本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標(biāo)記及其鑒定方法。

背景技術(shù)：

香蕉是位于水稻、小麥、玉米之后的世界第四糧食作物，也是僅次于柑桔的第二大宗水果，更是世界水果貿(mào)易量最大宗的鮮果。香蕉枯萎病是香蕉的毀滅性病害，也是重要的檢疫性病害。1967年以來(lái)，我國(guó)在臺(tái)灣首次發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病4號(hào)小種之后，擴(kuò)散到澳大利亞、非洲和部分亞洲國(guó)家，引起國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注。在國(guó)內(nèi)廣東、廣西、福建、海南、云南等主要香蕉產(chǎn)區(qū)也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)枯萎病，并成為香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙(游春平等，2008，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，27(3):363-366)。香蕉枯萎病是一種土傳病害，通過(guò)化學(xué)防治和農(nóng)業(yè)防治都不能有效地防控此病。種植香蕉抗枯萎病品種是有效的途徑，同時(shí)也不會(huì)增加栽培成本。因此，香蕉抗枯萎病新品種選育是當(dāng)前香蕉產(chǎn)業(yè)中重要的環(huán)節(jié)。

目前生產(chǎn)上應(yīng)用的栽培蕉多數(shù)為三倍體(2n＝3x＝33)，具有單性結(jié)果，多倍性、高度不育、沒(méi)有種子等特性，這為香蕉的常規(guī)雜交育種帶來(lái)了極大的困難，抗病育種就更困難了。目前香蕉新品種選育途徑主要是田間變異、組織培養(yǎng)變異利用、化學(xué)誘變等，但由于變異率較低，其中有用的變異率更低，篩選需要的人力物力大，選育周期長(zhǎng)，效率低，這就造成了香蕉品種更新慢，病蟲(chóng)害高發(fā)的現(xiàn)狀。

隨著當(dāng)今生物技術(shù)的迅速發(fā)展，包括分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)、基因工程育種技術(shù)、基因組測(cè)序技術(shù)等在許多植物育種中得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了顯著成效。香蕉的生物技術(shù)研究起步相對(duì)較晚，進(jìn)展緩慢，在香蕉抗枯萎病分子生物技術(shù)方面，也只有少量研究，研究者從不同的香蕉抗枯萎病(4號(hào)小種)材料中，獲得了多個(gè)抗病基因類(lèi)似物(RGAS)，并進(jìn)行了分析(孟祥春，2007，分子植物育種，S1:57-60；徐金剛，2008，生物技術(shù)通報(bào)，S1：200-209；陳雅平，2007，植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，06：567-573)。謝江輝(2008)等公開(kāi)了兩對(duì)引物，主要應(yīng)用于“威廉斯”香蕉的芽變植株的抗病性鑒定。香蕉的枯萎病抗病機(jī)理較為復(fù)雜，抗病相關(guān)的基因很多，目前能夠直接有效的用于香蕉育種中分子手段還比較少，因此急需加快香蕉的抗病生物育種技術(shù)開(kāi)發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一在于提供種一種鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標(biāo)記；

本發(fā)明的目的之二是提供了所述SCAR分子標(biāo)記鑒定香蕉枯萎病的方法；

本發(fā)明的目的之三是提供了所述鑒定的范圍。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標(biāo)記，該標(biāo)記來(lái)源于SRAP分子標(biāo)記me6-em1擴(kuò)增的一條829bp的特異條帶,其序列序列為：

tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc。

所述鑒定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子標(biāo)記，條帶長(zhǎng)度為324bp，從原特異條帶的第216bp至第539bp。

所述SCAR標(biāo)記可以準(zhǔn)確鑒定香牙蕉品種對(duì)香蕉枯萎病的抗性。

用所述SCAR分子標(biāo)記鑒定香蕉枯萎病的方法：

(1)、提取香蕉葉片DNA；

(2)、用SCAR標(biāo)記的特異引物SC1/SC2進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)；

(3)、檢測(cè)：結(jié)果表現(xiàn)為324bp特異條帶的有無(wú)；有特異條帶擴(kuò)增即對(duì)香蕉枯萎抗性為感病，未有條帶擴(kuò)增，即對(duì)香蕉枯萎抗性為抗病。

其中，所述用SCAR標(biāo)記的特異引物SC1/SC2序列為：

正向引物SC1：5’-CTCGCCGACACCTTACTTGA-3’

反向引物SC2：5’-AGGAGAGTCCAGCTCCAGTT-3’。

較佳地，所述擴(kuò)增方法為：

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35次；72℃延伸7min。

PCR體系：25μl的反應(yīng)體積含有10×buffer(含Mg²⁺)2.5ul，0.2mmol/L dNTPs(2.5nM)2ul，上下引物(10umol/L)分別1ul，DNA(50ng/L)1ul及1.5U TaqDNA聚合酶。

較佳地，所檢測(cè)方法為：采用1.2％的瓊脂糖凝膠，110v電壓電泳25分鐘，紫外燈下觀察。

本發(fā)明利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出香蕉枯萎病感病品種特有的條帶，根據(jù)該條帶的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行特異性擴(kuò)增，轉(zhuǎn)化成SCAR分子標(biāo)記。用于鑒定香牙蕉品種的香蕉枯萎病抗感病性，為香蕉抗病新品種選育提供分子輔助技術(shù)，進(jìn)一步可用于以香蕉組培苗、香蕉田間變異株系以及化學(xué)誘變后代等為篩選群體的香蕉新品種(系)的輔助篩選。其中，SCAR(sequence characterized amplified regions特定序列擴(kuò)增)標(biāo)記通常是由RAPD、SRAP、SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)化而來(lái)。一般表現(xiàn)為擴(kuò)增片斷的有無(wú)，是一種顯性標(biāo)記，當(dāng)擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)部發(fā)生少數(shù)堿基的插入、缺失、重復(fù)等變異時(shí)，表現(xiàn)為共顯性遺傳的特點(diǎn)。具有方便、快捷、可靠，可以快速檢測(cè)大量個(gè)體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明與傳統(tǒng)的盆栽接種鑒定、水培接種鑒定、病地種植鑒定相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：可以在香蕉的任何生長(zhǎng)期進(jìn)行鑒定、周期短、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性，重復(fù)性好、鑒定的是香蕉基因的變異，遺傳穩(wěn)定性好、不受環(huán)境影響。

附圖說(shuō)明

圖1：引物me6-em1對(duì)16個(gè)香牙蕉樣品的PCR擴(kuò)增。M：2000bp marker：1-8，13號(hào)樣品(抗病品種)：東蕉1號(hào)、G6-2、BXM51、農(nóng)科1號(hào)、抗枯1號(hào)、南天黃、南天青、粵科1號(hào)、科2；9-12，14-16號(hào)樣品(感病品種)：WS2、L1N2、L3-3、G20-5、巴西蕉、G30、NK4-1。

圖2：引物SC1-SC2擴(kuò)增條件優(yōu)化。M：2000bp marker：1-10號(hào)樣品分別為：巴西、NK、G30、L3-3、WS2、南天青、東蕉1號(hào)、農(nóng)科一號(hào)、粵科1號(hào)、抗枯1號(hào)。

圖3：引物SC1-SC2對(duì)抗感病香蕉品種的擴(kuò)增。M：2000bp marker：1-24號(hào)樣品分別為：索馬里香蕉、天寶矮蕉、威廉斯、龍州中把、粗把香牙蕉、G6-2、粵科1號(hào)、農(nóng)科1號(hào)、抗枯5號(hào)、漳選8-1、廣東2號(hào)、東莞高把香蕉、齊尾、紅河矮蕉、浦北矮蕉、墨西哥香蕉、東莞中把香蕉、河口高把香蕉、荷蘭香蕉、北大矮、那龍中把香蕉、南天黃、BXM51、科2。

圖4：序列比對(duì)結(jié)果。

具體的實(shí)施方式

通過(guò)以下實(shí)例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明與定義而并非限制。通過(guò)實(shí)例，科研人員可以對(duì)本發(fā)明有更清楚的了解，可以在此基礎(chǔ)上對(duì)本發(fā)明做出一定的變更和修改，以獲得不同的研究效果。下述實(shí)例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及到的試劑均為常規(guī)試劑，使用均參照產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)使用。

一、香蕉葉片的DNA提取

選取香蕉枯萎病抗性不同的香牙蕉(基因型為AAA)品種(表1)，分別進(jìn)行DNA提取。

DNA提取方法采用改良CTAB法，具體操作如下：

1、香蕉的DNA提取，采用香蕉的葉片，選取沒(méi)有病蟲(chóng)害的新抽出的嫩葉，用水沖洗干凈，晾干后取0.2克，用液氮進(jìn)行研磨，研磨的過(guò)程中加入少量交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，將葉片快速研磨至粉末狀。

2、在研磨好的樣品中加入800μl的預(yù)熱好的4*CTAB，混勻，65℃水浴30min，期間輕搖樣品3次，12000rpm離心10min。

3、加入600μl氯仿-異戊醇(24:1)，混勻，12000rpm離心6min。

4、吸取上清，重復(fù)步驟3，進(jìn)行第二次抽提。

5、吸取上清，加入等體積的異丙醇(-20℃預(yù)冷)，室溫靜置5min，12000rpm離心10min。

6、棄上清，用75％預(yù)冷的乙醇漂洗2次。

7、真空抽干，加入50μlTE緩沖液，常溫溶解，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

通過(guò)以上改良CTAB法提取香蕉葉片DNA，采用BioDropμLite(超微量蛋白核酸分析儀)檢測(cè)其濃度和純度，DNA濃度可達(dá)到80-150ng.μL^-1，OD260/OD280＝1.8-2.0，質(zhì)量較好，符合試驗(yàn)要求。

表1香蕉抗感病品種資源表

注：“田間香蕉枯萎病抗性表現(xiàn)”為本單位在田間多年種植后田間觀察的結(jié)果。

二、香蕉枯萎病感病品種特異條帶SRAP標(biāo)記的擴(kuò)增

采用SRAP引物me6-em1對(duì)16個(gè)香蕉品種的擴(kuò)增，將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢，在凝膠成像儀中觀察并照相，WS2(條帶弱)、巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3、L1N2和G20-5七個(gè)品種產(chǎn)生800bp左右的特異條帶(圖1)，在紫外燈下分別切下這七個(gè)品種的特異條帶，利用凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收，純化。

采用的SRAP引物序列為：me6：5′-TGAGTCCAAACCGGGAC-3′

em1：5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-le PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行：PCR反應(yīng)體系為25μl，含有10×buffer(含Mg2+)2.5ul，0.2mmol/L dNTPs(2.5nM)2ul，上下引物(10umol/L)分別1ul，DNA(50ng/L)1ul及1.5U TaqDNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35次；72℃延伸7min。。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，加入4ul 6×loading buffer，取8～10μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.8％瓊脂糖凝膠中電泳，電極緩沖液為0.5×TBE。

三、香蕉枯萎病感病品種特異條帶的回收測(cè)序

將800bp左右的特異條帶在紫外燈下切下，采用Tiangel Midi purification kit試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物回收。對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將回收產(chǎn)物送樣至賽墨飛世爾科技(中國(guó))有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后得到四個(gè)品種：巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3(WS2、G20-5、L1N2這個(gè)品種由于回收濃度低測(cè)序未成功)的該片段的核苷酸序列：

巴西蕉的序列(829bp)：

tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc

G30的序列(829bp)：

tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc

NK4-1的序列(829bp)：

tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc

L3-3的序列(829bp)：

tcaacttcagctactacctttcctcacttgagaacaggaacaccagatttagactgcttctcttacctagggctcatctaacttcatttctttgataccggagaattaggctaatctcactctggcaacaatgcatttcaccctgctatgctagcaactatgaattgaaccctgctggcaacagctactgaattgaactcagtacttattgcttcctcgccgacaccttacttgataactggaacaggagtgagttccaaagtcaactatacactacttatactagaatactaagttgcaggggagctacactaatcattccactctaacaagaacaggggcaagcgtatactttatggttgaaggcttagactcaccagtataattctgatcttagtactagagcttctgggaattaatacctttagactagacaaactaccctctacccaccaagcgtatactagacaaggagacaagcaacgagacccctactgtgaacttgaattctcactttcgaactggagctggactctccttcttacttaacagcttccctggcttcttctcagatcttatactcctaactctagtatcggtattataacactcctttcactccggactcctgtattggtatagtactagcaggggcaataactagactttcatagcttaccaacttactagaaaggcctcttctcaccatactttatcactgctggaactagccctggactctaatctacctcaggggcaacgagacccctcggtatgaaacttcaagctggaaactaaacctctactctatcaactaattctgtcactc

四、香蕉枯萎病感病品種特異條帶的序列分析

將回收測(cè)序獲得的巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3的序列在聚類(lèi)分析軟件MAGE6.0中進(jìn)行排列比對(duì)，從圖4看，巴西蕉、G30、NK4-1、L3-3的序列是一致的。

五、香蕉枯萎病感病SCAR引物的設(shè)計(jì)及其擴(kuò)增條件篩選

利用引物在線設(shè)計(jì)工具NCBI/primer-BLAST，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了4對(duì)引物(引物序列見(jiàn)表2)，利用巴西、NK、G30、L3-3、WS2、南天青、東蕉1號(hào)、農(nóng)科一號(hào)、粵科1號(hào)、抗枯1號(hào)這十個(gè)品種進(jìn)行引物篩選。

表2SCAR引物序列表

經(jīng)過(guò)PCR程序及PCR體系的優(yōu)化，其中引物SC1-SC2，擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度為324bp，從原特異條帶的第216bp至第539bp。這對(duì)引物擴(kuò)增后目的條帶清晰(圖2)，其中感病品種：巴西、NK、G30、L3-3、WS2擴(kuò)增出了324bp的目標(biāo)條帶，抗病品種：南天青、東蕉1號(hào)、農(nóng)科一號(hào)、粵科1號(hào)、抗枯1號(hào)無(wú)目標(biāo)條帶，且無(wú)其他雜帶，符合試驗(yàn)要求。

其最優(yōu)的PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸7min，循環(huán)35次；72℃延伸10min。

其最優(yōu)的PCR體系：20μl的反應(yīng)體積含有10×buffer(含Mg²⁺)2ul，0.2mmol/L dNTPs(2.5nM)2ul，上下引物(10umol/L)分別1ul，DNA(50ng/L)1ul及1U TaqDNA聚合酶

在1.2％的瓊脂糖凝膠上，110v電壓電泳25分鐘后在凝膠成像儀照相。

六、香蕉枯萎病抗病SCAR標(biāo)記的準(zhǔn)確性檢測(cè)

采用選定的SCAR引物SC1-SC2，擴(kuò)大群體來(lái)驗(yàn)證標(biāo)記的準(zhǔn)確性，供試的香牙蕉品種：索馬里香蕉、天寶矮蕉、威廉斯、龍州中把、粗把香牙蕉、G6-2、粵科1號(hào)、農(nóng)科1號(hào)、抗枯5號(hào)、漳選8-1、廣東2號(hào)、東莞高把香蕉、齊尾、紅河矮蕉、浦北矮蕉、墨西哥香蕉、東莞中把香蕉、河口高把香蕉、荷蘭香蕉、北大矮、那龍中把香蕉、南天黃、BXM51、科2(品種對(duì)香蕉枯萎病的抗性見(jiàn)表1)等24個(gè)品種。從圖3看檢測(cè)結(jié)果：索馬里香蕉、天寶矮蕉、威廉斯、龍州中把、粗把香牙蕉、漳選8-1、廣東2號(hào)、東莞高把香蕉、齊尾、紅河矮蕉、浦北矮蕉、墨西哥香蕉、東莞中把香蕉、河口高把香蕉、荷蘭香蕉、北大矮、那龍中把等17個(gè)香蕉品種有324bp的目的條帶，而G6-2、粵科1號(hào)、農(nóng)科1號(hào)、抗枯5號(hào)、南天黃、BXM51、科2等7個(gè)香蕉品種沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，該結(jié)果與品種田間種植對(duì)香蕉枯萎病的抗性是一致的。

可見(jiàn)，發(fā)明人設(shè)計(jì)的SCAR引物SC1-SC2可以鑒定不同香牙蕉品種對(duì)香蕉枯萎病的抗性。

上述實(shí)施例，只是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用來(lái)限制本發(fā)明實(shí)施范圍，故凡以本發(fā)明權(quán)利要求所述的特征及原理所做的等效變化或修飾，均應(yīng)包括在本發(fā)明權(quán)利要求范圍之內(nèi)。