單，易制備，易產(chǎn)業(yè)化。

附圖說明

圖1是實(shí)施例2表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-1對黏度的響應(yīng)。測定方法為：將化合物dABp-1分別加入到水和甘油的不同比例的混合溶液中，測定熒光發(fā)射光譜。

圖2是實(shí)施例3表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-1在不同黏度下的熒光壽命的變化。測定方法為：將化合物dABp-1分別加入到水和甘油的不同比例的混合溶液中，測定熒光壽命。

圖3是實(shí)施例4表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-1在網(wǎng)織紅細(xì)胞中不同成像模式下的成像圖片。測定方法為：將10μL濃度為1mM的dABp-1的DMSO溶液加入到的網(wǎng)織紅細(xì)胞中，在37℃，5％CO₂下孵育50分鐘，選取某一區(qū)域，用油鏡(60×)觀察，重復(fù)三次。圖片收集波長490-520nm,550-580nm。

圖4是實(shí)施例6表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-2的水溶解性。測試方法：用不同濃度的dABp-2的水溶液，測試其在最大吸收下的熒光發(fā)射強(qiáng)度。

圖5是實(shí)施例7表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-2對細(xì)胞黏度的響應(yīng)。測試方法：將10μL濃度為1mM的dABp-1的DMSO溶液加入到的HepG 2細(xì)胞中，在37℃，5％CO₂下孵育30分鐘，選取某一區(qū)域，分別在25℃和37℃下，用油鏡(60×)觀察、拍照，重復(fù)三次。圖片收集波長490-520nm,550-580nm。

圖6是實(shí)施例8表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-3的生物毒性測試。測試方法：將不同濃度梯度的dABp-3的DMSO溶液分別加入到A549細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、RH-35細(xì)胞、BRL3A細(xì)胞和NIH 373細(xì)胞中，在37℃，5％CO₂下孵育24小時(shí)。用一定體積PBS洗三遍，然后加入MTT，用酶標(biāo)儀測試。

圖7是實(shí)施例9表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-3的雙光子吸收截面的測定結(jié)果。測定溶劑為：二甲基亞砜。測定方法為：采用飛秒雙光子誘導(dǎo)熒光方法，利用熒光素的NaOH溶液(pH＝11)作為參比，所用A₁溶液濃度都為1×10^-4M，激光脈沖寬70fs，重復(fù)頻率80MHz，激光器的平均輸出功率1.5W(780nm)，可調(diào)波長范圍700～980nm,在實(shí)驗(yàn)中飛秒激光波長調(diào)至所需測試波長。

圖8是實(shí)施例10表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-3的溶劑化效應(yīng)。測試方法：把dABp-3分別加入到正己烷、二氯甲烷、丙酮、DMF、DMSO、乙醇、Tris-HCl中，分別測定紫外吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)。

圖9是實(shí)施例11表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-3在活細(xì)胞中的發(fā)射波長提取圖片。將10μL濃度為1mM的dABp-3的DMSO溶液加入到的HepG 2細(xì)胞中，在37℃，5％CO₂下孵育30分鐘，選取某一區(qū)域，做波長掃面，步長：2nm,帶寬：2nm；提取波長范圍490-610nm。

圖10是實(shí)施例13表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-4的光穩(wěn)定性。測試方法：用500W碘鎢燈照射樣品，每隔半小時(shí)測一次，測7個(gè)小時(shí)。

圖11是實(shí)施例14表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-4在不同pH下發(fā)射光譜的變化。測試方法：在化合物dABp-4濃度一定的條件下調(diào)節(jié)pH，測試pH范圍在4-10內(nèi)的化合物dABp-4的熒光發(fā)射光譜的變化。

圖12是實(shí)施例15表征本發(fā)明的熒光核苷化合物dABp-4在不同黏度下的壽命變化。測定方法為：將化合物dABp-4分別加入到水和甘油的不同比例的混合溶液中，測定熒光壽命。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明。

除另有說明外，本文中使用的術(shù)語具有以下含義。

本文中使用的術(shù)語“烷基”包括直鏈烷基和支鏈烷基。例如，“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、異丙基和叔丁基。類似的規(guī)則也適用于本說明書中使用的其它基團(tuán)。

在本發(fā)明的通式化合物中，所述及的R¹選自-Ph、-Ph(CH₃)_n、-Ph(CH₂CH₃)_n、-Ph((OCH₂CH₂)_nOCH₃)_m、-Ph((OCH₂CH₂CH₂)_nOCH₃)_m、-Ph((OCH₂CH₂CH₂)_nOCH₃)₂或-PhN((OCH₂CH₂CH₂)_nOCH₃)₂，其中n選自1-8的整數(shù)，m選自1-3的整數(shù)；優(yōu)選方案中R¹選自-Ph或-Ph(OCH₂CH₂)_nOCH₃，n選自1-8的整數(shù)；更優(yōu)選方案R¹選自-Ph或-Ph(OCH₂CH₂)_nOCH₃，n選自1-6的整數(shù)；最優(yōu)選方案R¹選自-Ph或-Ph(OCH₂CH₂)₄OCH₃，n選自2-5的整數(shù)；

所述的R²、R³、R⁴、R⁵各自獨(dú)立地選自-CH₃、-(CH₂)_nCH₃，n選自1-8的整數(shù)；優(yōu)選方案中R²、R³、R⁴、R⁵各自獨(dú)立地選自-CH₃、-(CH₂)_nCH₃，n選自1-6的整數(shù)；更優(yōu)選方案R²、R³、R⁴、R⁵各自獨(dú)立地選自-CH₃、-(CH₂)_nCH₃，n選自1-4的整數(shù)；最優(yōu)選方案R²、R³、R⁴、R⁵各自獨(dú)立地選自-CH₃、-(CH₂)_nCH₃，n選自1-2的整數(shù)；

所述及的R⁶選自

-N(CH₃)₂、-N(CH₂)_nCH₃、其中n選自1-3的整數(shù)；優(yōu)選方案中R⁶選自-N(CH₃)₂、n選自1-3的整數(shù)；更優(yōu)選方案R⁶選自-N(CH₃)₂、n選自1-3的整數(shù)；最優(yōu)選方案R⁶選自n選自1-3的整數(shù)；

所述及的L選自烷基鏈、-Ph-、-CH₂-(CH＝CH)_n-(C≡C)_m-CH₂-、-(CH₂)_nCH＝CH(CH₂)_n-、-(CH₂)_nC≡C(CH₂)_n-,其中n，m獨(dú)立選自0-4的整數(shù)；優(yōu)選方案中L選自-Ph-、-CH₂-(CH＝CH)_n-(C≡C)_m-CH₂-、-(CH₂)_nC≡C(CH₂)_n-，n，m獨(dú)立選自0-4的整數(shù)；更優(yōu)選方案L選自-Ph-、-(CH₂)_nC≡C(CH₂)_n-，n選自0-4的整數(shù)；最優(yōu)選方案L選自-Ph-、-(CH₂)_nC≡C(CH₂)_n-，n選自0-2的整數(shù)；

所述及的B選自dA、dG、dC、dT和dU，其中R⁷獨(dú)立選自烷基鏈、-H、-TBDMS、-Boc、-Ac和-DMTr；優(yōu)選方案中B選自dA、dG、dC、dT和dU，其中R⁷獨(dú)立選自-H、-TBDMS、-Boc、-Ac和-DMTr；更優(yōu)選方案中B選自dA、dG、dC和dT，其中R⁷獨(dú)立選自-H、-TBDMS、-Boc和-Ac；最優(yōu)選方案中B選自dA、dG、dC和dT，其中R⁷獨(dú)立選自-H、-TBDMS和-Ac。

另外，本發(fā)明提供了上述熒光核苷合成方法，包括如下步驟：

)化合物a與三甲基硅基乙炔按照摩爾比1:1-1:6反應(yīng)，制備化合物b：

反應(yīng)溫度為0-50℃，Pd、Cu和胺作催化劑，反應(yīng)時(shí)間為6-24小時(shí)，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、乙醚、二惡烷或其混合物；

優(yōu)選的實(shí)施方案：反應(yīng)溫度為0-30℃，PdCl₂(PPh₃)₂、CuI和胺作催化劑，反應(yīng)時(shí)間為8-18小時(shí)，反應(yīng)溶劑選自四氫呋喃、乙醚或其混合物,化合物a與三甲基硅基乙炔的摩爾比1:1-1:4；

進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案：反應(yīng)溫度為10-30℃，PdCl₂(PPh₃)₂、CuI和NEt₃作催化劑，反應(yīng)時(shí)間為8-16小時(shí)，反應(yīng)溶劑四氫呋喃，化合物a與三甲基硅基乙炔的摩爾比1:1-1:3；

最優(yōu)選的實(shí)施方案：反應(yīng)溫度為20-30℃，PdCl₂(PPh₃)₂、CuI和NEt₃作催化劑，反應(yīng)時(shí)間為8-16小時(shí)，反應(yīng)溶劑四氫呋喃，化合物a與三甲基硅基乙炔的摩爾比1:1-1:2；

2)化合物b與四丁基氟化銨按照摩爾比1:0.8-1:4反應(yīng)，制備化合物c：

反應(yīng)溫度為0-50℃，反應(yīng)時(shí)間為10min-5h，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、乙醚、二惡烷或其混合物；

優(yōu)選的實(shí)施方案：反應(yīng)溫度為0-40℃，反應(yīng)時(shí)間為10min-3h，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、或其混合物，化合物b與四丁基氟化銨的摩爾比1:0.8-1:3；

進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案：反應(yīng)溫度為10-40℃，反應(yīng)時(shí)間為10min-2h，反應(yīng)溶劑四氫呋喃，化合物b與四丁基氟化銨的摩爾比1:0.8-1:2；

最優(yōu)選的實(shí)施方案：反應(yīng)溫度為20-40℃，反應(yīng)時(shí)間為20min-1.5h，反應(yīng)溶劑四氫呋喃，化合物b與四丁基氟化銨的摩爾比1:0.8-1:1.8.

3)將步驟1)或2)中制備得到的化合物b或c,分別與dAI按照摩爾比1:1-1:3反應(yīng)，制備化合物dABp-1-dABp-4：

反應(yīng)溫度為0-50℃，Pd、Cu和胺同時(shí)催化，反應(yīng)時(shí)先加入dAI、Pd和Cu，N₂保護(hù)下加入胺和另一種原料，反應(yīng)時(shí)間為8-24h，反應(yīng)溶劑選自二氯甲烷、四氫呋喃、乙醚、二惡烷或其混合物；

優(yōu)選的實(shí)施方案：反應(yīng)溫度為10-50℃，PdCl₂(PPh₃)₂、CuI和胺作催化劑，反應(yīng)時(shí)先加入dAI、Pd和Cu，N₂保護(hù)下加入胺和另一種原料，反應(yīng)時(shí)間為10-24h，反應(yīng)溶劑選自四氫呋喃、乙醚或其混合物，化合物b或c與化合物dAI的摩爾比1:1-1:3；

進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案：反應(yīng)溫度為20-50℃，PdCl₂(PPh₃)₂、CuI、NEt₃或TBAF作催化劑，反應(yīng)時(shí)先加入dAI、Pd和Cu，N₂保護(hù)下加入TBAF和另一種原料，反應(yīng)時(shí)間為10-18h，反應(yīng)溶劑為四氫呋喃，化合物b或c與化合物dAI的摩爾比1:1-1:2；

最優(yōu)選的實(shí)施方案：反應(yīng)溫度為20-40℃，PdCl₂(PPh₃)₂、CuI和TBAF作催化劑，反應(yīng)時(shí)先加入dAI、PdCl₂(PPh₃)₂和CuI，在N₂保護(hù)下加入TBAF和另外的原料b或c，反應(yīng)時(shí)間為8-20h，反應(yīng)溶劑為二氯甲烷，化合物b或c與化合物dAI的摩爾比1:1.2-1:2。

上述對本發(fā)明的在氟硼二吡咯為母體、堿基為識別基團(tuán)的核苷類熒光核苷的合成方法的描述中，各個(gè)取代基(R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇)的定義及優(yōu)選，均與本發(fā)明中的對化合物的描述中的定義及優(yōu)選相同。

對本發(fā)明采用上述方法合成的核苷類熒光核苷化合物，采用核磁共振氫譜、碳譜或質(zhì)譜來確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明所述的熒光核苷具備以下優(yōu)點(diǎn)：

所述化合物引入了專一性識別和定位基團(tuán)，提高了對細(xì)胞和組織識別的專一性、特異性；

所述化合物具有良好的雙光子性能，應(yīng)用于生物樣品成像時(shí)具有低的生物光漂白、光損傷和生物毒性；

所述化合物部分分子的熒光發(fā)射波長較長，可用于活細(xì)胞成像；

所述化合物均可作為比例和壽命熒光核苷對網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)行成像，排除環(huán)境因素對熒光強(qiáng)度的干擾；

所述化合物毒副性小，原料易得，結(jié)構(gòu)簡單，易制備，易產(chǎn)業(yè)化；

鑒于此，本發(fā)明所述的核苷類熒光核苷化合物可用于活細(xì)胞內(nèi)黏度檢測和成像，另外，本發(fā)明所述的核苷類熒光核苷還可以從血細(xì)胞中篩選網(wǎng)織紅細(xì)胞并對其成像。本發(fā)明所述組合物中包含本發(fā)明所提供的核苷類熒光核苷化合物。

本發(fā)明還提供使用上述本發(fā)明的核苷類熒光核苷化合物可用于活細(xì)胞內(nèi)黏度檢測和成像及從血細(xì)胞中篩選網(wǎng)織紅細(xì)胞并對其成像的方法，該方法包括使所述化合物與生物樣品接觸的步驟。本文中使用的術(shù)語“接觸”可包括在溶液或固相中接觸。

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

轉(zhuǎn)子化合物dABp-1的合成

(1)中間體1和3的合成

中間體1的合成參見文獻(xiàn)Vázquez-Romero,A.；Kielland,N.；Arévalo,M.J.；Preciado,S.；Mellanby,R.J.；Feng,Y.；Lavilla,R.；Vendrell,M.J.Am.Chem.Soc.2013,135,16018-16021(中間體1的合成)；Moreau,C.；Wagner,G.K.；Weber,K.；Guse,A.H.；Potter,B.V.L.J.Med.Chem.2006,49,5162-5176(中間體3的合成)。

(2)中間體2的合成

將0.8mmol的TBAF加入到0.4mmol的中間體1的THF溶液中，在室溫下攪拌30分鐘，停止反應(yīng)，減壓蒸出溶劑，加適量的二氯甲烷溶解固體，并加適量的水萃取3次，合并有機(jī)相，減壓蒸餾出去溶劑，過柱分離，得到紅色固體，產(chǎn)率為77％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm)8.02(s,1H),7.98(s,1H),7.64-7.50(m,5H),7.02(d,J＝4.3Hz,1H),6.99(s,1H),6.60(d,J＝4.2Hz,1H),3.09(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ(ppm)147.8,146.3,145.3,133.3,133.1,132.7,131.2,130.5,128.6,119.7,79.8,76.4.

(3)轉(zhuǎn)子化合物dABp-1的合成

將0.1mmol的中間體3、0.005mmol的PdCl₂(PPh₃)₂和0.01mmol的CuI加入到Schlenk反應(yīng)管中,然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入2mL THF和1mL NEt₃，最后把0.11mmol的中間體3溶解到2mL THF中，用注射器加入到反應(yīng)管中。室溫下攪拌19小時(shí)，停止反應(yīng)。把反應(yīng)液過硅藻土，除去催化劑，減壓蒸出溶劑。柱層析分離，得到紅色固體，產(chǎn)率為21％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm)8.28(s,1H),8.09(s,2H),7.68-7.52(m,5H),7.09(d,J＝6.8Hz,2H),6.66(d,J＝4.3Hz,1H),6.51(t,J＝6.9Hz,1H),5.83(s,2H),4.80(dt,J＝5.8Hz,3.1Hz,1H),4.01-3.90(m,2H),3.70(dd,J＝10.1Hz,4.7Hz,1H),3.54-3.45(m,1H),2.22(m,1H),0.89(s,9H),0.85(s,9H),0.11(d,J＝3.1Hz,6H),0.01(s,3H),-0.01(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ(ppm)155.0,153.2,149.5,147.6,135.4,133.2,131.4,130.5,128.8,87.9,85.4,72.8,63.1,37.1,25.9,25.8,18.4,18.0,-4.9,-4.7,-5.4,-5.4；HRMS:m/z calcd for C₃₉H₅₁BF₂N₇O₃Si₂[M+H]770.3655,found:770.3644.

中間體6的合成

中間體6的合成參見文獻(xiàn)Vázquez-Romero,A.；Kielland,N.；Arévalo,M.J.；Preciado,S.；Mellanby,R.J.；Feng,Y.；Lavilla,R.；Vendrell,M.J.Am.Chem.Soc.2013,135,16018-16021。

中間體7的合成：合成方法與化合物dABp-1的合成類似，只是把中間體6換成中間體5,得到的產(chǎn)率為29％。

化合物dABp-4的合成：將0.21mmol中間體7溶解在THF中，向溶液中加入TBAF，室溫?cái)嚢?0分鐘停止反應(yīng)，減壓蒸出溶劑，加適量的二氯甲烷溶解固體，并加適量的水萃取3次，合并有機(jī)相，減壓蒸餾出去溶劑，過柱分離，得到紅色固體，產(chǎn)率為62％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm)8.29(s,1H),7.15(d,J＝8.7Hz,2H),7.05(d,J＝8.7Hz,2H),6.77(d,J＝11.7Hz,1H),6.68(dd,J＝9.8,5.4Hz,1H),6.09(s,1H),5.83(s,2H),4.76(d,J＝4.7Hz,1H),4.20(d,J＝5.4Hz,3H),4.00–3.89(m,3H),3.76(dd,J＝5.9,3.1Hz,3H),3.73–3.63(m,8H),3.55(dd,J＝5.7,3.5Hz,2H),3.37(s,3H),3.06–2.97(m,1H),2.71(s,3H),2.59(s,3H),2.46(s,1H),2.26(dd,J＝13.2,5.5Hz,1H),1.56(s,3H),1.47(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ(ppm)159.7,156.0,155.3,152.8,148.6,146.5,143.0,142.7,135.2,133.8,130.2,129.0,126.4,123.1,120.6,115.5,90.8,89.7,87.5,83.7,73.6,71.9,70.9,70.6,70.5,69.7,67.6,63.5,59.1,40.6,29.7,15.0,13.7,13.5.

實(shí)施例2

熒光核苷化合物dABp-1對黏度的響應(yīng)

取濃度為30μL 1mM的dABp-1的DMSO溶液，分別加入10mL到不同比例的水和甘油組成的混合溶液中，超聲20分鐘，再在0℃下靜置24小時(shí)，用熒光分光光度計(jì)測定其熒光發(fā)射光譜。測試結(jié)果顯示，隨著溶液的黏度的增大，dABp-1熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，詳見圖1。

實(shí)施例3

熒光核苷化合物dABp-1在不同黏度下的熒光壽命的變化

取濃度為30μL 1mM的dABp-1的DMSO溶液，分別加入10mL到不同比例的水和甘油組成的混合溶液中，超聲20分鐘，再在0℃下靜置24小時(shí)，用瞬態(tài)/穩(wěn)態(tài)時(shí)間分辨熒光光度計(jì)測定熒光壽命。測試結(jié)果顯示，隨著溶液的黏度的增大，dABp-1熒光壽命增長，詳見圖圖2。

實(shí)施例4

熒光核苷化合物dABp-1在正常和血栓模型的網(wǎng)織紅細(xì)胞中不同成像模式下的成像

將10μL濃度為1mM的的DMSO溶液加入到的正常和血栓模型的網(wǎng)織紅細(xì)胞中，在37℃，5％CO₂下將加入轉(zhuǎn)子dABp-1的細(xì)胞孵育50分鐘。然后，PBS震蕩漂洗5min×3，再加入生理鹽水，激光共聚焦顯微鏡下成像。選取代表性區(qū)域，用油鏡(100×)觀察，重復(fù)三次。圖片收集波長490-520nm,550-580nm。測試結(jié)果顯示，dABp-1能在網(wǎng)織紅細(xì)胞中成像，且當(dāng)網(wǎng)織紅細(xì)胞的黏度變化時(shí)，熒光強(qiáng)度的比值也發(fā)生變化。詳見圖3。

實(shí)施例5

熒光核苷化合物dABp-2的合成方法

(1)中間體4的合成

中間體4的合成參見文獻(xiàn)Vázquez-Romero,A.；Kielland,N.；Arévalo,M.J.；Preciado,S.；Mellanby,R.J.；Feng,Y.；Lavilla,R.；Vendrell,M.J.Am.Chem.Soc.2013,135,16018-16021。

(2)化合物dABp-2的合成：合成方法與化合物dABp-1的合成類似，只是把中間體3換成中間體4。得到的產(chǎn)率為17％。¹H NMR(400 MHz,CDCl₃):δ(ppm)8.30(s,1H),7.55-7.49(m,3H),7.28(m,2H),6.55-6.50(m,1H),6.09(s,1H),5.72(s,2H),4.74(d,J＝2.5 Hz,1H),3.97-3.89(m,2H),3.69-3.63(m,2H),2.72(s,3H),2.60(s,3H),2.15(m,1H),1.53(s,3H),1.42(s,3H),0.88(s,9H),0.85(s,9H),0.09(s,6H),0.01(s,3H),-0.01(s,3H)；¹³C NMR(100 MHz,CDCl₃):δ(ppm)155.0,153.1,149.6,135.9,133.4,131.4,130.5,128.5,120.4,87.9,85.6,72.9,63.1,37.4,25.9,25.8,18.4,18.0,-4.7,-5.4,-5.5；HRMS:m/z calcd for C₄₁H₅₅BF₂N₇O₃Si₂[M+H]798.3968,found:798.3960.

實(shí)施例6

熒光核苷化合物dABp-2的水溶解性

將3μL濃度為1mM的dABp-2的DMSO溶液加入到3 mL水中，用熒光分光光度計(jì)測定其發(fā)射光譜強(qiáng)度，接下來每次添加3μL dABp-2的DMSO溶液，并用熒光強(qiáng)度對濃度作圖，當(dāng)出現(xiàn)拐點(diǎn)時(shí)的濃度，是dABp-2在水中的溶解濃度。測試結(jié)果顯示當(dāng)化合物dABp-2濃度為5μM時(shí)，熒光強(qiáng)度未發(fā)生偏移，即化合物dABp-2在水中的溶解度為5μM。詳見圖4。

實(shí)施例7

熒光核苷化合物dABp-2對細(xì)胞黏度的響應(yīng)

取10μL濃度為1mM的dABp-2的DMSO溶液加入到的HepG 2細(xì)胞中，將加入dABp-2的HepG 2細(xì)胞在37℃，5％CO₂下孵育30分鐘，選取細(xì)胞形態(tài)好的區(qū)域，分別在25℃和37℃下，進(jìn)行共聚焦成像，圖片收集波長490-520nm,550-580nm。測試結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞的黏度變化時(shí)，dABp-2熒光強(qiáng)度的比值也發(fā)生變化，詳見圖5。

實(shí)施例8

熒光核苷化合物dABp-3的生物毒性測試

把細(xì)胞密度為10⁵的A549細(xì)胞、BEL-7402細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、RH-35細(xì)胞、BRL3A細(xì)胞和NIH 373細(xì)胞，接種到96孔板上，加適量培養(yǎng)基，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱里孵育24小時(shí)，分別加入不同濃度梯度的dABp-3的DMSO溶液，在37℃，5％CO₂的培養(yǎng)箱里再孵育24小時(shí)。用PBS洗三遍，然后加入MTT，用酶標(biāo)儀測試，按現(xiàn)有技術(shù)的方法處理數(shù)據(jù)，得到細(xì)胞毒性的結(jié)果，測試結(jié)果顯示，化合物dABp-3具有較低的生物毒性，詳見圖6。

實(shí)施例9

熒光核苷化合物dABp-3的在不同黏度下雙光子吸收截面的測定

采用飛秒雙光子誘導(dǎo)熒光方法，利用熒光素的NaOH溶液(pH 11)作為參比，進(jìn)行化合物dABp-3的雙光子截面的測定。把dABp-3分別加入到不同比例的水和甘油的混合液中，使?jié)舛葹?0^-4M，超聲20分鐘，再在0℃靜置24小時(shí)，然后進(jìn)行雙光子吸收截面的測試。用計(jì)算公式2.1所示：

${\mathrm{\δ}}_s={\mathrm{\δ}}_r\frac{C_r}{C_s}\frac{n_r}{n_s}\frac{F_s}{F_r}\frac{{\mathrm{\Φ}}_r}{{\mathrm{\Φ}}_s}$

公式中的C為溶液的濃度，n是溶劑的折射率，可查表得到。F是上轉(zhuǎn)換熒光強(qiáng)度，由實(shí)驗(yàn)測得。δ是雙光子吸收截面。參比溶液的物理量均用下標(biāo)r表示。就能得到雙光子吸收截面值。使用的雙光子激發(fā)熒光光譜的激發(fā)源是一臺鎖模飛秒鈦藍(lán)寶石激光器，激光脈沖寬70fs，重復(fù)頻率80MHz，激光器的平均輸出功率1.5W(780nm)，可調(diào)波長范圍700～980nm,在實(shí)驗(yàn)中飛秒激光波長調(diào)至所需測試波長。測試結(jié)果顯示，dABp-3的雙光子截面隨著黏度增大而增大，詳見圖7。

實(shí)施例10

熒光核苷化合物dABp-3的溶劑化效應(yīng)

把dABp-3分別加入到正己烷、二氯甲烷、丙酮、DMF、DMSO、乙醇、Tris-HCl中分別測試其吸收光譜和發(fā)射光譜。測試結(jié)果顯示，但溶劑極性增大時(shí)，熒光強(qiáng)度減弱，且發(fā)生藍(lán)移，詳見圖8。

實(shí)施例11

熒光核苷化合物dABp-3在活細(xì)胞中的發(fā)射波長提取

取10μL濃度為1mM的dABp-3的DMSO溶液加入到的HepG 2細(xì)胞中，將加入過dABp-3的HepG 2細(xì)胞在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，選取細(xì)胞形態(tài)較好的區(qū)域，做波長掃面，步長：2nm,帶寬：2nm；提取波長范圍490-610nm。結(jié)果顯示，在活細(xì)胞內(nèi)dABp-3也有明顯地雙發(fā)射，詳見圖9。

實(shí)施例12

熒光核苷化合物dABp-4的合成

(1)中間體5的合成：中間體5的合成方法參見文獻(xiàn)Vázquez-Romero,A.；Kielland,N.；Arévalo,M.J.；Preciado,S.；Mellanby,R.J.；Feng,Y.；Lavilla,R.；Vendrell,M.J.Am.Chem.Soc.2013,135,16018-16021。

(2)中間體6的合成：中間體6的合成方法與化合物dABp-1的合成類似，只是把中間體4換成中間體5,得到的產(chǎn)率為29％。

(3)化合物dABp-4的合成：將0.21mmol中間體7溶解在THF中，向溶液中加入TBAF，室溫?cái)嚢?0分鐘停止反應(yīng)，減壓蒸出溶劑，加適量的二氯甲烷溶解固體，并加適量的水萃取3次，合并有機(jī)相，減壓蒸餾出去溶劑，過柱分離，得到紅色固體，產(chǎn)率為62％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm)8.29(s,1H),7.15(d,J＝8.7Hz,2H),7.05(d,J＝8.7Hz,2H),6.77(d,J＝11.7Hz,1H),6.68(dd,J＝9.8,5.4Hz,1H),6.09(s,1H),5.83(s,2H),4.76(d,J＝4.7Hz,1H),4.20(d,J＝5.4Hz,3H),4.00–3.89(m,3H),3.76(dd,J＝5.9,3.1Hz,3H),3.73–3.63(m,8H),3.55(dd,J＝5.7,3.5Hz,2H),3.37(s,3H),3.06–2.97(m,1H),2.71(s,3H),2.59(s,3H),2.46(s,1H),2.26(dd,J＝13.2,5.5Hz,1H),1.56(s,3H),1.47(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ(ppm)159.7,156.0,155.3,152.8,148.6,146.5,143.0,142.7,135.2,133.8,130.2,129.0,126.4,123.1,120.6,115.5,90.8,89.7,87.5,83.7,73.6,71.9,70.9,70.6,70.5,69.7,67.6,63.5,59.1,40.6,29.7,15.0,13.7,13.5.

實(shí)施例13

熒光核苷化合物dABp-4的光穩(wěn)定性

取9μL dABp-4的DMSO溶液，加入到3mL水中。組裝光穩(wěn)定性測試裝置：500W碘鎢燈，距離碘鎢燈25-30厘米的盛裝飽和亞硝酸鈉的玻璃缸(濾光作用)。把樣品放到里玻璃缸10-15厘米處，用碘鎢燈照射樣品。每隔半小時(shí)測一次其發(fā)射，測7個(gè)小時(shí)。測試結(jié)果顯示，dABp-4分子在水中對光對其穩(wěn)定性的影響很小，詳見圖10。

實(shí)施例14

熒光核苷化合物dABp-4在不同pH下發(fā)射光譜的變化

配制21mL濃度為3×10^-6M的化合物dABp-4水溶液，保持濃度不變的條件下連續(xù)調(diào)節(jié)其pH值，測試pH范圍在4-10內(nèi)的化合物dABp-4的熒光發(fā)射光譜的變化。測試結(jié)果顯示，pH在4-10范圍內(nèi)變化對dABp-4的發(fā)射強(qiáng)度幾乎沒有影響，詳見圖11。

實(shí)施例15

熒光核苷化合物dABp-4在不同黏度下的壽命變化

取濃度為30μL 1mM的dABp-4的DMSO溶液，分別加入10mL到不同比例的水和甘油組成的混合溶液中，超聲20分鐘，再在0℃下靜置24小時(shí)，用瞬態(tài)/穩(wěn)態(tài)時(shí)間分辨熒光光度計(jì)測定熒光壽命。測試結(jié)果顯示，隨著溶液的黏度的增大，dABp-4熒光壽命增長，詳見圖12。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。