本發(fā)明涉及納米材料制備技術領域，更具體的是涉及一種金納米粒子偶聯辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體的制備方法。

背景技術：

近年來，隨著人們的生活方式發(fā)生了急劇變化，精神壓力也不斷增大，我國腫瘤的發(fā)病率逐年攀升。在我國部分城市和農村，惡性腫瘤已成為導致居民死亡的“第一殺手”。世界衛(wèi)生組織已經作出最新的權威性的結論，惡性腫瘤患者如果能在發(fā)病早期發(fā)現，治愈率可以達到80％以上，腫瘤的早期診斷與治療已經成為近年來研究的熱點。

血清蛋白標志物檢測腫瘤已經越來越引起人們的關注，蛋白標志物檢測腫瘤簡便無創(chuàng)，檢測結果直觀且可以定量，可以動態(tài)監(jiān)測腫瘤患者，在臨床上具有很高的應用價值。蛋白標志物可以是在惡性腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞的基因表達而合成分泌的，存在于細胞、組織或體液中，能夠用一定方法來定量且能證實腫瘤存在的物質；也可以是由于機體對腫瘤產生反應，導致體內異常產生或升高的，可以反映腫瘤存在和生長的、能夠監(jiān)測腫瘤治療和預后的一類物質，這些物質在正常人的體內不存在，或者在正常人體內出現的水平顯著低于腫瘤患者體內的水平。

甲胎蛋白是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎的肝細胞，胎兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升。但當肝細胞發(fā)生癌變時，卻又恢復了產生這種蛋白質的功能，而且隨著病情惡化它在血清中的含量會急劇增加，甲胎蛋白就成了診斷原發(fā)性肝癌的一個特異性臨床指標。辣根過氧化物酶是一種臨床檢驗試劑中一種最常用的酶之一，廣泛用于多個生化檢測項目，也廣泛運用于免疫類(ELISA)試劑盒的顯色反應。所以本文擬研制一種金納米粒子偶聯辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體的制備方法，用于檢測甲胎蛋白腫瘤標志物。

技術實現要素：

鑒于蛋白標志物在腫瘤檢測中的重要地位、HRP檢測獨特的顯色性質以及酶聯免疫檢測技術的優(yōu)勢。我們將利用金納米粒子和甲胎蛋白標記抗體以及辣根過氧化物酶的靜電吸附作用，制備多酶標記的金納米粒子甲胎蛋白免疫探針，對甲胎蛋白(alpha fetoprotein AFP)，這種廣泛存在原發(fā)性肝癌的蛋白標志物進行定性定量的檢測，建立蛋白標志物檢測的新方法，極大程度提高了檢測靈敏度。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種金納米粒子偶聯辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體的制備方法；其步驟如下：

(1)將氯金酸加入到反應器，加熱煮沸后注入檸檬酸鈉，冷卻至室溫，得到金納米粒子(AuNPs)；

(2)將上述金納米粒子加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節(jié)金納米粒子pH為8.3～8.5，將甲胎蛋白標記抗體(Ab₁)和辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米粒子混合，所得AuNPs、HRP和Ab₁混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；

(3)將牛血清白蛋白(BSA)加入到上述AuNPs、HRP和Ab₁混合液封閉處理，離心得到多酶標記AuNPs-HRP-Ab₁檢測探針。

所述步驟1)氯金酸是四水合氯金酸，氯金酸和檸檬酸鈉的質量配比為1:0.8～3。

所述步驟2)是通過碳酸鉀水溶液調節(jié)金納米粒子pH為8.3～8.5；甲胎蛋白標記抗體(Ab₁)：辣根過氧化物酶(HRP)質量配比為1:1～9；金納米粒子AuNPs：(HRP和Ab₁)混合液質量配比為100～500:1。

所述步驟3)金納米粒子：牛血清白蛋白質量配比10～20:1。

所述步驟3)AuNPs-HRP-Ab₁檢測探針為多酶標記探針，可有效提高檢測靈敏度。

如圖4所示，一個金納米粒子分子上面可以同時偶聯多個HRP分子和甲胎蛋白標記抗體分子，有效提高了酶分子和抗體分子的偶聯效率；如圖1所示本發(fā)明制備的金納米粒子粒徑為10～60nm；如圖2所示金納米粒子偶聯辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體后粒徑增加20nm左右，表明辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體已經成功標記到金納米粒子上。

如圖3金納米粒子紫外吸收光譜所示，金納米粒子吸收波長在520～550nm之間，可有效偶聯蛋白分子。如圖5所示，multi-HRP-AuNPs-Ab₁檢測探針免疫吸附實驗明顯優(yōu)于HRP-Ab₁檢測探針免疫吸附實驗，說明multi-HRP-AuNFs-Ab₁檢測探針比傳統(tǒng)的HRP-Ab₁檢測探針檢測靈敏度更高。

本發(fā)明制備的金納米粒子偶聯辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體優(yōu)勢在于：

1.采用堿性條件下金納米粒子AuNPs與甲胎蛋白標記抗體Ab₁和辣根過氧化物酶(HRP)的靜電吸附相互作用得到檢測探針。

2.金納米粒子偶聯辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體，檢測探針將同時具有免疫活性和酶催化活性。

3.金納米粒子因其豐富的比表面積，所得檢測探針為多酶標記探針，實現了納米領域的納米增強效應，可有效提高檢測靈敏度。

附圖說明

圖1本發(fā)明制備的金納米粒子AuNPs透射電鏡照片(a)14.2nm(b)25.7nm(c)25.4nm(d)48.1nm(e)58.2nm(f)67nm。

圖2本發(fā)明制備的金納米粒子以及多酶標記AuNPs-HRP-Ab₁檢測探針粒度圖片。

圖3本發(fā)明制備的金納米粒子紫外-吸收可見光光譜曲線。

圖4本發(fā)明制備的金納米粒子偶聯辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體圖。

圖5本發(fā)明制備的檢測探針multi-HRP-AuNPs-Ab₁免疫實驗和傳統(tǒng)檢測探針HRP-Ab₁免疫實驗擬合曲線。

具體實施方式

下面的實施案例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

實施案例1：

(1)將0.01g氯金酸加入到反應器，加熱煮沸后注入0.018g檸檬酸鈉，冷卻至室溫，得到金納米粒子(AuNPs)；

(2)將5mg上述金納米粒子加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節(jié)金納米粒子pH為8.3，將0.025mg甲胎蛋白標記抗體(Ab₁)和0.025mg辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米粒子混合，所得AuNPs、HRP和Ab₁混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；

(3)將0.5mg牛血清白蛋白(BSA)加入到上述AuNPs、HRP和Ab₁混合液封閉處理，離心得到多酶標記AuNPs-HRP-Ab₁檢測探針。multi-HRP-AuNPs-Ab₁檢測探針在96孔酶標板完成免疫吸附實驗ELISA，選取AFP抗原濃度分別0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、2.5ng/mL、3ng/mL、3.5ng/mL和4ng/mL。

圖1(a)所示所得金納米粒子粒徑為14.2nm；圖2粒度數據顯示，金納米粒子偶聯HRP酶和甲胎蛋白標記抗體分子前后粒度由15nm增加到35nm左右，說明辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體已經成功標記到金納米粒子上；圖3顯示所得金納米粒子在520nm處有強烈紫外吸收。如圖5所示，multi-HRP-AuNPs-Ab₁檢測探針免疫吸附實驗明顯優(yōu)于HRP-Ab₁檢測探針免疫吸附實驗，說明multi-HRP-AuNFs-Ab₁檢測探針比傳統(tǒng)的HRP-Ab₁檢測探針檢測靈敏度更高。

實施案例2：

(1)將0.01g氯金酸加入到反應器，加熱煮沸后注入0.02g檸檬酸鈉，冷卻至室溫，得到金納米粒子(AuNPs)；

(2)將5mg上述金納米粒子加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節(jié)金納米粒子pH為8.3，將0.01mg甲胎蛋白標記抗體(Ab₁)和0.04mg辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米粒子混合，所得AuNPs、HRP和Ab₁混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；

(3)將0.5mg牛血清白蛋白(BSA)加入到上述AuNPs、HRP和Ab₁混合液封閉處理，離心得到多酶標記AuNPs-HRP-Ab₁檢測探針。

圖1(b)所示所得金納米粒子粒徑為25.7nm；圖3顯示所得金納米粒子在526nm處有強烈紫外吸收。

實施案例3：

(1)將0.01g氯金酸加入到反應器，加熱煮沸后注入0.03g檸檬酸鈉，冷卻至室溫，得到金納米粒子(AuNPs)；

(2)將5mg上述金納米粒子加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節(jié)金納米粒子pH為8.4，將0.005mg甲胎蛋白標記抗體(Ab₁)和0.045mg辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米粒子混合，所得AuNPs、HRP和Ab₁混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；

(3)將0.5mg牛血清白蛋白(BSA)加入到上述AuNPs、HRP和Ab₁混合液封閉處理，離心得到多酶標記AuNPs-HRP-Ab₁檢測探針。

圖1(c)所示所得金納米粒子粒徑為35.4nm；圖3顯示所得金納米粒子在530nm處有強烈紫外吸收。

實施案例4：

(1)將0.01g氯金酸加入到反應器，加熱煮沸后注入0.008g檸檬酸鈉，冷卻至室溫，得到金納米粒子(AuNPs)；

(2)將5mg上述金納米粒子加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節(jié)金納米粒子pH為8.4，將0.01mg甲胎蛋白標記抗體(Ab₁)和0.01mg辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米粒子混合，所得AuNPs、HRP和Ab₁混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；

(3)將0.4mg牛血清白蛋白(BSA)加入到上述AuNPs、HRP和Ab₁混合液封閉處理，離心得到多酶標記AuNPs-HRP-Ab₁檢測探針。

圖1(d)所示所得金納米粒子粒徑為48.1nm；圖3顯示所得金納米粒子在534nm處有強烈紫外吸收。

實施案例5：

(1)將0.01g氯金酸加入到反應器，加熱煮沸后注入0.01g檸檬酸鈉，冷卻至室溫，得到金納米粒子(AuNPs)；

(2)將5mg上述金納米粒子加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節(jié)金納米粒子pH為8.5，將0.005mg甲胎蛋白標記抗體(Ab₁)和0.005mg辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米粒子混合，所得AuNPs、HRP和Ab₁混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；

(3)將0.25mg牛血清白蛋白(BSA)加入到上述AuNPs、HRP和Ab₁混合液封閉處理，離心得到多酶標記AuNPs-HRP-Ab₁檢測探針。

圖1(e)所示所得金納米粒子粒徑為58.2nm；圖3顯示所得金納米粒子在540nm處有強烈紫外吸收。

實施案例6：

(1)將0.01g氯金酸加入到反應器，加熱煮沸后注入0.018g檸檬酸鈉，冷卻至室溫，得到金納米粒子(AuNPs)；

(2)將5mg上述金納米粒子加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節(jié)金納米粒子pH為8.5，將0.01mg甲胎蛋白標記抗體(Ab₁)和0.04mg辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米粒子混合，所得AuNPs、HRP和Ab₁混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；

(3)將0.25mg牛血清白蛋白(BSA)加入到上述AuNPs、HRP和Ab₁混合液封閉處理，離心得到多酶標記AuNPs-HRP-Ab₁檢測探針。

圖1(f)所示所得金納米粒子粒徑為67.0nm；圖3顯示所得金納米粒子在550nm處有強烈紫外吸收。