本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量的
技術(shù)領(lǐng)域：
：，尤其是指一種用于生物(包括細(xì)菌、真菌、植物、藻類等)蛋白質(zhì)定量和示蹤的N15穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法。
背景技術(shù)：
：：生物體內(nèi)蛋白質(zhì)定量分析已成為研究蛋白質(zhì)功能和尋求疾病蛋白標(biāo)記物和藥物靶標(biāo)的重要途徑。目前蛋白質(zhì)定量技術(shù)主要是同位素標(biāo)記的質(zhì)譜定量方法。同位素代謝標(biāo)記法是同位素標(biāo)記法中的一種，是目前蛋白質(zhì)定量技術(shù)首選方法，它是以同位素元素或同位素標(biāo)記氨基酸形式摻入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，在細(xì)胞生長代謝過程中完成蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記。在同位素代謝標(biāo)記方法的產(chǎn)品中，哺乳動物細(xì)胞穩(wěn)定同位素試劑盒(SILAC)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)定量研究中，也有少量的N15化合物標(biāo)記應(yīng)用于植物蛋白質(zhì)組學(xué)和酵母體內(nèi)蛋白質(zhì)定量研究中。SILAC(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)是哺乳動物細(xì)胞穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記技術(shù)，其基本原理是采用含有輕、中或重型外源穩(wěn)定同位素氨基酸(主要有Lys和Arg)加入培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞在新合成的蛋白質(zhì)中嵌合了同位素氨基酸，經(jīng)過培養(yǎng)5-6代后(26)，細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)基本98％以上的蛋白質(zhì)被同位素標(biāo)記。通過不同條件處理，取等量不同處理條件下蛋白質(zhì)混合，之后經(jīng)過SDS-PAGE分離和質(zhì)譜分析，通過比較一級質(zhì)譜圖中同位素峰型的面積大小進(jìn)行相對定量，同時二級譜圖鑒定蛋白質(zhì)。SILAC有明顯的局限性，其情況如下：1、應(yīng)用范圍小。SILAC試劑盒僅適用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)，是通過氨基酸Lys和Arg的C13的同位素標(biāo)記而實現(xiàn)蛋白質(zhì)定量，定量適用條件是：生物體內(nèi)不能通過其它途徑合成Lys和Arg氨基酸，也就是說，生物體Lys和Arg氨基酸唯一來源于外界供給。然而一些生物可以通過其它途徑(或不需要外界供給Lys和Arg)合成氨基酸,如部分細(xì)菌可以通過其它途徑合成氨基酸，也就是，常用氨基酸標(biāo)記方法很難實現(xiàn)細(xì)菌蛋白質(zhì)定量研究，細(xì)菌蛋白質(zhì)組急需要一種元素級別的標(biāo)記定量方法。因此，發(fā)展用于大多數(shù)生物的培養(yǎng)和蛋白質(zhì)元素級別的同位素標(biāo)記定量方法，即N15穩(wěn)定同位素代謝培養(yǎng)基(或試劑盒)有很高實用價值和應(yīng)用前景。2、操作繁瑣。SILAC定量流程包括：細(xì)胞培養(yǎng)→蛋白提取→免疫沉淀→電泳分離→酶切消化→質(zhì)譜檢測→定量檢測，操作復(fù)雜，原代細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)記效率低，不方便實施。3、試驗成本高。SILAC試劑非常昂貴。4、試驗周期長。由于SILAC需要在進(jìn)行培養(yǎng)的過程中添加標(biāo)記，所以需要比較長的時間才能比較徹底地標(biāo)記。雖然整個實驗的時間主要取決于細(xì)胞生長的速率和所采用的各種樣品處理步驟，但一般來說，SILAC實驗從開始到結(jié)束，包括數(shù)據(jù)分析，大約需要20到25天。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于生物(包括細(xì)菌、真菌、植物、藻類等)蛋白質(zhì)定量和示蹤的N15穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，該方法的可應(yīng)用生物種類多，操作簡便，試驗成本低，試驗周期短，利于人們高效、低成本對大量樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案為：一種用于生物蛋白質(zhì)定量和示蹤的N15穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，首先，利用酵母將N15無機(jī)鹽轉(zhuǎn)化成生物蛋白，當(dāng)酵母培養(yǎng)代數(shù)達(dá)到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，然后再將酵母中提取高純度N15蛋白轉(zhuǎn)化成N15酵母蛋白胨，利用N15蛋白胨取代常規(guī)的N14蛋白胨，用于培養(yǎng)多種生物，為生物蛋白質(zhì)標(biāo)記定量和示蹤提供特異性的N15同位素標(biāo)記；其包括以下步驟：1)使用只含N15(不含N14)的無機(jī)培養(yǎng)基對酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)；2)酵母細(xì)胞的裂解；3)N15酵母蛋白的粗提；4)N15生物培養(yǎng)基的配制，即是將步驟3)中粗提后產(chǎn)生的N15蛋白胨作為培養(yǎng)基的基本原料，取代常規(guī)的N14蛋白胨用于培養(yǎng)，再加入不含N的無機(jī)鹽物質(zhì)，制成最終的N15生物培養(yǎng)基。在步驟1)中，酵母將培養(yǎng)基中的N15無機(jī)鹽轉(zhuǎn)化成生物蛋白，當(dāng)酵母培養(yǎng)代數(shù)達(dá)到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，而實際操作中可以根據(jù)最終配制的生物培養(yǎng)基選擇不同的酵母菌和只含N15(不含N14)的無機(jī)培養(yǎng)基配方。下面列出兩個例子：例子1:實驗材料：畢赤酵母x-33基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：M9母液：64gNa2HPO4,15gKH2PO4,2.5gNacl，5gN15H4cl加入1L水滅菌。取M9母液200mL加入水700mL,加入2mL1mol/L已滅菌的MgSO4，100uL已滅菌的1mol/LCacl2(可加可不加)，在M9基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加0.5％葡萄糖和30ug/mL的鏈霉素。YPD培養(yǎng)基:10g酵母粉，20g蛋白胨，2％的葡萄糖，添加30ug/mL的鏈霉素。裂解緩沖液(pH7.4):①50mM(pH7.4)磷酸鹽緩沖液(PhosphateBuffer,PB)②1mMMPSF。例子2：實驗材料：產(chǎn)胱酵母、釀酒酵母基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：M9母液：64gNa2HPO4，15gKH2PO4，2.5gNacl，5gN15H4cl加入1L水滅菌。取M9母液200mL加入水700mL，加入2mL1mol/L已滅菌的MgSO4，100uL已滅菌的1mol/LCacl2(可加可不加)，在M9基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中添加0.5％葡萄糖和30ug/mL的鏈霉素。YPD培養(yǎng)基：10g酵母粉，20g蛋白胨，2％葡萄糖，30ug/mL鏈霉素。溶解10g酵母粉，20g蛋白胨于900ml水中，(如制平板加入20g瓊脂粉)，高壓蒸汽滅菌，加入100ml20g葡萄糖，(葡萄糖溶液滅菌后加入)。注意：葡萄糖，酵母粉，蛋白胨溶液混合后在高溫下可能會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基成分變化，所以要分別滅菌后再混合。葡萄糖可以過濾除菌，也可以115℃15min滅菌。在步驟2)中，酵母細(xì)胞的裂解具體是采用玻璃珠破碎法或液氮研磨法。下面對這兩種方法進(jìn)行闡述：采用玻璃珠破碎法時，步驟如下：1)挑取酵母菌單菌落在液體YPD培養(yǎng)基中，放入搖床27-33℃，190-210rpm培養(yǎng)1-3天。2)按1％-3％的接種量取發(fā)酵液，6000-8000rpm，4-6min離心，取上清，0.6％-0.10％Nacl溶液洗滌倆次，接種于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，27-33℃，190-210rpm，搖5-7天。3)將發(fā)酵好的發(fā)酵液離心7000-9000rpm，9-11min，去上清，蒸餾水洗滌倆次，加入1-3mL的裂解緩沖液，然后加入等體積的滅過菌的酸化玻璃珠，漩渦震蕩1-3min，冰浴1-3min，18-26次(鏡檢檢測破碎程度)。4)2700-3000rpm，9-11min離心，分為兩個部分：上清液和沉淀物，沉淀物放入研缽，加入酸化后的石英砂或玻璃珠及液氮研磨，研磨后加入4.5-7.5mol/L的Hcl溶液，混勻，300-700rpm離心，去除石英砂及玻璃珠；上清液加入具塞試管中，加入等體積的HCl,約為4.5-7.5mol/L的HCl溶液。采用液氮研磨法時，步驟如下：1)挑取酵母菌單菌落在液體YPD培養(yǎng)基中，放入搖床27-33℃，190-210rpm培養(yǎng)1-3天。2)按1％-3％的接種量取發(fā)酵液，6000-8000rpm，4-6min離心，取上清，0.6％-1.0％Nacl溶液洗滌兩次，接種于N15基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，27-33℃，150-250rpm，搖床培養(yǎng)4-8天。3)3500-5000rpm，離心25-35min，用0.3％-0.7％的Na2CO3溶液對酵母菌洗滌兩次脫嗅。4)破壁(用液氮研磨)：離心收菌體，稱濕重，用TGEbuffer懸浮菌體，重量(g))：buffer體積(毫升)＝1：1--1：2。用注射器將菌液加入液氮中，控制加入速度，使得菌液進(jìn)入液氮中后形成小顆粒，太快容易結(jié)成塊。將菌體液氮顆粒轉(zhuǎn)入高速打碎器，約2-3萬轉(zhuǎn)/分破碎1分鐘，菌體顆粒應(yīng)該成粉末狀。倒出粉末，水浴融化后，再用注射器加入液氮中，重復(fù)上述步驟，重復(fù)3次。高速離心收上清，上清中含目標(biāo)蛋白。在步驟3)中，N15酵母蛋白的粗提即是提取步驟2)中裂解的酵母細(xì)胞中的蛋白，蛋白質(zhì)中氨基酸的N元素均為N15，而N15酵母蛋白的粗提具體是采用蛋白質(zhì)半水解法(酸解)或酵母自溶法(利用自身酶解蛋白)。下面對這兩種方法進(jìn)行闡述：采用蛋白質(zhì)半水解法(酸解)時，步驟如下：1)把5-7mol/L的Hcl溶液裝入具塞玻璃管后，加入液氮，試管中的空氣，密封后放入約110℃的烘箱，酸解8-10個小時；2)酸解后取出，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH；3)放入80-90℃的烘箱干燥，1-2h烘干，獲取N15蛋白胨，其物質(zhì)分子量大概在600-300Da的肽段。采用酵母自溶法(利用自身酶解蛋白)時，步驟如下：1)自溶：加0.5％-1.5％Nacl溶液攪拌，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％-15％的酵母懸液，調(diào)節(jié)pH5.5-6.5，溫度40-55℃，調(diào)節(jié)時間24-28h；2)滅酶活，溫度80-90℃，0.5-1h；3)離心，3500-5000rpm，25-35min，去沉淀；4)真空濃縮，真空度0.09-0.093MPa，溫度50-60℃。在步驟4)中，可以依據(jù)情況配制N15細(xì)菌培養(yǎng)基、N15真菌培養(yǎng)基、N15植物培養(yǎng)基、N15藻類培養(yǎng)基等，最終制備的培養(yǎng)基中N元素全部來源于步驟3)中粗提后蛋白胨的N15，利用N15蛋白胨取代常規(guī)的N14蛋白胨用于培養(yǎng)生物，為生物蛋白質(zhì)標(biāo)記定量和示蹤提供特異性的N15同位素標(biāo)記，而無機(jī)鹽和培養(yǎng)基的具體制作條件要根據(jù)不同生物的生長特征而定。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)與有益效果：1、應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明是一種適用于大多數(shù)生物(包括細(xì)菌、真菌、植物、藻類等)的培養(yǎng)和蛋白質(zhì)元素級別的同位素標(biāo)記定量方法，即N15穩(wěn)定同位素代謝培養(yǎng)基(或試劑盒)的制備方法，利用酵母將N15無機(jī)鹽轉(zhuǎn)化成生物蛋白，當(dāng)酵母培養(yǎng)代數(shù)達(dá)到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，再將酵母中提取高純度N15蛋白轉(zhuǎn)化成N15酵母蛋白胨，利用N15蛋白胨取代常規(guī)的N14蛋白胨，可用于培養(yǎng)多種生物，為生物蛋白質(zhì)標(biāo)記定量和示蹤提供特異性的N15同位素標(biāo)記，具有很高實用價值和應(yīng)用前景。2、操作簡便。省去細(xì)胞培養(yǎng)、免疫沉淀、電泳分離、酶切消化等步驟，方便實施。3、試驗成本低。本發(fā)明所用試劑和材料大多是普通試劑和材料，成本低。4、試驗周期短。省去細(xì)胞培養(yǎng)等步驟，一般來說，實驗從開始到結(jié)束，包括數(shù)據(jù)分析，大約需要8到15天。具體實施方式下面結(jié)合多個具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例1(N15細(xì)菌培養(yǎng)基的制備)本實施例所述的用于生物蛋白質(zhì)定量和示蹤的N15穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，具體是N15穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：1)使用只含N15(不含N14)的無機(jī)培養(yǎng)基對酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)；此處采用畢赤酵母x-33和基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(M9母液)；2)采用玻璃珠破碎法進(jìn)行酵母細(xì)胞的裂解；3)采用蛋白質(zhì)半水解法(酸解)進(jìn)行N15酵母蛋白的粗提；4)N15細(xì)菌培養(yǎng)基的配制，即是將步驟3)中粗提后產(chǎn)生的N15蛋白胨作為培養(yǎng)基的基本原料，取代常規(guī)的N14蛋白胨用于培養(yǎng)，再加入不含N的無機(jī)鹽物質(zhì)，制成最終的N15細(xì)菌培養(yǎng)基。1、培養(yǎng)基配方的探索：按以下配方配制1L的培養(yǎng)基7號培養(yǎng)基：酵母粗提蛋白15-25g/L，1-3％的葡萄糖培養(yǎng)基成分可以根據(jù)具體細(xì)菌品種不同而調(diào)整其成分和比例。本實施實例采用1-6號培養(yǎng)基蛋白胨質(zhì)量分別為20g,15g,8g,3g,1g,0.1g；葡萄糖都為2％，7號培養(yǎng)基：酵母粗提蛋白20g/L，2％的葡萄糖。2、培養(yǎng)菌種3、分別將以上菌種接種于1-6號培養(yǎng)基，150-250rpm，25-35℃培養(yǎng)，每天測其OD值，繪制生長曲線，注意達(dá)到最大生長量的OD值及天數(shù)或者培養(yǎng)時間。本實施實例采用200rpm，30℃培養(yǎng)。4、將以上菌種接種于7號培養(yǎng)基，150-250rpm，25-35℃培養(yǎng)，每天測其OD值，繪制生長曲線，注意達(dá)到最大生長量的OD值及天數(shù)或者培養(yǎng)時間。本實施實例采用200rpm，30℃培養(yǎng)。5、整理數(shù)據(jù)，根據(jù)不同的菌屬設(shè)計不同的培養(yǎng)配方，主要是替代細(xì)菌培養(yǎng)基中氮源。實施例2(N15真菌培養(yǎng)基的制備)與實施例1不同的是本實施例的步驟1)采用產(chǎn)胱酵母、釀酒酵母和基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(M9母液)，其步驟2)采用液氮研磨的方法進(jìn)行酵母細(xì)胞的裂解，其步驟3)采用酵母自溶法(利用自身酶解蛋白)進(jìn)行N15酵母蛋白的粗提，最終步驟4)制得N15真菌培養(yǎng)基。N15真菌培養(yǎng)基的配制注：①FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、MgSO4.7H2O配成高濃度的母液，滅菌后按量加入培養(yǎng)基中；②葡萄糖配成母液，滅菌后按量加入培養(yǎng)基中。無機(jī)鹽種類可以根據(jù)具體真菌品種不同而調(diào)整其成分和比例。本實施實例采用FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、Na2HPO4.12H2O、粗提蛋白、葡萄糖、MgSO4.7H2O濃度分別為0.05g/L、0.1g/L、2.0g/L、8.0g/L、20g/L、0.3g/L。實施例3(N15植物培養(yǎng)基的制備)與實施例1不同的是本實施例的步驟4)最終制作N15植物培養(yǎng)基，具體步驟如下：1)使用只含N15(不含N14)的無機(jī)培養(yǎng)基對酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)；此處可采用畢赤酵母x-33和和基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(M9母液)；2)采用玻璃珠破碎法進(jìn)行酵母細(xì)胞的裂解；3)采用蛋白質(zhì)半水解法(酸解)進(jìn)行N15酵母蛋白的粗提；4)N15植物培養(yǎng)基的配制：下面培養(yǎng)基的蛋白胨來自步驟3)中N15酵母蛋白的粗提。N15植物培養(yǎng)基的配制：注：①FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、KH2PO4、Na—EDTA、MgSO4.7H2O配成高濃度的母液，滅菌后按量加入培養(yǎng)基中。②葡萄糖配成母液，滅菌后按量加入培養(yǎng)基中。③土壤浸出液含有鐵、錳、銅、鋅等藻類需要的微量元素，不含N元素。無機(jī)鹽種類可以根據(jù)具體植物品種不同而調(diào)整其成分和比例。本實施實例采用FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、Na2HPO4.12H2O、Na—EDTA、KH2PO4、粗提蛋白、葡萄糖、MgSO4.7H2O、IAA或NAA、土壤浸出液濃度分別為4.0g/L、3.5g/L、1.0g/L、7.0g/L、2.0g/L、7.0g/L、20g/L、1.2g/L、0.1g/L、8滴/L。實施例4(N15藻類培養(yǎng)基的制備)與實施例1不同的是本實施例的步驟4)最終制作N15藻類培養(yǎng)基，具體步驟如下：1)使用只含N15(不含N14)的無機(jī)培養(yǎng)基對酵母菌進(jìn)行培養(yǎng)；此處可采用畢赤酵母x-33和基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(M9母液)；2)采用玻璃珠破碎法進(jìn)行酵母細(xì)胞的裂解；3)采用蛋白質(zhì)半水解法(酸解)進(jìn)行N15酵母蛋白的粗提；4)N15藻類培養(yǎng)基的配制：下面培養(yǎng)基的蛋白胨來自步驟3)中N15酵母蛋白的粗提。N15藻類培養(yǎng)基的配制：注：①FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、KH2PO4、MgSO4.7H2O配成高濃度的母液，滅菌后按量加入培養(yǎng)基中。②葡萄糖配成母液，滅菌后按量加入培養(yǎng)基中。③土壤浸出液含有鐵、錳、銅、鋅等藻類需要的微量元素，不含N元素。④可根據(jù)具體藻類特殊需要添加培養(yǎng)基成分，如藍(lán)藻需鉬，硅藻需硅。無機(jī)鹽種類可以根據(jù)具體藻類品種不同而調(diào)整其成分和比例。本實施實例采用FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、粗提蛋白、葡萄糖、MgSO4.7H2O、土壤浸出液濃度分別為3.0g/L、2.5g/L、2.0g/L、2.0g/L、5.0g/L、15.0g/L、0.6g/L、5滴/L。以上所述實施例只為本發(fā)明之較佳實施例，并非以此限制本發(fā)明的實施范圍，故凡依本發(fā)明之形狀、原理所作的變化，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3