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中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫及其構(gòu)建方法和應(yīng)用與流程

文檔序號:11841613閱讀:771來源:國知局
中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫及其構(gòu)建方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及基因工程,尤其是涉及一種中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。



背景技術(shù):

進(jìn)入21世紀(jì),水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)向多品種、高投入、高密度、集約式、工廠化的方向快速發(fā)展,但頻繁暴發(fā)的傳染性病害時刻威脅著該產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)性發(fā)展。目前,水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病害防治主要方法有藥物防治、免疫防治和生態(tài)防治等,并逐步向高效、低毒、無殘留和無公害的方向發(fā)展。而化學(xué)藥物仍是目前水產(chǎn)動物病害防治最直接和最有效的一種手段。我國漁藥產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)薄弱、水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病害防治技術(shù)滯后與養(yǎng)殖戶用藥知識匱乏等因素,導(dǎo)致大部分養(yǎng)殖戶使用價格低廉、殘留嚴(yán)重的農(nóng)藥及化工原料,造成了水體的嚴(yán)重污染。此外,抗生素、激素類等藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用,雖然對病害控制起到一定作用,但在很大程度上破壞了水環(huán)境及動物體內(nèi)的微生態(tài)平衡,使水產(chǎn)動物失去了正常的菌群屏障及生物拮抗作用,進(jìn)而導(dǎo)致外源性效應(yīng)菌和內(nèi)源性致病菌大量增殖,由此造成了潛在的更大病害。濫用藥物將導(dǎo)致致病菌株產(chǎn)生耐藥性,變異出致病性更強、危害性更大、流行性更廣的致病微生物,長期使用化學(xué)藥品勢必導(dǎo)致病原生物抗藥性的增加。隨著科技的發(fā)展和人類經(jīng)濟(jì)文化水平的提高,人們對食品安全和環(huán)境安全提出了更高的要求,化學(xué)藥物正逐漸被生物制品所替代。

作為一種無脊椎動物,中國明對蝦依靠其僅有的先天免疫系統(tǒng)實現(xiàn)對外界病原微生物的免疫。中國明對蝦在海水這一復(fù)雜微生物環(huán)境中的正常生長、繁殖,說明其免疫系統(tǒng)能夠有效抵御外界病原微生物的侵襲??怪嗵且蜃?anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是一種脂多糖結(jié)合蛋白,是鱟、蟹蝦類等甲殼動物體內(nèi)中廣泛存在的一類抗菌肽,通過結(jié)合脂多糖,調(diào)節(jié)細(xì)胞的脫顆粒作用,引起一系列級聯(lián)反應(yīng),從而在甲殼動物的體液免疫中發(fā)揮著重要作用。在前期研究中,申請人所在項目組從中國明對蝦血細(xì)胞中克隆到ALF全長cDNA序列(FcALF),研究發(fā)現(xiàn)在鰻弧菌等病原刺激下,F(xiàn)cALF在mRNA水平上的表達(dá)發(fā)生劇烈變化,提示FcALF在對蝦應(yīng)對外界病原感染過程中,發(fā)揮著重要作用(Liu,FS,等,Marine Biotechnology,2005,7(6):600-608)。有報道發(fā)現(xiàn)人工合成LBD結(jié)構(gòu)域的短肽具有明顯 的抗菌活性。但是人工合成的費用很高,而且人為的突變LBD結(jié)構(gòu)域的部分氨基酸進(jìn)而合成相應(yīng)的短肽用于后期的研究,盲目性太強。通過建立突變體文庫的方法進(jìn)行大規(guī)模的篩選,對于高效地篩選以中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域為基本骨架的抗菌活性多肽具有重要意義。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明目的在于提供一種中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:

一種中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫,其特征在于,LBD突變體文庫的基本結(jié)構(gòu)為SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示的蛋白質(zhì)。

一種中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫的構(gòu)建方法:

①設(shè)計擴(kuò)增中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域保守氨基酸序列對應(yīng)核苷酸序列的In-fusion引物(LBD_DF與LBD_DR),并進(jìn)行PCR擴(kuò)增相應(yīng)的核苷酸序列;

②設(shè)計擴(kuò)增分泌表達(dá)載體pCT7-CHISP6H的In-fusion引物(V_LBDF與V_LBDR),并進(jìn)行PCR擴(kuò)增相應(yīng)的核苷酸序列;

③將步驟①的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段(LBD_DF/LBD_DR)和步驟(②)載體片段(V_LBDF/V_LBDR)利用In-fusion的方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒文庫;

④將步驟③中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,挑取克隆,構(gòu)建SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示的蛋白質(zhì)的中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫。

所述步驟④中大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌DH5α。

一種中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫的應(yīng)用,所述文庫在用于篩選以中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域為基本骨架的抗菌活性多肽中的應(yīng)用。

所述中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域為基本骨架的抗菌活性多肽可用于制備革蘭氏陰性菌的抗菌類藥物。

所述中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域為基本骨架的抗菌活性多肽可用于制備抗菌肽、免疫增強劑、保健品或飼料添加劑。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點:本發(fā)明以中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域保守氨基酸序列為基礎(chǔ),選取pCT7-CHISP6H為基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫。同時分析了利用該文庫進(jìn)行抗菌活性多肽篩選的可行性,為高效的篩選以中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域為基本骨架的抗菌活性多肽提供指導(dǎo)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的PCR擴(kuò)增LBD片段和pCT7-CHISP6H載體片段的實驗結(jié)果。其中,M為D2000DNA Marker;1為pCT7-CHISP6H載體PCR擴(kuò)增結(jié)果;2為LBD片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實施例提供的隨機檢測30個克隆中23個陽性克隆核苷酸序列比較分析結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實施例提供的隨機檢測30個克隆中23個陽性克隆編碼氨基酸的特征比較分析結(jié)果。

圖4為本發(fā)明實施例提供的隨機檢測30個克隆中23個陽性克隆編碼氨基酸等電點的比較分析結(jié)果。

具體實施方式

下面的實施例中將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述,但本發(fā)明不限于此。

本發(fā)明方法包括以下步驟:

1)中國明對蝦抗脂多糖因子LBD突變體文庫基本結(jié)構(gòu)的設(shè)計;

2)將步驟1)設(shè)計的結(jié)構(gòu)利用In-fusion的方法與分泌性表達(dá)載體pCT7-CHISP6H進(jìn)行連接,導(dǎo)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,過夜培養(yǎng)后,挑取克隆構(gòu)建突變體文庫;

3)隨機挑取步驟2)中的克隆,進(jìn)行測序分析;并對測序結(jié)果為陽性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主,檢測其菌株生長情況,菌株不能正常生長的為高效的篩選以中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域為基本骨架的抗菌活性多肽。

實施例1

中國明對蝦抗脂多糖因子LBD突變體文庫中基因編碼蛋白的基本結(jié)構(gòu),如SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示,

MKIQRLVALAAAVSLSIGLSGCAASA其中,單下劃線為信號肽序列,雙下劃線為6*His標(biāo)簽,波浪線為LBD結(jié)構(gòu)域成熟肽(其中X代表突變氨基酸)。

該文庫中插入基因的核苷酸序列如SEQ No.2所示,其5′端和3′端分別具有起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)。

ATGAAGATTCAACGACTTGTTGCCCTCGCGGCTGCGGTGTCACTGAGCATCGGGTTGAGCGGGTGCGCTGCCTCCGCC

其中,單下劃線為編碼信號肽的核苷酸序列,雙下劃線為編碼6*His標(biāo)簽的核苷酸序列,波浪線為LBD結(jié)構(gòu)域成熟肽對應(yīng)的核苷酸序列(其中B代表A、T、G、C;D代表A、G、C)。

(a)序列特征:

●長度:171bp,其中有效長度1-171bp

●類型:堿基序列

●鏈型:單鏈

●拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性

(b)分子類型:雙鏈DNA

(c)假設(shè):否

(d)反義:否

(e)最初來源:人工設(shè)計合成

(f)特異性名稱:gene

實施例2

1)中國明對蝦抗脂多糖因子LBD突變體文庫的構(gòu)建

①設(shè)計擴(kuò)增中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域保守氨基酸序列對應(yīng)核苷酸序列的In-fusion引物(LBD_DF與LBD_DR),并進(jìn)行PCR擴(kuò)增相應(yīng)的核苷酸序列;

②設(shè)計擴(kuò)增分泌表達(dá)載體pCT7-CHISP6H的In-fusion引物(V_LBDF與V_LBDR),并進(jìn)行PCR擴(kuò)增相應(yīng)的核苷酸序列;

③將步驟①的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段(LBD_DF/LBD_DR)和步驟②載體片段(V_LBDF/V_LBDR)利用In-fusion的方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒文庫;

④將步驟③中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,挑取克隆,構(gòu)建中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域突變體文庫。

具體為:

LBD_DF

CATCACCATTACTGCBGCTTCBACGTGBCACCGDAAB(下劃線為與載體pCT7-CHISP6H匹配的15bp序列;雙下劃線為與LBD_DR中雙下劃線互補的20bp序列)

LBD_DR

TGGGCACCACATGCGACCCCBGAB(下劃線為與載體pCT7-CHISP6H匹配的15bp序列;雙下劃線為與LBD_DF中雙下劃線互補的20bp序列)

V_LBDF

CGCATGTGGTGCCCATAGAATTCGAAGCTTGATCCGGCTGCT(下劃線為與LBD_DF/LBD_DR擴(kuò)增產(chǎn)物匹配的15bp序列)

V_LBDR

GCAGTAATGGTGATGGTGATGGTGGGCGGAGGCA(下劃線為與LBD_DF/LBD_DR擴(kuò)增產(chǎn)物匹配的15bp序列)

LBD片段擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為50μl,如下:

由于引物L(fēng)BD_DF與LBD_DR的3’端有20bp的反向重復(fù)序列,故而在PCR反應(yīng)過程中無需加入模板。

PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性4min;94℃變性20s,55℃退火20s,72℃延伸20min,共30個循環(huán);最后72℃延伸10min。

pCT7-CHISP6H載體片段擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為50μl,如下:

PCR擴(kuò)增程序:98℃預(yù)變性1min;98℃變性10s,55℃退火5s,72℃延伸2min,共32個循環(huán);最后72℃延伸10min。

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析(圖1),切膠回收與預(yù)測大小一致的片段,LBD片段大小為80bp左右,利用NanoDrop測定回收片段濃度(35ng/μl);pCT7-CHISP6H的片段大小為2800bp左右,利用NanoDrop測定回收片段濃度(72ng/μl)。

根據(jù)HD Clontech kit使用說明,將回收的LBD片段和pCT7-CHISP6H的片段進(jìn)行反應(yīng),具體反應(yīng)體系與反應(yīng)條件為:回收的LBD片段1μl,回收的pCT7-CHISP6H的片段6μl,5× HD 2μl,無菌水2μl,混勻后,在50℃反應(yīng)15min后立即置于冰上,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,利用LB液體培養(yǎng)基稀釋后分別涂布含有100μg/mL氨芐青霉素的LB固體平板,37℃培養(yǎng)過夜,挑取單克隆于384孔板中培養(yǎng)后保存,即為LBD突變體文庫。

2)突變體文庫質(zhì)量檢測

以T7-F/T7-ter(T7-F:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’;T7-ter:5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCG-3’)為引物對,隨機選擇30個克隆利用PCR方法進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)30個克隆插入大小均與預(yù)測大小一致。將PCR檢測陽性克隆經(jīng)搖菌后進(jìn)行DNA測序,對測序結(jié)果進(jìn)行分析如下:①實際獲得的陽性突變體為23個;②提前終止的有2個;③組氨酸標(biāo)簽移碼的為1個;④具有組氨酸標(biāo)簽,而發(fā)生譯碼錯誤的有4個。獲得的23個突變體核苷酸序列多重比對結(jié)果如圖2所示,其對應(yīng)編碼氨基酸序列比對結(jié)果如圖3所示。進(jìn)一步對獲得的突變體編碼蛋白的pI進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示突變體的等電點介于9.42至10.55之 間,如圖4所示。

3)文庫質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測

抽提測序結(jié)果正確的23個陽性克隆質(zhì)粒(具體序列如圖2所示),分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS中,利用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37℃條件下,在含有100μg/mL氨芐青霉素的1mL LB液體培養(yǎng)基中搖菌(如表1所示),24h后僅有5個孔中的LB液體培養(yǎng)基變渾濁,其他孔中的LB液體培養(yǎng)基非常清澈,說明篩選到的23個克隆有18個具有抑制大腸桿菌生長作用。

通過構(gòu)建該突變體文庫以及對文庫中隨機30個克隆進(jìn)行質(zhì)量檢測,篩選到了18個具有抑制大腸桿菌生長作用的突變體。利用該突變體文庫,篩選以中國明對蝦抗脂多糖因子LBD結(jié)構(gòu)域為基本骨架的抗菌活性多肽比例達(dá)到18/30=60%。

表1初篩23個陽性克隆在24孔板中的分布情況

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